基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)觀察電針對2型糖尿病小鼠血漿外泌體circRNA表達的影響

壽崟,虎力,徐平,張偉波,高原,馬宇航,張必萌

?

基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)觀察電針對2型糖尿病小鼠血漿外泌體circRNA表達的影響

壽崟1,2,虎力1,徐平1,張偉波1,高原1,馬宇航2,張必萌2

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203;2.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院,上海 200080)

基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù),研究電針對2型糖尿病小鼠血漿外泌體circRNA表達和信號通路的影響。將30只C57BL/6小鼠隨機分為正常組、模型組和電針組,每組10只。模型組和電針組均予以高脂飲食6周,之后注射鏈脲佐菌素。電針組自高脂飲食4周后開始接受電針治療。監(jiān)測各組小鼠空腹血糖的變化,采用超速離心法提取小鼠血漿外泌體,應(yīng)用RNA-seq技術(shù)對各組小鼠血漿外泌體circRNA進行轉(zhuǎn)錄組測序,并對測序結(jié)果進行基因差異表達、基因功能與信號通路富集分析。與正常組比較,模型組造模后小鼠空腹血糖顯著升高(＜0.01);與模型組比較,電針組治療后小鼠空腹血糖顯著降低(＜0.01)。RNA-seq結(jié)果顯示,造模后經(jīng)電針治療,共有165個circRNA的表達發(fā)生明顯變化,其中144個基因下調(diào),21個基因上調(diào)。電針對2型糖尿病小鼠的作用主要集中在調(diào)節(jié)多環(huán)節(jié)的代謝、細胞生長、器官發(fā)育有關(guān)的功能和通路上。電針后甲狀腺激素信號通路上的某些circRNA(MED13、MED13L、NCOA2、PIK3CB、SLC16A10)表達上調(diào),而某些circRNA(MED12L、PLCG2、PRKCA、TSC2)表達下調(diào)。2型糖尿病小鼠血漿外泌體circRNA表達譜發(fā)生變化,電針能通過引起代謝、細胞生長與發(fā)育等功能與通路發(fā)生變化而產(chǎn)生干預(yù)作用,尤其對甲狀腺激素信號通路的調(diào)節(jié)非常活躍。

針刺療法;糖尿病;電針;外泌體;circRNA;轉(zhuǎn)錄組測序;小鼠

糖尿病是一種由代謝系統(tǒng)紊亂引起的內(nèi)分泌疾病,其中,2型糖尿病患者占到95%以上,其主要表現(xiàn)為胰島素相對不足并伴隨有胰島素抵抗。糖尿病同時作為一種慢性糖代謝障礙的疾病,?？砂l(fā)生一些嚴(yán)重并發(fā)癥,對機體心腦血管、神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等均有嚴(yán)重的破壞,如糖尿病腎病、糖尿病眼病、心血管系統(tǒng)病變等,嚴(yán)重危害人類的生命與健康[1]。國際糖尿病聯(lián)盟估計2015年全球大約有4.15億糖尿病患者[2],若不采取措施,預(yù)計到2040年這一數(shù)字將增加到6.42億。由于糖尿病目前病因還未明確,發(fā)病機理復(fù)雜,尚無根治藥物。針灸療法在臨床上治療糖尿病及各種糖尿病并發(fā)癥中具有良好療效[3-4],但其作用機制尚不清楚。

外泌體是囊泡傳輸系統(tǒng)中的研究熱點,其是細胞通過胞吐作用分泌的膜性囊泡樣小體,直徑為30～100 nm,主要是由細胞內(nèi)多泡體與細胞膜融合并釋放到細胞外基質(zhì)中的膜囊泡,后者在電鏡下表現(xiàn)為脂質(zhì)雙層包裹的扁平球體,呈特征性的杯狀外形。外泌體可穩(wěn)定存在于細胞外液中。目前認為,幾乎所有的真核細胞,包括一些微生物都可以產(chǎn)生外泌體[5]。隨著對外泌體認識的加深,人們發(fā)現(xiàn)源自細胞多泡體的外泌體可以攜帶很多特定信息進行體內(nèi)長距離運輸,它們能轉(zhuǎn)移很多生物分子(如DNA片段、circRNA、mRNA、miRNA、功能蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等),從而達到細胞間信息傳遞的目的,而其本身的膜結(jié)構(gòu)還能表達多種抗原、抗體分子,從而參與多種生理、病理過程[6-7]。目前已有最新研究將外泌體引入糖尿病的研究領(lǐng)域以期為該領(lǐng)域帶來新的突破[8]。circRNA是一種新的明星分子,它以不同的大小和來源形成共價閉合環(huán),代表了動物中一類豐富、穩(wěn)定且廣泛存在的RNA分子。它在生物過程中具有重要的作用,如作為miRNA海綿(sponge)、RNA結(jié)合蛋白、mRNA“磁鐵”以指導(dǎo)蛋白質(zhì)翻譯[9]。

轉(zhuǎn)錄組測序(RNA sequencing, RNA-seq),是指利用二代高通量測序技術(shù)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進行測序,可全面、快速地對某一組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有RNA進行檢測分析[10]。利用RNA-seq對血漿外泌體內(nèi)的基因表達進行定量和定性研究,可揭示2型糖尿病的分子機制,為該病的預(yù)防和治療提供科學(xué)依據(jù),因此被譽為轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)展的革命性技術(shù)[11-12]。

本研究應(yīng)用RNA-seq技術(shù),研究電針對2型糖尿病小鼠血漿外泌體circRNA表達和信號通路的影響,為電針治療2型糖尿病小鼠的可能作用機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

30只雄性SPF級C57BL/6小鼠,體質(zhì)量為(18±2)g,由上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院動物實驗中心提供[實驗動物許可證號SCXK(滬)2003-0003]。所有實驗動物在相同標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境(GB14925-2001)下飼養(yǎng)與實驗,予以自然照明、飲水和飲食,室溫保持在(25±2)℃,濕度保持在(55±5)%,每日保持12 h的晝夜循環(huán)。所有動物先適應(yīng)性喂養(yǎng)l周,然后采用查隨機數(shù)字表法將小鼠分為正常組、模型組和電針組,每組10只。此外,所有實驗方法均經(jīng)上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院動物倫理委員會通過。

1.2 主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素(strepto zotocin, STZ,美國Sigma公司);檸檬酸及檸檬酸鈉(國藥集團上海試劑公司);基礎(chǔ)飼料(購于上海市第一人民醫(yī)院動物養(yǎng)殖中心);高脂飼料(購于中國上海福貝世亨生物醫(yī)藥有限公司,配方為酪蛋白22.8%,糊精17%,DL-甲硫氨酸0.2%,礦物質(zhì)4%,碳酸氫鈉10.5%,維生素1%,重酒酸膽堿0.2%,蔗糖17.5%,豆油2.5%,氫化椰子油33.35%,檸檬酸鉀0.4%)。

強生穩(wěn)豪血糖儀和血糖試紙(美國強生公司,批號4174080);電子天平(JA2003N,上海精密科學(xué)儀器有限公司);低頻脈沖治療儀(G6805-2,上海醫(yī)療器械高技術(shù)公司);一次性針灸針(0.22 mm×13 mm,北京中研太和醫(yī)療器械有限公司,批號222170617)。

1.3 造模方法

模型組和電針組小鼠用上述高脂飼料喂養(yǎng)6周后,于第6周最后一天稱取小鼠體質(zhì)量,按100 mg/kg的劑量注射濃度為1%的STZ-檸檬酸鈉(0.1 mol/L,pH值7.2)緩沖液,給藥結(jié)束后1周內(nèi),監(jiān)測隨機及空腹血糖,若隨機血糖≤16.8 mmol/L或空腹血糖≤11.1 mmol/L,則認定為造模不成功,進行二次給藥,按150 mg/kg的劑量注射STZ。

1.4 治療方法

電針組自高脂飲食4周后開始進行電針治療。取雙側(cè)足三里、脾俞穴。75%乙醇棉球常規(guī)消毒后,采用0.22 mm×13 mm毫針進行針刺,得氣后連接低頻脈沖治療儀,采用斷續(xù)波形,頻率為2 Hz,強度為1～3 mA,串長為30 s,每5 min遞增1次,持續(xù)15 min,以局部肌肉輕微抖動為度。隔日1次,每周3次,連續(xù)治療4周,共計12次。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 空腹血糖

各組分別于造模前、造模后及治療結(jié)束后檢測空腹血糖。小鼠禁食不斷水16 h后,用眼科剪剪去鼠尾尖端,擠壓出血,將血液注滿血糖儀試紙的測試孔,5 s后讀取血糖值并記錄。為防止感染,測試后第2天于鼠尾傷口處擦拭金霉素眼藥膏(中國新鄉(xiāng)華青藥業(yè)公司)。

1.5.2 血漿外泌體提取及鑒定

1.5.2.1 血漿外泌體的提取

用采血針和抗凝管(含EDTA)抽取小鼠全血后輕柔混勻,并于4℃條件下,1900 x離心10 min,小心取上清,3000 x離心15 min,吸取上清,凍存于﹣80℃后,500 x離心10 min,吸取上清,再次以20000 x離心20 min,吸取上清,100000 x離心70 min,用PBS緩沖液沖洗底部外泌體后,再次以100000 x離心70 min,此時沉淀在底部的團塊即為血漿外泌體。

1.5.2.2 血漿外泌體的鑒定

①Western blot檢測血漿外泌體標(biāo)記蛋白,取血漿外泌體蛋白用于BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,經(jīng)灌膠、電泳、轉(zhuǎn)印蛋白后,在孵育袋中加入TBST稀釋的一抗CD63(1:1000)、CD9(1:2000)和TSG101(1:3000),4℃孵育過夜,漂洗后二抗(1:2000)孵育2 h后,洗膜,感光、顯影、定影。②透射電鏡觀察外泌體形態(tài)特征,先行血漿外泌體樣品處理,選擇標(biāo)本的最佳濃度(1 mg/mL)放置到一個300目Formvar膜銅網(wǎng)中,紅外燈下固定30 min,用濾紙小心吸掉未粘附在銅網(wǎng)的樣品,然后放置在2.5%的戊二醛磷酸緩沖15 min,再用PBS和蒸餾水分別沖洗2遍后,使用磷鎢酸懸滴進行負染,上樣觀察。

1.5.2.3 血漿外泌體RNA提取

血漿外泌體收集完成后,加入1 mL的Trizol,吹打混勻后冰上靜置5 min;然后加入氯仿200mL,充分震蕩30 s后冰上靜置15 min分層;4℃,13500 x離心10 min;將上層的無色水樣層轉(zhuǎn)移至新的無酶離心管;加入與水樣層等體積的預(yù)冷的異丙醇,顛倒混勻后室溫靜置10 min;4℃,13500 x離心10 min;棄上清后加入體積分數(shù)75%的乙醇清洗2遍,棄上清,靜置15 min待乙醇揮發(fā);加入無酶水20mL,﹣80℃保存待用。使用NanoDrop ND-1000儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]測量每個樣品的RNA濃度。以O(shè)D260/OD280值作為RNA純度指標(biāo)。使用變性瓊脂糖凝膠電泳測量RNA完整性和gDNA污染。使用Agilent 2100 Bioanalyzer儀器檢測文庫質(zhì)量。

1.5.2.4 RNA文庫的制備及測序

使用Ribo-Zero rRNA Removal Kits(美國Illumina公司)移除總RNA中的rRNAs。使用TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit(美國Illumnia公司)預(yù)處理RNA,構(gòu)建測序文庫。使用BioAnalyzer 2100儀器(美國Agilent Technologies公司)進行文庫質(zhì)控和定量。根據(jù)Illumnia測序說明,將10 pM文庫變性為單鏈DNA分子,在Illumnia flowcell上捕獲,原位擴增為簇(cluster),并在Illumnia HiSeq測序儀上采用雙端模式(PE mode)進行150 cycle測序。文庫的構(gòu)建與測序由中國上海云序生物科技有限公司完成。

1.5.2.5 測序數(shù)據(jù)分析

經(jīng)過Illumnia HiSeq 4000測序儀測序,收獲雙端reads。使用cutadapt(v1.9.3)軟件[13]去接頭,去低質(zhì)量reads,獲得高質(zhì)量reads。使用STAR軟件[14]將高質(zhì)量reads比對到參考基因組/轉(zhuǎn)錄組上,使用DCC軟件進行circRNA檢測和鑒定[15]。使用circBase數(shù)據(jù)庫對所鑒定的環(huán)狀RNA進行注釋[16]。使用總比對reads數(shù)進行標(biāo)準(zhǔn)化,并進行差異環(huán)狀RNAs來源基因的GO和KEGG分析。

1.5.2.6 差異表達基因的qRT-PCR驗證

為了驗證RNA-seq的準(zhǔn)確性,隨機選擇10個差異表達基因進行qRT-PCR驗證,引物序列見表1。RNA提取完成后用Gene Amp PCR System 9700(Applied Biosystems)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA通過qPCR SYBR Green master Mix進行擴增,反應(yīng)體系為10mL,反應(yīng)程序具體為95℃,10 min;95℃,10 s;60℃,1 min;95℃, 15 s;60℃緩慢加熱至99℃(儀器自動進行-Ramp Rate為0.05℃/s);共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,通過 2-ΔΔCT法計算基因的相對表達水平。

表1 電針后小鼠血漿外泌體circRNA差異表達基因qRT-PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用重復(fù)測量資料方差分析;偏態(tài)分布資料用中位數(shù)()和四分位數(shù)間距(,)表示,組間比較用秩和檢驗。以＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

模型組和電針組造模后隨機血糖＞16.8 mmol/L有8只,空腹血糖＞11.1 mmol/L有1只,造模成功率為45.0%;對11只小鼠進行二次造模,結(jié)果所有小鼠隨機血糖＞16.8 mmol/L,造模成功率為100.0%;死亡率為0%。高脂喂養(yǎng)后,模型組和電針組小鼠體型發(fā)生變化,以中央型肥胖為主,且毛發(fā)變稀疏;在注射STZ后出現(xiàn)精神萎靡不振,活動明顯減少,皮毛干燥粗糙并稀疏,尿量增多,飲水量亦明顯增多。

2.2 各組不同時間點空腹血糖比較

經(jīng)非參數(shù)檢驗,模型組和電針組造模后空腹血糖與正常組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01),提示STZ給藥對小鼠胰島破壞影響比較大。經(jīng)方差分析,模型組和電針組治療后空腹血糖與正常組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01);且電針組治療后空腹血糖與模型組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01),提示電針組改善空腹血糖優(yōu)于模型組。詳見表2。

表2 各組不同時間點空腹血糖比較 [mmol/L,M(Q1,Q2)]

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

2.3 血漿外泌體的鑒定

采用Western blot檢測血漿外泌體標(biāo)記蛋白(見圖1),圖中CD9、TSG101和CD63均有明顯條帶,提示外泌體提取成功。

圖1 小鼠血漿外泌體標(biāo)記蛋白鑒定

樣本懸液經(jīng)磷鎢酸懸滴負染,在透射電鏡下(10～200×103倍)觀察血漿外泌體形態(tài)特征(見圖2),可見少量膜被囊泡,電子密度淺,直徑50～100 nm,部分囊泡中央凹陷,符合外泌體形態(tài)特征。

圖2 小鼠血漿外泌體電鏡下形態(tài)特征

2.4 Reads分析

經(jīng)過圖像識別和堿基識別后,從Illumina HiSeq測序儀上收獲原始reads。使用cutadapt軟件去接頭,去低質(zhì)量reads,獲得高質(zhì)量reads。使用STAR軟件將clean reads比對到小鼠參考基因組(UCSC MM10)上,并以Ensembl轉(zhuǎn)錄組(v75)gtf文件為指導(dǎo),使用DCC軟件進行circRNA檢測。測序產(chǎn)出數(shù)據(jù)質(zhì)量顯示,過濾后數(shù)據(jù)中的堿基數(shù)(clean reads)數(shù)據(jù)為5.5～6.5 G,錯誤率為0.01～0.02,Q30(堿基正確識別率為99.9%)＞80%,G、C堿基含量在正常范圍內(nèi)。本研究的3組樣品過濾后與參考基因組進行比對,比對到基因組上讀段數(shù)的比例均高于78%(一般高于70%),比對到多位置的讀段數(shù)比例均低于5%(一般低于10%),是后續(xù)分析內(nèi)容的基礎(chǔ)。與參考基因組比對的具體情況見表3。

2.5 circRNA差異表達基因篩選

與經(jīng)典轉(zhuǎn)錄本相比,circRNA以環(huán)狀剪接為主要特征。剪接reads的徹底鑒定促進了circRNA豐度的準(zhǔn)確評估。在此,研究者以比對到的剪接讀段(reads)數(shù)作為circRNA的表達水平。記錄了每個樣品中檢測到的circRNA的連接讀段(junction reads)數(shù)。使用edgeR默認的TMM方法,根據(jù)測序深度和變異程度對原始連接讀段數(shù)進行標(biāo)準(zhǔn)化,并進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化,得到logCPM值。利用標(biāo)準(zhǔn)化的讀段數(shù),計算兩個或兩組樣品間的差異表達circRNA。計算倍數(shù)變化(fold change)和P-value。以倍數(shù)變化≥2.0、P-value≤0.05作為差異circRNA的閾值。

本研究共篩選到165個差異表達基因。模型組與正常組相比,該基因上調(diào),而電針組該基因表達下調(diào)的基因為144個;模型組與正常組相比,該基因下調(diào),而電針組該基因表達上調(diào)的基因為21個。將表達水平變化模式相同或相近的基因聚集成類,分析差異基因在不同組間的表達模式(見圖3)。以上研究結(jié)果顯示,電針對2型糖尿病小鼠血漿外泌體circRNA轉(zhuǎn)錄組表達水平有明顯影響。

表3 RNA-seq測序參考序列比對情況

2.6 基因功能和信號通路富集分析

通過對模型組、電針組與正常組兩兩比較的基因功能富集分析,發(fā)現(xiàn)與電針作用有關(guān)的165個有差異的環(huán)狀RNA基因(＜0.05,假陽性率＜0.05),主要包括基礎(chǔ)代謝、細胞代謝、細胞大分子代謝、有機物質(zhì)代謝、細胞生長、發(fā)育等相關(guān)功能。在信號通路分析中,發(fā)現(xiàn)111條有差異的信號通路,其中表達上調(diào)的信號通路主要包括甲狀腺激素信號通路、鞘糖脂生物合成(神經(jīng)節(jié)系列)通路、環(huán)磷酸鳥苷-蛋白激酶G(cGMP- PKG)信號通路、癌癥轉(zhuǎn)錄誤調(diào)控通路、癌癥膽堿代謝通路、Rap1信號通路、肌動蛋白細胞骨架調(diào)控通路、腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)信號通路、脂肪細胞中脂細胞的調(diào)節(jié)通路等;表達下調(diào)的信號通路主要包括FcgR介導(dǎo)巨噬細胞吞噬作用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1信號通路、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)通路、癌癥膽堿代謝通路、賴氨酸降解通路、NOD樣受體信號通路、mTOR信號通路、磷酸肌醇代謝通路、癌癥蛋白聚糖通路等。前10位與電針調(diào)節(jié)2型糖尿病小鼠血漿外泌體circRNA基因功能和信號通路以及富集的基因見表4-7。

表4 電針后小鼠血漿外泌體circRNA差異表達基因的功能富集(表達上調(diào))

表5 電針后小鼠血漿外泌體circRNA差異表達基因的功能富集(表達下調(diào))

表6 電針后小鼠血漿外泌體circRNA差異表達基因的信號通路富集(表達上調(diào))

表7 電針后小鼠血漿外泌體circRNA差異表達基因的信號通路富集(表達下調(diào))

注:聚類分析圖中黑色表示高表達基因,灰色表示低表達基因

2.7 qRT-PCR驗證結(jié)果

對隨機選取的10個差異基因進行qRT-PCR驗證,結(jié)果顯示,差異基因的相對表達量與RNA-seq檢測結(jié)果趨勢一致,驗證了RNA-seq結(jié)果的可靠性。詳見圖4。

圖4 電針后小鼠血漿外泌體circRNA差異表達基因的qRT-PCR驗證

3 討論

眾所周知,胰島素抵抗和b細胞功能缺陷是2型糖尿病的主要發(fā)病機制。近年來,實驗研究表明,針灸可通過調(diào)整胰島素抵抗、改善胰島b細胞功能來治療2型糖尿病。在動物實驗中,針灸選穴絕大多數(shù)以足三里、脾俞、胃脘下俞、中脘等穴位為主[17-18]。本實驗結(jié)果表明,造模成功后,小鼠空腹血糖明顯升高,而治療組治療后空腹血糖相較模型組顯著降低。說明電針對降低2型糖尿病小鼠空腹血糖具有一定的治療作用,同前人的研究結(jié)果一致[18-20]。

RNA-seq結(jié)果顯示,電針后共有165個circRNA表達有差異。通過對差異基因的功能和信號通路分析發(fā)現(xiàn),電針對2型糖尿病小鼠的作用主要集中在調(diào)節(jié)多方面的代謝、細胞生長、器官發(fā)育有關(guān)的功能和通路上。其中表達上調(diào)的信號通路主要包括甲狀腺激素信號通路、鞘糖脂生物合成(神經(jīng)節(jié)系列)通路、cGMP-PKG信號通路、癌癥轉(zhuǎn)錄誤調(diào)控通路、癌癥膽堿代謝通路、Rap1信號通路、肌動蛋白細胞骨架調(diào)控通路、AMPK信號通路、脂肪細胞中脂細胞的調(diào)節(jié)通路等;表達下調(diào)的信號通路主要包括FcgR介導(dǎo)巨噬細胞吞噬作用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1信號通路、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)通路、癌癥膽堿代謝通路、賴氨酸降解通路、NOD樣受體信號通路、mTOR信號通路、磷酸肌醇(IP)代謝通路、癌癥蛋白聚糖通路等。這些研究結(jié)果表明,電針對2型糖尿病的作用具有多環(huán)節(jié)、多層次、多水平的特點,調(diào)節(jié)血糖可能只是其中一個很小的方面,電針對于2型糖尿病還具有其他治療作用,有待于進一步發(fā)掘。

有趣的是,在這些通路中,筆者發(fā)現(xiàn)甲狀腺激素信號通路在電針對2型糖尿病的作用中表現(xiàn)十分活躍,既有表達上調(diào)的基因(MED13、MED13L、NCOA2、PIK3CB、SLC16A10),又有表達下調(diào)的基因(MED12L、PLCG2、PRKCA、TSC2)。這一結(jié)果表明,電針對甲狀腺激素信號通路的調(diào)節(jié)非常顯著。事實上,已有研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺功能亢進和甲狀腺功能減退與2型糖尿病發(fā)生機制中的胰島素抵抗存在著一定關(guān)聯(lián)[21]。甲狀腺激素具有較強的抗脂肪降解作用,故引起游離脂肪酸濃度升高,進而增強了葡萄糖的儲存和氧化作用,且影響了胰島素的分泌作用,阻礙了葡萄糖的糖代謝作用[22-23]。因此,本研究提示電針對2型糖尿病的作用可能通過對甲狀腺激素的調(diào)節(jié)進而改善胰島素抵抗從而產(chǎn)生對慢性高血糖的調(diào)節(jié)作用,這一推測有待通過進一步實驗來證實。

通過本研究發(fā)現(xiàn),造模后2型糖尿病小鼠血漿外泌體circRNA表達譜發(fā)生變化,電針能通過引起多環(huán)節(jié)的代謝、細胞生長與發(fā)育等功能與通路發(fā)生變化而產(chǎn)生干預(yù)作用。并且,電針對甲狀腺激素信號通路的調(diào)節(jié)非?；钴S。本研究既為電針作用機制的闡明提供新的研究切入點,又同時為尋找2型糖尿病的治療新靶點提供參考。

[1] Bahartan K, Horman K, Gal A,. Assessing the Performance of a Noninvasive Glucose Monitor in People with Type 2 Diabetes with Different Demographic Profiles[J]., 2017:4393497.

[2] Ogurtsova K, da Rocha Fernandes JD, Huang Y,. IDF Diabetes Atlas: Global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and 2040[J]., 2017,128:40-50.

[3] 馬國慶,葉婷,孫忠人.溫針灸與常規(guī)針刺治療陽虛寒凝、絡(luò)脈瘀阻型糖尿病周圍神經(jīng)病變對比觀察[J].中國針灸,2018,38(3):229-233.

[4] 王俊寶.針灸聯(lián)合甲鈷胺治療糖尿病性周圍神經(jīng)病變的臨床效果觀察[J].臨床合理用藥,2018,11(2):28- 29.

[5] 貝毅樺,喻溥蛟,肖俊杰.小囊泡中的大學(xué)問——外泌體的前世今生[J].自然雜志,2017,39(3):191-200.

[6] van Niel G, D’Angelo G, Raposo,G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles[J]., 2018,19(4):213-228.

[7] Trotta T, Panaro MA, Cianciulli A,. Microglia- derived extracellular vesicles in Alzheimer's Disease: A double-edged sword[J]., 2018,148: 184-192.

[8] Tao SC, Rui BY, Wang QY,. Extracellular vesicle- mimetic nanovesicles transport LncRNA-H19 as competing endogenous RNA for the treatment of diabetic wounds[J]., 2018,25(1):241-255.

[9] Xu T, Wu J, Han P,. Circular RNA expression profiles and features in human tissues: a study using RNA-seq data[J]., 2017,18(Suppl 6): 680.

[10] 曹萌,孫鳳梅,尹立紅,等.苯對C3H/He小鼠骨髓細胞轉(zhuǎn)錄組表達的影響:基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué),2017,34(7):577-585.

[11] Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics[J]., 2009,10(1):57-63.

[12] Wu C, Bendriem RM, Garamszegi SP,. RNA sequencing in post-mortem human brains of neuropsychiatric disorders[J]., 2017,71(10):663-672.

[13] Ly P, Teitz LS, Kim DH,. Selective Y centromere inactivation triggers chromosome shattering in micronuclei and repair by non-homologous end joining[J]., 2017,19(1):68-75.

[14] Dobin A, Davis CA, Schlesinger F,. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner[J]., 2013,29 (1):15-21.

[15] Jakobi T, Czaja-Hasse LF, Reinhardt R,. Profiling and Validation of the Circular RNA Repertoire in Adult Murine Hearts[J]., 2016,14(4):216-223.

[16] Ma HB, Yao YN, Yu JJ,. Extensive profiling of circular RNAs and the potential regulatory role of circRNA-000284 in cell proliferation and invasion of cervical cancer via sponging miR-506[J]., 2018,10(2):592-604.

[17] Peplow PV, Baxter GD. Electroacupuncture for control of blood glucose in diabetes: literature review[J]., 2012,5(1):1-10.

[18] Cornejo-Garrido J, Becerril-Chávez F, Carlín-Vargas G,. Antihyperglycaemic effect of laser acupuncture treatment at BL20 in diabetic rats[J]., 2014,32(6):486-494.

[19] Jiang YL, Ning Y, Liu YY,. Effects of preventive acupuncture on streptozotocin-induced hyperglycemia in rats[J]., 2011,34(10):e355-361.

[20] Cao BY, Li R, Tian HH,. PI3K-GLUT4 Signal Pathway Associated with Effects of EX-B3 Electro- acupuncture on Hyperglycemia and Insulin Resistance of T2DM Rats[J]., 2016:7914387.

[21] Maratou E, Hadjidakis DJ, Kollias A,. Studies of insulin resistance in patients with clinical and subclinical hypothyroidism[J]., 2009,160(5): 785-790.

[22] van Tienhoven-Wind LJ, Dallinga-Thie GM, Dullaart RP. Higher Plasma ApoE Levels are Associated with Low-Normal Thyroid Function: Studies in Diabetic and Nondiabetic Subjects[J]., 2016,48(7): 462-467.

[23] Prats-Puig A, Sitjar C, Ribot R,. Relative hypoadiponectinemia, insulin resistance, and increased visceral fat in euthyroid prepubertal girls with low-normal serum free thyroxine[J].(), 2012,20(7):1455-1461.

Effect of Electroacupuncture on CircRNA Expression in Plasma Exocrine in Type 2 Diabetic Mice Based on Transcriptome Sequencing Technology

1,2,1,1,-1,1,-2,-2.

1.,201203,; 2.,,200080,

To study the effect of electroacupuncture on the expression of circular RNA (circRNA) in plasma exocrine and its signal pathway in type 2 diabetic mice based on transcriptome sequencing technology.Thirty C57BL/6 mice were randomized to normal, model and electroacupuncture groups, with 40 mice in each group. The model and electroacupuncture group received the injection of streptozocin (STZ) after a high-fat diet (HFD) feeding for 6 weeks, and the electroacupuncture group started electroacupuncture additionally after a HFD feeding for 4 weeks. Fasting blood glucose (FBG) in each group was detected. The plasma exosome was extracted by ultracentrifugation. The circRNA in plasma exosome was sequenced by RNA sequencing (RNA-seq) technology. Differential gene expression, gene function and signal pathway cluster were analyzed.Compared to the normal group, the FBG increased significantly after modeling in the model group (＜0.01); compared to the model group, the FBG declined after the treatment in the electroacupuncture group (＜0.01). RNA-seq results showed that a total of 165 circRNA expressions changed significantly after the treatment, 144 genes were down-regulated and 21 genes were up-regulated. The effect of electroacupuncture on type 2 diabetic mice mainly focused on the regulation of the functions and pathways related to multi-link metabolism, cell growth and organ development. Some circRNA expression (MED13, MED13L, NCOA2, PIK3CB and SLC16A10) in thyroid hormone signaling pathway was up-regulated after electroacupuncture, and some circRNA expression (MED12L, PLCG2, PRKCA and TSC2) were down-regulated.The circRNA expression profile changes in plasma exosome of type 2 diabetic mice. Electroacupuncture can interfere by regulating the functions and pathways related to metabolism, cell growth and development, and the regulation of thyroid hormone signaling pathway is very active.

Acupuncture therapy; Diabetes; Electroacupuncture; Plasma exocrine; Circular RNA;Transcriptome sequencing; Mice

1005-0957(2019)05-0565-09

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2019.05.0565

2018-12-03

國家自然科學(xué)基金面上項目(81373755);國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(81403470,81600611);上海市科學(xué)技術(shù)委員會科研計劃中醫(yī)引導(dǎo)類項目(17401932200);上海市第一人民醫(yī)院院級課題(11B10)

壽崟(1984—),女,講師,2016級博士生,Email:33359879@qq.com

徐平(1952—),女,教授,博士生導(dǎo)師,Email:xp99@163.com