卵巢癌組織HMGN5基因表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系分析

張 潔 張培先 龍 軼 王 以

昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院（650051）

卵巢癌是女性最常見的三大惡性腫瘤之一，由于缺乏有效的早期診斷方法，超過50%的卵巢癌患者確診時(shí)已為腫瘤晚期，多數(shù)伴隨遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。國(guó)內(nèi)外臨床資料表明，卵巢癌患者五年生存率低于50%，且復(fù)發(fā)率非常高（80%）［1－3］。卵巢癌病因目前尚不十分清楚，其發(fā)病可能與年齡、生育、血型、精神，環(huán)境及遺傳等因素有關(guān)。本研究分析HMGN5基因在卵巢癌中的表達(dá)變化及與患者臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究資料

收集2008年1月－2012年12月本院手術(shù)切除的卵巢癌標(biāo)本120例，年齡（50.8±10.5）歲（20～81歲）；患者均經(jīng)過病理、影像和臨床診斷為原發(fā)性卵巢癌。根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)分型方法進(jìn)行組織學(xué)分型：漿液性腺癌68例，黏液性腺癌30例，其他類22例。按WHO標(biāo)準(zhǔn)TNM分期進(jìn)行臨床分期：I期21例，II期47例，III期49例和IV期3例。按解剖位置分為左側(cè)卵巢癌38例，右側(cè)卵巢癌55例和雙側(cè)卵巢癌27例。所有患者在手術(shù)前均未進(jìn)行過化療和放療。卵巢癌患者平均隨訪5.2年，最長(zhǎng)8.3年，死亡29例，存活50例，生存信息不祥41例。選取癌旁正常組織35例作為對(duì)照。

1.2 標(biāo)本處理

①冷凍標(biāo)本：手術(shù)后將腫瘤或癌旁卵巢組織（距離至少1cm）編號(hào)放入凍存管迅速置于液氮中速凍，?80℃冰箱保存，用于測(cè)定基因mRNA表達(dá)。②石蠟樣本：手術(shù)后將腫瘤或癌旁卵巢組織放入福爾馬林固定24h，沖洗后進(jìn)行梯度酒精脫水，二甲苯透明，最后浸入石蠟包埋，用于測(cè)定基因蛋白表達(dá)。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR

采用液氮研磨和Trizol法提取標(biāo)本組織總RNA，測(cè)定OD260／OD280值。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒取5μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后儲(chǔ)存待用。實(shí)時(shí)定量PCR使用SYBR Premix Ex Taq II和CFX熒光定量?jī)x器（Bio-RadLaboratories）檢測(cè)，結(jié)果分析使用2-ΔΔCT計(jì)算。HMGN5和-actin基因的引物如下：HMGN5－Forward：5＇－TAC AAC AAT GCC CAA AAG AAA GGC T－3＇，HMGN5Reverse：5＇－TGT AAC TGG CAC AAG CAT AGC AGA－3＇；-actin Forward：5＇－CCA CGA AAC TAC CTT CAA CTC C－3＇，-actin Reverse：5＇－GTG ATC TCC TTC TGC ATC CTG T－3＇。

1.4 免疫組化

HMGN5抗體購(gòu)于Abbexa公司。免疫組化操作參考文獻(xiàn)［4］。一抗按1：100稀釋，通過細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行免疫組化結(jié)果定性分析，染色強(qiáng)度≤10%為陰性，＞10%為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，HMGN5基因的mRNA表達(dá)水平用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本組織中HMGN5的mRNA表達(dá)

35例卵巢癌組織、21例癌旁組織進(jìn)行了定量PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，HMGN5的mRNA在卵巢癌旁組織中表達(dá)（1.250±0.1980）低于卵巢癌組織水平（4.589±0.2606）（P＜0.0001）。

2.2 標(biāo)本組織中HMGN5蛋白表達(dá)

120例卵巢癌組織、35例癌旁組織進(jìn)行了免疫組化分析，HMGN5表達(dá)陽(yáng)性在癌旁組織標(biāo)本中有5例，陽(yáng)性表達(dá)率14.3%；在卵巢癌組織標(biāo)本有88例，陽(yáng)性表達(dá)率73.3%。兩組陽(yáng)性率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。染色結(jié)果見圖1。

2.3 卵巢癌患者臨床病理特征與HMGN5表達(dá)相關(guān)性分析

統(tǒng)計(jì)分析顯示，卵巢癌患者HMGN5蛋白表達(dá)與其腫瘤大小、TNM分期和生存狀態(tài)密切相關(guān)（P＜0.05）；與患者年齡、腫瘤位置、病理分級(jí)和組織學(xué)類型等未見有關(guān)（P＞0.05），見表1。

表1 不同臨床特征卵巢癌患者HMGN5蛋白表達(dá)比較［例（%）］

3 討論

卵巢癌是一種發(fā)病率高但非常隱蔽的婦科惡性腫瘤，早期表現(xiàn)不明顯、篩查難以發(fā)現(xiàn)異常，許多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為腫瘤晚期并出現(xiàn)了大面積轉(zhuǎn)移，而且在后期化療治療過程中易產(chǎn)生耐藥，卵巢癌死亡率高居女性腫瘤前列［5－6］。目前治療卵巢癌的手段主要是采用外科手術(shù)切除和綜合化療的方式。然而，由于大多數(shù)卵巢癌患者化療后都會(huì)產(chǎn)生不同程度抵抗，使卵巢癌患者的5年生存率非常低［5］。因此，急需針對(duì)不同患者耐藥程度制定個(gè)性化治療方案，從而提高患者的生存時(shí)間和生活質(zhì)量。

已有研究表明，HMGN5基因在多種人類腫瘤中表達(dá)明顯上調(diào)。在前列腺癌體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表明，降低HMGN5基因表達(dá)能夠顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖能力［7］；在膀胱癌中HMGN5基因能明顯促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和侵襲能力［8－9］；在腎癌體內(nèi)外研究顯示，HMGN5基因表達(dá)降低能夠抑制透明腎細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲能力［10］；在肺癌中干擾HMGN5基因表達(dá)會(huì)顯著導(dǎo)致肺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯［11］；在乳腺癌中HMGN5基因表達(dá)明顯上調(diào)，且能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力［12］；在骨肉瘤中HMGN5基因表達(dá)與臨床分期關(guān)系密切，抑制HMGN5表達(dá)能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞侵襲和增加阿霉素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性［13］；在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中干擾HMGN5表達(dá)致使腫瘤細(xì)胞周期阻滯到G1期、細(xì)胞增殖延緩，并出現(xiàn)更多的凋亡細(xì)胞［14］。然而，HMGN5基因在卵巢癌中的表達(dá)和作用目前并不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，HMGN5在卵巢癌組織的表達(dá)量明顯高于癌旁組織，且卵巢癌樣本中蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于卵巢癌旁組織，這些結(jié)果提示HMGN5很可能參與了卵巢癌的發(fā)病進(jìn)程，而且很可能是一個(gè)癌基因。

腫瘤大小和TNM臨床分期在一定程度上反映了腫瘤最基本的生物學(xué)特征。本文進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，HMGN5蛋白陽(yáng)性表達(dá)與卵巢腫瘤大小和臨床分期密切相關(guān)，推斷HMGN5表達(dá)上調(diào)與腫瘤進(jìn)展和惡性程度關(guān)系密切。由于腫瘤進(jìn)展和惡性程度影響卵巢癌患者的預(yù)后，推測(cè)HMGN5的陽(yáng)性表達(dá)可能與患者生存時(shí)間有關(guān)。通過深入分析也發(fā)現(xiàn)了密切關(guān)系。這些結(jié)果表明，HMGN5可能在卵巢癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要功能，并可能成為評(píng)估卵巢癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

卵巢癌化療后出現(xiàn)明顯的化療抵抗是患者死亡率高的重要原因。最近有研究發(fā)現(xiàn)，HMGN5基因表達(dá)能夠明顯影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性［15－17］。提示 HMGN5基因陽(yáng)性表達(dá)與患者不良預(yù)后呈正相關(guān)關(guān)系，可能與腫瘤細(xì)胞化療敏感性密切關(guān)聯(lián)，但這一結(jié)論還需深入研究予以證明。

綜上所述，HMGN5基因參與了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，是一個(gè)潛在檢測(cè)標(biāo)志物，可能作為腫瘤治療靶標(biāo)和患者預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。