硫酸鈣對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化和遷移的影響

劉佳 周剛 陳丹娜 黃春霞*

1. 長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410219 2. 中南大學(xué)生命科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013

硫酸鈣(calcium sulfate, CaSO4)是使用歷史悠久且簡(jiǎn)單的骨移植材料之一，已使用超過(guò)100年[1]，可應(yīng)用于口腔外科[2]、顱面外科[3]、骨科手術(shù)[4]，效果確定?？茖W(xué)界對(duì)于CaSO4利于骨再生主要有幾種解釋，CaSO4等鈣化合物材料在被植入后降解時(shí)，創(chuàng)造了富含鈣的環(huán)境，其所誘導(dǎo)的生物反應(yīng)與骨重塑過(guò)程中產(chǎn)生的生物反應(yīng)相似[5]。Walsh等[6]認(rèn)為，在CaSO4吸收過(guò)程中產(chǎn)生的pH值降低會(huì)導(dǎo)致相鄰骨釋放骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)。此外也有課題組[1]提出，在CaSO4治療的部位增加了血管生成。目前，CaSO4成骨效應(yīng)的細(xì)胞機(jī)制和分子機(jī)制仍不十分清楚。

前期，筆者將間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)接種在脫蛋白骨支架上，對(duì)大鼠的臨界大小骨缺損模型進(jìn)行修補(bǔ)[7]。筆者注意到，當(dāng)沒(méi)有接種MSCs的脫蛋白骨支架作為對(duì)照組植入到骨缺損時(shí)，組織學(xué)切片可以觀察到豐富的宿主細(xì)胞進(jìn)入支架。脫蛋白骨中起主要作用的成分是鈣。因此，本研究的目的是利用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方式，探討CaSO4對(duì)MSCs成骨分化和遷移能力的直接作用，推測(cè)其中的聯(lián)系，探索構(gòu)建臨床實(shí)用的無(wú)細(xì)胞骨移植簡(jiǎn)易支架的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： SPF級(jí)KM小鼠，雌性，6～8周，體重(28±2) g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院科研中心標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物室飼養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器： 顯微鏡(奧林巴斯公司)；qRT-PCR分析(Thermo Fisher公司)在湘雅醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)院進(jìn)行。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑： TRIzol(Invitrogen公司)；高效反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taqman探針(Applied Biosystems公司)；CaSO4粉末、明膠(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 含CaSO4明膠預(yù)先包被細(xì)胞培養(yǎng)板：CaSO4按照0.1、0.8、1.5 g/L濃度溶于0.1%明膠/PBS中，設(shè)為高、中、低濃度組，經(jīng)70 μm孔徑的濾器過(guò)濾，包被培養(yǎng)板的孔。不含CaSO4的0.1%明膠/PBS溶液包被培養(yǎng)板為對(duì)照組。經(jīng)過(guò)處理的培養(yǎng)皿在4 ℃保存。

1.2.2 MSCs的分離和培養(yǎng)：小鼠實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理?xiàng)l例進(jìn)行。將小鼠麻醉后，以快速頸椎脫臼法處死，取出脛骨和股骨。剪去兩側(cè)關(guān)節(jié)頭，用培養(yǎng)基將細(xì)胞沖出，用DMEM(含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺和雙抗)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。3 d后，更換培基，去掉未貼壁的細(xì)胞。當(dāng)附著的細(xì)胞匯合到80%時(shí)，經(jīng)胰蛋白酶消化后傳代，2～4代細(xì)胞被用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行酶消化后，以6×104/mL的細(xì)胞密度接種于已經(jīng)包被有高、中、低濃度CaSO4/明膠的24孔板和對(duì)照組24孔板，均置6個(gè)平行孔培養(yǎng)細(xì)胞。用臺(tái)盼藍(lán)拒染法，每天計(jì)存活細(xì)胞數(shù)，共計(jì)10 d，據(jù)所獲平均拒染活細(xì)胞數(shù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 qRT-PCR分析：MSCs在含有高、中、低濃度CaSO4環(huán)境中培養(yǎng)1、4、7、10 d后收集細(xì)胞，用TRIzol法制備總RNA，用分光光度法進(jìn)行RNA定量分析。按照高效反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)純化的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，每個(gè)RT-PCR擴(kuò)增體系使用50 ng的cDNA，每個(gè)樣品重復(fù)2次。使用Osterix因子和骨鈣素(Osteocalcin)作為探針、GAPDH 作為內(nèi)參對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行定量分析。相對(duì)定量數(shù)據(jù)fold induction以標(biāo)準(zhǔn)化單位表示。

1.2.5 刮痕合攏實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移：按照參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。在明膠/CaSO4包被的12孔板中接種1 mL密度為6×104/mL MSCs，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合。然后，融合的細(xì)胞被最小平頭tip頭(0.1～10 μL)刮出痕跡，用培養(yǎng)基輕柔清洗，袪除脫落的細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用奧林巴斯顯微鏡拍攝細(xì)胞遷移后，利用ImageJ軟件分析劃痕合攏程度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.6 瓊脂糖斑法分析細(xì)胞遷移：按照參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。低熔點(diǎn)瓊脂糖溶于PBS，制成1%瓊脂糖溶液，然后高溫。為制備瓊脂糖斑點(diǎn)，在1.5 mL的Eppendorf試管中加入100 μL融化的1%瓊脂糖溶液，再混合100 μL PBS或0.2、1.6、3 g/L 的CaSO4溶液，實(shí)驗(yàn)組終濃度為0.1、0.8、1.5 g/L。細(xì)胞培養(yǎng)6孔板上點(diǎn)兩個(gè)2 μL的斑點(diǎn)，一個(gè)含CaSO4，一個(gè)則不含，4 ℃凝固10 min。MSCs進(jìn)行胰蛋白酶消化后，取6×105個(gè)細(xì)胞均勻接種在含有斑點(diǎn)的培養(yǎng)皿中。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛固定，在顯微鏡下拍照，利用ImageJ軟件分析斑點(diǎn)區(qū)被侵襲的程度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 10.0軟件進(jìn)行計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)，多組比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CaSO4對(duì)MSCs生長(zhǎng)曲線的影響

以活細(xì)胞數(shù)均值繪制的生長(zhǎng)曲線顯示，各組均在第6～7天進(jìn)入平臺(tái)期，CaSO4中、低濃度組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和對(duì)照組相似，MSCs增殖未受到CaSO4影響。反倒是高濃度CaSO4組細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制，3～10 d活細(xì)胞遠(yuǎn)低于其他組，生長(zhǎng)曲線平緩，見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度CaSO4對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of CaSO4at different concentrations on cell growth

2.2 CaSO4對(duì)成骨基因表達(dá)的影響

在不同CaSO4濃度作用于細(xì)胞1、4、7、10 d后，筆者通過(guò)定量RT-PCR測(cè)定了各組Osterix因子和骨鈣素表達(dá)。如圖2 A、圖2B所示，中濃度0.8 g/L的CaSO4在1 d內(nèi)降低了Osterix的表達(dá)，而骨鈣素的表達(dá)量在1～4 d內(nèi)均略降低，Osterix因子和骨鈣素的mRNA的表達(dá)從第4～10天逐漸增加。這些結(jié)果表明，CaSO4對(duì)MSCs分化成骨細(xì)胞產(chǎn)生了雙重作用。1～4 d內(nèi)，CaSO4對(duì)成骨基因的表達(dá)有輕度的抑制作用，第4天是個(gè)分水嶺，4 d后漸進(jìn)性上調(diào)Osterix因子和骨鈣素等成骨基因的表達(dá)。而高濃度1.5 g/L的CaSO4自始至終都在降低Osterix和骨鈣素的表達(dá)，提示高濃度的CaSO4抑制MSCs分化成骨細(xì)胞。低濃度0.1 g/L的CaSO4對(duì)成骨基因的表達(dá)影響不明顯。

圖2 不同濃度CaSO4對(duì)Osterix因子和骨鈣素表達(dá)的影響(與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01)Fig.2 Effects of CaSO4 at different concentrations on Osterix factor and osteocalcin expression(compared with the control group,*P<0.05，**P<0.01)

2.3 CaSO4誘導(dǎo)MSCs遷移

為了評(píng)估MSCs的遷移，筆者使用刮痕合攏實(shí)驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)在不同CaSO4濃度的影響下，令細(xì)胞遷移48 h后的情況。筆者觀察到CaSO4對(duì)MSCs遷移的影響與濃度密切相關(guān)。與對(duì)照組相比，0.8 g/L濃度下的細(xì)胞遷移最活躍(圖3B)，遷移后合攏面積達(dá)到了(81.1±3.5)%。而暴露于劑量高達(dá)1.5 g/L的高濃度組細(xì)胞遷移幅度小，合攏面積為(24.6±5.1)%，細(xì)胞本身的生長(zhǎng)增殖狀態(tài)也較差，細(xì)胞稀疏而且胞質(zhì)中顆粒多(圖3 A)。低濃度組細(xì)胞的合攏面積為(49.8±4.4)%，遷移程度比對(duì)照組[(36.2±2.6)%]稍大(圖3C、圖3D)。

為了證實(shí)CaSO4對(duì)MSCs遷移的影響，繼續(xù)進(jìn)行了瓊脂糖斑點(diǎn)試驗(yàn)。在CaSO4中濃度時(shí)，觀察到細(xì)胞遷移程度更大，侵襲面積更大[(91.4±6.1)%]；CaSO4高濃度時(shí)，MSCs的遷移幅度小，侵襲面積[(18.8±10.4)%]甚至遠(yuǎn)不及對(duì)照組[(50.5±8.0)%]和低濃度組[(59.7±9.4)%]。這些結(jié)果表明，體外CaSO4誘導(dǎo)的MSCs遷移與濃度依賴性相關(guān)，0.8 g/L可以有效的促進(jìn)遷移。

3 討論

圖3 刮痕合攏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CaSO4對(duì)MSCs的遷移能力的影響(每組上圖為遷移前，下圖為遷移后)Fig.3 Effects of CaSO4on the migration capacity of MSCs detected by wound healing assay (The images above are before the migration, and the images below are after the migration)

圖4 斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CaSO4對(duì)MSCs的遷移能力的影響Fig.4 Effects of CaSO4on the migration capacity of MSCs detected by agarose spot experiment

復(fù)雜化的社會(huì)生活帶來(lái)了多樣化的危險(xiǎn)，也帶了醫(yī)療新挑戰(zhàn)，例如高速交通工具事故可能帶來(lái)的多發(fā)性復(fù)雜骨損傷。骨損傷發(fā)生后，成骨誘導(dǎo)開(kāi)始啟動(dòng)。成骨誘導(dǎo)是指內(nèi)源或者外源的多能干細(xì)胞(主要是MSCs)受到外在因素的調(diào)節(jié)，分化形成成骨細(xì)胞等骨祖細(xì)胞的過(guò)程，是細(xì)胞水平和分子水平的多階段級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括細(xì)胞的趨化移動(dòng)以及幾輪的細(xì)胞增殖和分化。在重塑骨過(guò)程中，骨基質(zhì)中常有大量的信號(hào)分子，這些可溶性信號(hào)形成的化學(xué)梯度創(chuàng)造了一個(gè)成骨誘導(dǎo)的微環(huán)境，促進(jìn)骨祖細(xì)胞遷移進(jìn)入骨再生區(qū)域。有研究[10]表明，BMP-2、BMP-4、PDGF及TGF-β等因子對(duì)MSCs遷移有促進(jìn)作用。而B(niǎo)MP靶基因包括成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子如Osterix、Runx2[11]、Dlx3/5和 Smad 蛋白家族[12]，均對(duì)成骨細(xì)胞的分化和遷移至關(guān)重要[13]，也和骨質(zhì)疏松癥等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。MSCs遷移是個(gè)復(fù)雜的多因素調(diào)控過(guò)程，對(duì)遷移有促進(jìn)作用的因子還不止這些，鈣可能也是一個(gè)因素。

在前期實(shí)驗(yàn)中，筆者將脫蛋白骨植入后，其中釋放的鈣可能成為基質(zhì)趨化因子，引起MSCs定向遷移，因此才能在沒(méi)有附著細(xì)胞的脫蛋白骨支架上看到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自身少量細(xì)胞遷移進(jìn)去的現(xiàn)象[7]。因此，假設(shè)CaSO4可以作為一個(gè)引導(dǎo)信號(hào)，誘導(dǎo)正在成骨分化的細(xì)胞移動(dòng)。CaSO4是微溶的，即使到飽和溶液，其離子濃度也不大，容易因吸收而變化。為此，此次實(shí)驗(yàn)利用明膠作為鈣結(jié)合劑，提供一個(gè)鈣持續(xù)釋放的穩(wěn)定環(huán)境。

實(shí)驗(yàn)中，筆者首先評(píng)估了CaSO4對(duì)MSCs增殖和分化的影響。中低濃度的CaSO4對(duì)MSCs增殖沒(méi)有明顯的影響，但是中濃度的CaSO4對(duì)MSCs分化產(chǎn)生了兩相效應(yīng)，開(kāi)始時(shí)短暫抑制分化，CaSO4在1 d內(nèi)降低了Osterix的表達(dá)，而骨鈣素的表達(dá)量在1～4 d內(nèi)均輕度降低；隨后是成骨基因表達(dá)的逐步增加，經(jīng)過(guò)4～10 d的培養(yǎng)后Osterix和骨鈣素均增加，提示CaSO4促進(jìn)了MSCs成骨分化。之后的細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明CaSO4有能力激發(fā)MSCs遷移，而且CaSO4濃度為0.8 g/L時(shí)效果最佳。另外筆者還觀察到，高濃度的CaSO4干擾了MSCs遷移。這和另外一個(gè)現(xiàn)象相印證，在受傷或炎癥部位的細(xì)胞外液中含有高濃度的鈣，不利于成骨分化和遷移，反而容易引起細(xì)胞凋亡[14]。

本研究結(jié)果表明，中濃度的CaSO4可以誘導(dǎo)MSCs成骨相關(guān)基因表達(dá)，可能促進(jìn)干細(xì)胞的成骨分化，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞遷移，強(qiáng)化祖細(xì)胞的招募，有利于完成對(duì)骨損傷區(qū)的修復(fù)。CaSO4支架有望成為無(wú)細(xì)胞的骨修復(fù)簡(jiǎn)易支架。而未開(kāi)啟成骨分化的MSCs的遷移顯著低于分化細(xì)胞，可能因?yàn)閷?duì)趨化因子的反應(yīng)較低。Gonzalez課題組的研究[15]也表明，在以鈣為主的生物材料或培養(yǎng)基中存在額外的鈣離子，會(huì)使MSCs增強(qiáng)成骨基因表達(dá)和成骨細(xì)胞分化，與本研究結(jié)果一致。