蛛網(wǎng)萼未成熟種子培養(yǎng)與離體繁殖

曹麗雯，支肖，戴嘉禾，于寧寧，陳怡倩，葉立新，陳利萍*，徐禮根*

（1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院園藝系，杭州 310058；2.浙江鳳陽(yáng)山-百山祖國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)鳳陽(yáng)山管理處，浙江 麗水 323700）

蛛網(wǎng)萼（Platycrater arguta）屬于繡球花科（Hydrangeaceae）蛛網(wǎng)萼屬（Platycrater）小型落葉灌木[1]，喜生于溪澗邊和陰濕裸巖旁[2]。其植株常呈叢生狀態(tài)，花瓣4枚，花色純白，具有極高的觀賞價(jià)值。同時(shí)，蛛網(wǎng)萼作為東亞特有的單種屬植物，對(duì)研究東亞植物地理、植物區(qū)具有深遠(yuǎn)的科學(xué)價(jià)值[3-4]。近年來(lái)，由于生物學(xué)特性和環(huán)境因素的雙重影響，蛛網(wǎng)萼分布面積和資源量日漸減少，種群自然增強(qiáng)能力減弱，面臨很高的滅絕風(fēng)險(xiǎn)。因此，1992年蛛網(wǎng)萼被列入《中國(guó)植物紅皮書(shū)——稀有瀕危植物》名錄，為國(guó)家二級(jí)瀕危種[5]。蛛網(wǎng)萼在自然條件下主要通過(guò)產(chǎn)生大量種子進(jìn)行繁育[6]。然而，已有研究表明，盡管蛛網(wǎng)萼能產(chǎn)生較多的種子，但由于種子體積小限制了其獲取養(yǎng)分，使得真正成熟能萌發(fā)的種子數(shù)量十分有限，而且在野外環(huán)境條件下落地的種子隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其活力不斷下降，導(dǎo)致蛛網(wǎng)萼種子在自然狀態(tài)下萌發(fā)率極低[7]。張麗芳等[6]研究表明，即使蛛網(wǎng)萼成熟種子在適宜的環(huán)境條件下，也存在萌發(fā)時(shí)間長(zhǎng)，萌發(fā)不整齊，萌發(fā)的幼苗脆弱、不易生長(zhǎng)等問(wèn)題。這些因素都導(dǎo)致了蛛網(wǎng)萼資源量減少和種群自然增強(qiáng)困難。植物組織培養(yǎng)是提高種子萌發(fā)率、加快植物繁育的重要的現(xiàn)代生物技術(shù)之一[8]。然而，迄今為止通過(guò)組織培養(yǎng)培育蛛網(wǎng)萼的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

近年來(lái)，野生植物的開(kāi)發(fā)利用已經(jīng)成為園林植物與觀賞園藝研究方向的重要組成部分，是豐富園林植物物種多樣性的根基與源泉。然而，野生蛛網(wǎng)萼存在生長(zhǎng)緩慢、植株矮小、對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求高等問(wèn)題，限制了對(duì)其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用。研究表明，野生植株多倍體的誘導(dǎo)是對(duì)其開(kāi)發(fā)利用的有效途徑之一。多倍體植株一般具有生長(zhǎng)旺盛，抗逆、抗病性強(qiáng)和適應(yīng)能力廣等特性[9]。而利用秋水仙素進(jìn)行化學(xué)誘變是獲得多倍體植株的重要方法之一[10-11]。例如，CHEN等用秋水仙素對(duì)野生剪秋羅進(jìn)行加倍處理后，獲得了大花、矮壯、觀賞價(jià)值更高的植株[12]。

本研究以采集于浙江鳳陽(yáng)山-百山祖國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的蛛網(wǎng)萼種子為試驗(yàn)材料，通過(guò)未成熟種子的離體培養(yǎng)，獲得試管實(shí)生苗。以試管實(shí)生苗的莖段為外植體，培養(yǎng)在木本植物用培養(yǎng)基（woody plant medium,WPM）[13]附加不同6-芐氨基嘌呤（6-benzylaminopurine,6-BA）和α-萘乙酸（1-naphthylacetic acid,NAA）質(zhì)量濃度配比的培養(yǎng)基上，建立蛛網(wǎng)萼的“芽生芽”離體繁殖體系。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)不同質(zhì)量濃度秋水仙素處理帶腋芽的莖段，誘導(dǎo)蛛網(wǎng)萼多倍體材料的獲得。再生芽經(jīng)生根、煉苗后野外回歸至自然保護(hù)區(qū)內(nèi)生長(zhǎng)。研究結(jié)果對(duì)蛛網(wǎng)萼瀕危資源的保護(hù)及其利用具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

分別采集野生蛛網(wǎng)萼成熟果實(shí)和未成熟果實(shí)。成熟果實(shí)為紫紅色，頂部孔呈開(kāi)裂狀態(tài)；未成熟果實(shí)為淺綠色，頂部孔呈閉合狀態(tài)。采樣時(shí)間為2013年9月中下旬到10月初。地點(diǎn)為浙江鳳陽(yáng)山-百山祖國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料消毒

分別將摘取的成熟果實(shí)和未成熟果實(shí)用洗潔精清洗后在流動(dòng)水下沖洗2 h。將沖洗好的果實(shí)放置在超凈工作臺(tái)上，用75%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水洗3次。再用0.1%HgCl2消毒10 min，其間搖晃3～5次后，無(wú)菌水沖洗5次。最后用無(wú)菌濾紙將果實(shí)上的多余水分吸干。

1.2.2 種子的剝離與接種

將消毒后的果實(shí)置于鋪有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，用滅菌解剖刀切除上下兩端各0.3 cm左右。然后縱向切開(kāi)，左手持鑷子夾住果實(shí)外皮，右手持解剖刀將種子及部分子房組織取下。以底部鋪1層濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿作發(fā)芽床，以置于發(fā)芽床的成熟種子作對(duì)照（CK）。將成熟種子和未成熟種子連同部分子房組織接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基（表1）上進(jìn)行培養(yǎng)，直至未成熟種子顏色變?yōu)榘岛稚?，再隨機(jī)挑取成熟種子和未成熟種子各10顆轉(zhuǎn)移至新的種子萌發(fā)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件為：（20±2）℃、黑暗。

表1 培養(yǎng)基成分Table 1 Component of medium

1.2.3 種子的萌發(fā)

將以上種子轉(zhuǎn)移至弱光條件（光照強(qiáng)度20 μmol/(m2·s)、光照時(shí)間12 h/d）下誘導(dǎo)萌發(fā)。培養(yǎng)35 d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，并觀察試管實(shí)生苗的生長(zhǎng)情況。

1.2.4 繁殖體系的建立

將試管實(shí)生苗轉(zhuǎn)移至WPM+1mg/L6-BA+1mg/L玉米素+500 mg/L水解酪蛋白培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，待其長(zhǎng)出3～4片葉后，取單節(jié)的試管實(shí)生苗莖段（約0.5 cm左右），轉(zhuǎn)移至1～4號(hào)含4種不同6-BA和NAA質(zhì)量濃度配比的繁育培養(yǎng)基（表1）上。每個(gè)濃度處理4個(gè)莖段外植體，每隔10 d觀察并記錄誘導(dǎo)的再生芽的高度和生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)條件為：溫度（20±2）℃、光照強(qiáng)度 20 μmol/(m2·s)、光照時(shí)間 12 h/d。平均生長(zhǎng)高度變化率=（平均終株高－平均起始株高）/平均起始株高×100%。

1.2.5 多倍體誘導(dǎo)試驗(yàn)

取蛛網(wǎng)萼帶腋芽的莖段分別置于含100、200、300、500 mg/L 4種質(zhì)量濃度的秋水仙素的液體MS培養(yǎng)基中，于搖床內(nèi)（150 r/min，28℃）培養(yǎng)3 d。再將經(jīng)秋水仙素液體培養(yǎng)基處理過(guò)的帶腋芽莖段移植于WPM培養(yǎng)基上，觀察其生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)條件為：溫度（20±2）℃、光照強(qiáng)度20 μmol/(m2·s)、光照時(shí)間12 h/d。每個(gè)濃度處理3個(gè)莖段，并進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。在多倍體誘導(dǎo)試驗(yàn)中，存活率=（成活個(gè)數(shù)/接種個(gè)數(shù)）×100%。

1.2.6 流式細(xì)胞分析

稱取單個(gè)誘導(dǎo)芽完全展開(kāi)的葉片約20 mg，放入塑料培養(yǎng)皿中，加入100 μL OttoⅠ緩沖液，用鋒利的刀片將其剁碎，以釋放細(xì)胞核。再用直徑為30 μm的尼龍網(wǎng)過(guò)濾到1.5 mL離心管中，5 000 r/min離心2 min。取沉淀及100 μL上清液，吹打混勻。再加入100 μL OttoⅠ緩沖液，室溫靜置5 min，其間將溶液顛倒2～3次。加入500 μL OttoⅡ緩沖液和200 μL PI（碘化丙啶+核糖核酸酶）染色液，輕輕搖動(dòng)混勻，避光靜置5 min后，用BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀測(cè)定數(shù)據(jù)，并通過(guò)Mod Fit LT軟件進(jìn)行分析[11]。

1.2.7 生根煉苗及野外回歸

待再生芽長(zhǎng)到1 cm左右后，轉(zhuǎn)移至WPM+0.5 mg/L IBA生根培養(yǎng)基（表1）中誘導(dǎo)生根并觀察生根情況。培養(yǎng)條件為：溫度（20±2）℃、光照強(qiáng)度20 μmol/(m2·s)、光照時(shí)間12 h/d。

選取根系長(zhǎng)為1.0～2.5 cm的試管苗，將瓶口打開(kāi)，在自然環(huán)境中煉苗2～3 d。再將試管苗取出，用清水沖洗除去殘留的培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)移至消毒的基質(zhì)中。為保持蛛網(wǎng)萼生長(zhǎng)環(huán)境高濕，每12 h或1 d對(duì)其全株進(jìn)行噴淋，并避免陽(yáng)光直射[12]。煉苗結(jié)束后選取部分植株進(jìn)行野外回歸。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子的萌發(fā)情況

自然條件下種子萌發(fā)率低是野生植物發(fā)生瀕危的重要原因之一。本試驗(yàn)以置于發(fā)芽床（CK）的成熟種子為對(duì)照，開(kāi)展了成熟種子和未成熟種子在培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)萌發(fā)試驗(yàn)。結(jié)果（表2）發(fā)現(xiàn)，播種35 d后，成熟種子無(wú)論在發(fā)芽床還是在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上均不發(fā)芽，萌發(fā)率為0。未成熟種子在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上顏色由淺黃褐色（圖1A）逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樯詈稚囵B(yǎng)成熟后種子萌發(fā)率達(dá)到了40.00%。萌發(fā)的試管實(shí)生苗葉片翠綠，外形矮?。▓D1B），生長(zhǎng)速度較慢。

表2 不同處理方法對(duì)蛛網(wǎng)萼種子萌發(fā)率的影響Table 2 Effect of different treatments on germination rate ofP.arguta

圖1 蛛網(wǎng)萼未成熟種子離體培養(yǎng)Fig.1 In vitro culture of immature seeds of P.arguta

2.2 繁殖體系的建立情況

為了擴(kuò)大試管實(shí)生苗的數(shù)量，本試驗(yàn)將帶有單個(gè)節(jié)的莖段（圖2A）置于1～4號(hào)繁育培養(yǎng)基（表1）上進(jìn)行培養(yǎng)。20 d左右發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量濃度6-BA和NAA的組合對(duì)誘導(dǎo)芽的個(gè)數(shù)影響沒(méi)有差異，都只誘導(dǎo)產(chǎn)生了單個(gè)腋芽，并沒(méi)有誘導(dǎo)出叢生芽。然而，1號(hào)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)再生芽的平均生長(zhǎng)高度變化率最大，為61.54%，是其他質(zhì)量濃度配方的1.7～2.5倍，且腋芽長(zhǎng)勢(shì)良好，顏色濃綠，葉片較大（圖2B）。6-BA和NAA不同質(zhì)量濃度的組合誘導(dǎo)的再生芽的平均生長(zhǎng)高度變化率存在顯著差異（表3）。由此可見(jiàn)，WPM+1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基是蛛網(wǎng)萼莖段培養(yǎng)的最佳配方。

圖2 蛛網(wǎng)萼擴(kuò)繁體系的建立Fig.2 In vitro propagation of P.arguta

2.3 蛛網(wǎng)萼的多倍體誘導(dǎo)結(jié)果

對(duì)瀕危植物多倍體的誘導(dǎo)一方面可以提高其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，另一方面還可以豐富其遺傳多樣性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)多倍體誘導(dǎo)處理的帶腋芽的莖段存活率隨秋水仙素質(zhì)量濃度的增加而顯著降低，當(dāng)秋水仙素質(zhì)量濃度增加至500 mg/L時(shí)，帶芽莖段全部死亡（表4）。存活下來(lái)的誘導(dǎo)芽經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定發(fā)現(xiàn)：用100 mg/L秋水仙素處理后共獲得了2個(gè)混倍體的芽，為二倍體和四倍體混合；用200 mg/L秋水仙素處理后共獲得了5個(gè)混倍體的芽，為二倍體和四倍體混合（表5和圖3）。綜上表明：本試驗(yàn)獲得了蛛網(wǎng)萼混合倍體的芽，而且二倍體的細(xì)胞數(shù)較多，但是其多倍體誘導(dǎo)的最佳質(zhì)量濃度還需要進(jìn)一步探究。

2.4 生根煉苗與野外回歸分析

野外回歸是野生植物種群增強(qiáng)與重建的重要途徑，能更有效地對(duì)瀕危植物進(jìn)行拯救和保護(hù)。本試驗(yàn)對(duì)獲得的再生芽進(jìn)行生根誘導(dǎo)，將生長(zhǎng)至1 cm高度左右的蛛網(wǎng)萼試管苗于WPM+0.5mg/L IBA生根培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)，產(chǎn)生了4～6根、1～2 cm長(zhǎng)的根，并帶有許多白色根毛（圖4A）。經(jīng)過(guò)7 d左右的煉苗處理后移栽至基質(zhì)上進(jìn)行培養(yǎng)，蛛網(wǎng)萼試管苗生長(zhǎng)狀態(tài)良好，葉片肥大，顏色翠綠（圖4B）。選取部分移栽苗于2017年4月野外回歸至浙江鳳陽(yáng)山-百山祖國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)中。

表3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度處理對(duì)蛛網(wǎng)萼生長(zhǎng)的影響Table 3 Effect of different concentrations of plant growth regulator on P.arguta growth

表4 不同質(zhì)量濃度的秋水仙素對(duì)蛛網(wǎng)萼存活率的影響Table 4 Effect of different concentrations of colchicine onsurvival rate of P.arguta

表5 不同質(zhì)量濃度的秋水仙素誘導(dǎo)對(duì)蛛網(wǎng)萼混倍體芽個(gè)數(shù)的影響Table 5 Effect of different concentrations of colchicine onnumbers of induced buds of P.arguta mixoploids

3 討論

3.1 未成熟種子培養(yǎng)對(duì)提高蛛網(wǎng)萼種子萌發(fā)率的作用

野生植物主要依靠種子繁衍后代。然而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蛛網(wǎng)萼成熟種子無(wú)論在發(fā)芽床還是在WPM+400 mg/L谷氨酰胺+500 mg/L水解酪蛋白+2 000 mg/L活性炭種子萌發(fā)培養(yǎng)基上均不能萌發(fā)。張麗芳等也發(fā)現(xiàn)，蛛網(wǎng)萼成熟種子在自然條件下萌發(fā)困難，處理后的蛛網(wǎng)萼種子最高萌發(fā)率只有12.5%，仍很低[6]。對(duì)于成熟種子萌發(fā)率低的情況，可以對(duì)未成熟種子進(jìn)行組織培養(yǎng)，提高其萌發(fā)率。丁蘭等發(fā)現(xiàn)，瀕危植物佛手參的成熟種子難以萌發(fā)，而未成熟種子經(jīng)培養(yǎng)后萌發(fā)率可達(dá)20%[14]。本試驗(yàn)使蛛網(wǎng)萼未成熟種子在萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)35 d后萌發(fā)率達(dá)到40%，有效解決了蛛網(wǎng)萼種子活力低或無(wú)活力的問(wèn)題，研究結(jié)果可以作為保護(hù)蛛網(wǎng)萼瀕危資源的重要手段之一。

3.2 蛛網(wǎng)萼高效離體繁殖體系的建立

野外觀察發(fā)現(xiàn)，蛛網(wǎng)萼在自然狀態(tài)下生長(zhǎng)緩慢，植株矮小，且蛛網(wǎng)萼試管苗過(guò)于矮小，甚至葉片緊貼培養(yǎng)基，不利于其后期誘導(dǎo)生根。因此，本試驗(yàn)將誘導(dǎo)芽的平均生長(zhǎng)高度變化率作為建立繁殖體系的重要衡量指標(biāo)。已有研究發(fā)現(xiàn)，不同激素濃度及其組合方式對(duì)誘導(dǎo)芽的生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用[15]。然而，至今仍未有對(duì)蛛網(wǎng)萼的研究。本試驗(yàn)利用“芽生芽”的培養(yǎng)方式[16]，發(fā)現(xiàn)添加1 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA的繁育培養(yǎng)基誘導(dǎo)的芽生長(zhǎng)率最大，長(zhǎng)勢(shì)良好。此配方不僅有利于后期生根誘導(dǎo)和野外回歸的開(kāi)展，而且在一定程度上彌補(bǔ)了蛛網(wǎng)萼作為木本植物生長(zhǎng)緩慢的缺陷，能在短時(shí)間內(nèi)獲得長(zhǎng)勢(shì)良好且基因組相同的蛛網(wǎng)萼試管苗，并防止通過(guò)愈傷組織途徑帶來(lái)的遺傳變異，有效規(guī)避了對(duì)稀有瀕危種質(zhì)資源的破壞[17]。

圖3 不同質(zhì)量濃度的秋水仙素處理后蛛網(wǎng)萼的流式細(xì)胞分析圖Fig.3 Flow cytometric analysis histograms of P.arguta under different concentrations of colchicine treatments

圖4 蛛網(wǎng)萼生根與移栽煉苗Fig.4 Root induction and seedling transplanted of P.arguta

3.3 秋水仙素誘導(dǎo)多倍體

CHEN等[12]發(fā)現(xiàn)，在組織培養(yǎng)的條件下利用秋水仙素處理莖段可以獲得多倍體植株。本試驗(yàn)利用秋水仙素處理蛛網(wǎng)萼試管實(shí)生苗莖段，誘導(dǎo)出了二倍體和四倍體的混倍體再生芽，說(shuō)明秋水仙素只誘導(dǎo)了再生芽部分細(xì)胞的加倍?；毂扼w在秋水仙素處理后非常常見(jiàn)[18]，ZAHEDI等對(duì)大葉青蘭進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，同時(shí)誘導(dǎo)出了四倍體和混倍體植株[19]，而吉仁花等用秋水仙素處理金達(dá)苜蓿的愈傷組織只獲得了混倍體[20]。一般情況下，可以通過(guò)提高秋水仙素的濃度來(lái)進(jìn)一步誘導(dǎo)多倍體植株的產(chǎn)生，但是隨著秋水仙素濃度的增大，其對(duì)細(xì)胞的毒害作用也加大。在本試驗(yàn)中，隨著秋水仙素質(zhì)量濃度的升高，混倍體產(chǎn)生的比率增大，但是誘導(dǎo)芽死亡率也升高，這與SHI等對(duì)冬棗（Ziziphus jujubeMill.）的誘導(dǎo)結(jié)果一致[21]。本研究獲得的混倍體再生芽需要通過(guò)進(jìn)一步誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生來(lái)獲得四倍體的植株[22-24]。

綜上所述，本研究成果為相關(guān)稀有瀕危種利用未成熟種子離體培養(yǎng)誘導(dǎo)種子萌發(fā)和建立繁殖體系來(lái)改善植株生長(zhǎng)速度和植株高度提供了技術(shù)支持，并對(duì)秋水仙素誘導(dǎo)加倍瀕危物種染色體以優(yōu)化種質(zhì)資源、增加物種多樣性提供了技術(shù)參考。