厭氧氨氧化研究的分子生態(tài)學(xué)進展

朱辰，張乃方，徐陳超，張凱杭，程磊

（浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生命系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)與保護教育部重點實驗室，杭州 310058）

氮素對于地球上所有生物而言都不可或缺，它參與形成了細胞結(jié)構(gòu)，是蛋白質(zhì)和核酸的必要組成成分之一。其中，銨態(tài)氮和硝態(tài)氮是自然界中氮元素常見的存在形式。在傳統(tǒng)的氮循環(huán)框架中，固氮細菌將大氣中的氮氣固定為銨態(tài)氮，而銨態(tài)氮向氮氣的轉(zhuǎn)化需要2步反應(yīng)[1-2]：第一步是在有氧條件下，硝化細菌將銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮[3]；第二步是在厭氧條件下，由反硝化菌把硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化成氮氣[4]（圖1）。

20世紀90年代，對“厭氧氨氧化”[式（1）]的發(fā)現(xiàn)及相關(guān)微生物的鑒定打破了好氧氨氧化的傳統(tǒng)觀念[5-7]。

迄今為止，無數(shù)關(guān)于厭氧氨氧化菌的研究揭示了這類細菌具有廣泛的分布及可能演化出的與眾不同的結(jié)構(gòu)與代謝特征。本文總結(jié)了最為常見的研究方法與技術(shù)，并在群落、細胞、分子與組學(xué)3個不同的層面論述了它們在厭氧氨氧化研究中起到的推動作用（圖2）。

圖1 氮循環(huán)框架Fig.1 Framework of nitrogen cycle

圖2 厭氧氨氧化菌研究發(fā)展示意圖Fig.2 Timeline ofANAMMOX bacteria research

1 群落水平

經(jīng)典的培養(yǎng)方法和氮同位素標記相結(jié)合，為厭氧氨氧化過程及相關(guān)微生物的初步了解打下了基礎(chǔ)。

1.1 厭氧氨氧化的發(fā)現(xiàn)

早期的厭氧氨氧化研究主要集中在厭氧生物反應(yīng)器中。1995年，MULDER等[7]證實了BRODA的猜測[8]，他們發(fā)現(xiàn)在反硝化流化床反應(yīng)器（denitrifying fluidized-bed reactor,DFBR）中，隨著氮氣的產(chǎn)生，銨根離子和硝酸根離子的消耗也在不斷增加，由此他們提出了在厭氧條件下以硝酸根離子（后來證明是亞硝酸根離子）為電子受體的銨根離子氧化反應(yīng)，并將其命名為“厭氧氨氧化”[7]。緊接著，VAN DE GRAAF等通過滅菌實驗進一步表明，厭氧氨氧化實際上是微生物參與的氧化還原反應(yīng)[5]。

由于厭氧氨氧化菌的生長極為緩慢，迄今仍未獲得它們的純培養(yǎng)，但一些厭氧生物反應(yīng)器的應(yīng)用使厭氧氨氧化菌的富集研究取得了很大進展。首先，序批式反應(yīng)器（sequencing batch reactor,SBR）利用生物膜，不僅提高了生物量的保留，還在很長時間內(nèi)維持了反應(yīng)器內(nèi)穩(wěn)定的底物環(huán)境，因此成功將厭氧氨氧化菌在富集后的微生物群落中的比例提升到了80%[9]，為厭氧氨氧化菌的分類鑒定打下了基礎(chǔ)。隨后，膜生物反應(yīng)器（membrane bioreactor,MBR）被證明是更為有效的富集工具，它一方面滿足了厭氧氨氧化菌懸浮的自由生長狀態(tài)，另一方面減少了細菌因為難以沉淀而造成的損失。在用MBR獲得的富集產(chǎn)物中，厭氧氨氧化菌的比例可以達到97.6%[10]，使得其全基因序列獲取成為可能。

1.2 厭氧氨氧化的環(huán)境分布

在厭氧氨氧化發(fā)現(xiàn)之初，厭氧氨氧化的發(fā)生途徑及它在自然界的地位是研究人員十分關(guān)注的問題，然而，采用單純測定反應(yīng)物和產(chǎn)物濃度的方法無法提供明確的證據(jù)表征其通量，而同位素標記法的出現(xiàn)為厭氧氨氧化的研究帶來了新的機遇。

同位素是同一元素的不同原子，它們質(zhì)子數(shù)相同，中子數(shù)不同，但是除了相對原子質(zhì)量不同以外，化學(xué)性質(zhì)基本相同。研究中，同位素標記培養(yǎng)常被用來追蹤特定元素的轉(zhuǎn)變過程。1997年，VAN DE GRAAF等首次嘗試在反應(yīng)器的培養(yǎng)體系中添加了15N標記的氮化合物，以此分析厭氧氨氧化的代謝通路，并預(yù)測聯(lián)氨可能作為中間產(chǎn)物[11]。

在自然生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)轉(zhuǎn)化方面，同位素標記起著十分重要的作用。反硝化產(chǎn)生的氮氣中的氮原子全部來源于硝酸根離子，而厭氧氨氧化產(chǎn)生的氮氣中的氮原子一個來自銨根離子，另一個來自亞硝酸根離子，因此它們的來源并不相同。在添加15N標記的和或者和對樣品進行厭氧培養(yǎng)后，通過氣相色譜-同位素比值質(zhì)譜儀測定產(chǎn)物氮氣中的29N2和30N2，可以得知在總的氮氣產(chǎn)生中厭氧氨氧化所占的比例，從而估算環(huán)境中厭氧氨氧化在氮素流失上作出的貢獻。

借助同位素標記，越來越多的研究驗證了厭氧氨氧化在自然生態(tài)系統(tǒng)中的重要地位。例如在海洋生態(tài)系統(tǒng)中，厭氧氨氧化的貢獻范圍為0～67%[12]，有時甚至可以超過反硝化；在淡水生態(tài)系統(tǒng)中，如天然淡水湖坦噶尼喀湖，厭氧氨氧化所產(chǎn)生的氮氣也可以達到13%[13]；而在陸地生態(tài)系統(tǒng)如水稻田中，同樣也存在著厭氧氨氧化，其貢獻的比例為4%～37%[14]。

厭氧氨氧化菌的分布差異可能是受到了環(huán)境因子的限制。作為厭氧微生物，厭氧氨氧化菌對氧氣濃度的變化十分敏感，以空氣中含氧量100%為氧飽和，它們在低于5%氧飽和的環(huán)境下可以生存，高于18%氧飽和的氧分壓會抑制它們的活性[15]；許多研究表明，pH中性或者弱堿性的條件比較適合厭氧氨氧化菌的生長和反應(yīng)的發(fā)生，例如在反應(yīng)器中的厭氧氨氧化菌，最適pH范圍為6.7～8.3[11,16]；溫度也是厭氧氨氧化反應(yīng)的另一個重要限制因子，厭氧氨氧化菌最適應(yīng)的溫度范圍是20～43℃[17]。此外，取樣深度[18]、鹽度[19]、有機質(zhì)濃度[17,20]等也都會對厭氧氨氧化反應(yīng)產(chǎn)生影響。

近年來，陸續(xù)有研究證實全球氣候變化可以對全球碳氮循環(huán)帶來影響[21-23]，而厭氧氨氧化反應(yīng)對全球氣候變化的響應(yīng)還有待進一步研究。

2 細胞水平

以16S rRNA基因測序為基礎(chǔ)的一系列分子手段的加入推進了厭氧氨氧化菌的結(jié)構(gòu)、分類和代謝特征相關(guān)的研究。

2.1 鑒定與分類

1999年，STROUS等首次對厭氧氨氧化菌使用16S rRNA基因測序進行鑒定和分類，發(fā)現(xiàn)它們是屬于浮霉菌門的一個單獨分支[6]，促使厭氧氨氧化菌的研究深入到細胞水平。

16S rRNA基因測序分析一直作為揭示細菌系統(tǒng)發(fā)育和細菌鑒定的重要方法之一。rRNA是一段十分理想的研究細菌分類的基因序列。幾乎所有微生物都需要核糖體來進行轉(zhuǎn)錄，編碼核糖體的序列在細胞中有著很高的比例且不可或缺，而且它們在進化過程中十分保守，因此常用作細菌的分類和進化判斷的依據(jù)。

迄今為止，已經(jīng)有Brocadia、Kuenenia、Anammoxoglobus、Jettenia和Scalindua5個屬被歸為厭氧氨氧化菌。厭氧氨氧化菌在自然界分布十分廣泛，不僅存在于海洋、淡水、陸地等各種生態(tài)系統(tǒng)中，甚至在極端溫度或者pH的環(huán)境中也有它們的分布（表1）。

在已知的厭氧氨氧化菌里，Brocadia、Kuenenia、Anammoxoglobus和Jettenia4個屬大多出現(xiàn)在淡水或者人工處理系統(tǒng)中；而在海洋生態(tài)系統(tǒng)中則以Scalindua最為常見，特別是在一些海洋沉積物和最小含氧區(qū)（oxygen minimum zone,OMZ）中；Brocadia和Jettenia在土壤中占據(jù)主導(dǎo)地位。在一些情況下，微生物群落組成還會發(fā)生轉(zhuǎn)變，例如在人工濕地系統(tǒng)中，單一的Brocadia在培養(yǎng)之后逐漸變成了由Jettenia、Brocadia和Anammoxoglobus組成的混合菌群[24]。

2.2 原位檢測

基于堿基互補原則的熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization,FISH）已經(jīng)逐漸成為微生物生態(tài)學(xué)研究中的有力工具。它先是使用帶有Cy3、Cy5等熒光基團標記的寡核苷酸探針對微生物細胞進行原位標記，再通過檢測原位熒光來顯示特定核苷酸序列（通常選用rRNA基因序列）的存在和分布。FISH操作快速且具有很高的靈敏性。在長期的摸索中，許多探針以其準確性和普適性在厭氧氨氧化研究中被廣泛使用（表2）。

表1 厭氧氨氧化菌在不同環(huán)境中的分布Table 1 Distribution ofANAMMOX bacteria in different systems

表2 熒光原位雜交常用探針Table 2 Probes frequently used in fluorescence in situ hybridization(FISH)

FISH不僅在許多自然環(huán)境中原位證明了厭氧氨氧化菌的存在，還可以完成厭氧氨氧化菌的定量分析，例如在黑海和本格拉上升流等海洋水體的研究中，以FISH標記為依據(jù)的厭氧氨氧化菌細胞計數(shù)表明單細胞的反應(yīng)速率和之前在反應(yīng)器內(nèi)測得的數(shù)據(jù)相吻合[29,34]。

然而，在陸地生態(tài)系統(tǒng)的研究中，F(xiàn)ISH面臨著較大的局限性。厭氧氨氧化菌的低豐度及大量可以產(chǎn)生自發(fā)熒光的干擾物對FISH的靈敏度提出了更高要求。催化報告沉積熒光原位雜交（catalyzed reporter deposition-fluorescencein situhybriddization,CARD-FISH）技術(shù)的出現(xiàn)在一定程度上解決了這個問題。它使用以辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標記的寡核苷酸探針，雜交完成后加入含有熒光標記的酪胺，利用HRP催化酪胺沉積的酶促反應(yīng)使得熒光信號隨之聚集。熒光信號的放大無疑可以大幅度增強顯微鏡下標記微生物的辨識度。

2015年，NIE等在水稻田土壤樣品中采用CARD-FISH進行原位檢測，并成功獲得了厭氧氨氧化菌原位圖像[51]。相信隨著這一技術(shù)的不斷成熟和推廣，將會給陸地生態(tài)系統(tǒng)中厭氧氨氧化的研究帶來更多的契機。

2.3 定量分析

在厭氧氨氧化菌研究中，定量聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction,qPCR)同樣也是一項與基因測序相結(jié)合的分子技術(shù)。常被用到的方法包括TaqMan探針法和SYBR Green染料法。qPCR的原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，隨著PCR反應(yīng)的擴增，熒光信號不斷增強，實時監(jiān)測的熒光信號可以根據(jù)外參基因或者內(nèi)參基因所建立的標準曲線來計算待測樣品中目標基因的拷貝數(shù)。

在許多研究中，厭氧氨氧化菌豐度的估算都會以厭氧氨氧化菌的16S rRNA基因作為目標基因[14,36,52]，如HAMERSLEY等發(fā)現(xiàn)在秘魯海洋最小含氧區(qū)的水體中，幾乎所有深度都有厭氧氨氧化菌的分布，而且它們在總?cè)后w中所占的比例從0.8%到3.1%不等[36]。除此之外，一些功能基因如聯(lián)氨氧化酶基因（hzo）[53-54]和聯(lián)氨合成酶基因（hzs）[26,41-55]等也會被用來進行厭氧氨氧化菌的豐度評估。

2.4 細胞結(jié)構(gòu)

在引入現(xiàn)代分子手段的同時，STROUS等借助透射電子顯微鏡找到了富集于微生物群落中的厭氧氨氧化菌，發(fā)現(xiàn)它們外觀呈不規(guī)則的球狀，平均直徑為0.8～1.1 μm[6]。值得注意的是，厭氧氨氧化菌有著一層由致密的“梯烷（ladderane）”組成的膜，這層膜在細胞內(nèi)部形成了一個封閉的厭氧氨氧化體（anammoxosome）（圖3），這個結(jié)構(gòu)在其他已知的原核生物中都沒有出現(xiàn)過。厭氧氨氧化體可以占據(jù)細胞50%～80%的體積[56]，致密的膜結(jié)構(gòu)有效地防止了厭氧氨氧化反應(yīng)過程中有毒產(chǎn)物進入細胞。正是因為厭氧氨氧化菌結(jié)構(gòu)上的這一特點，所以在很多研究中，梯烷也可以作為厭氧氨氧化菌的特征性標志物，用來探測厭氧氨氧化菌在環(huán)境中的分布[13,29,34]。

圖3 厭氧氨氧化菌的結(jié)構(gòu)及厭氧氨氧化代謝途徑Fig.3 Structure and metabolic pathway of ANAMMOX bacteria

3 組學(xué)分析水平

基因組學(xué)（genomics）和蛋白質(zhì)組學(xué)分析的應(yīng)用使厭氧氨氧化菌的代謝途徑和代謝相關(guān)酶類愈發(fā)清晰。

3.1 基因組學(xué)

在基因組中，通常相同功能或者相同起源的基因會聚集形成基因簇，而通過與已知功能基因的相似性比對來預(yù)測基因組中不同位置基因的功能，可以很好地反映這個物種的代謝需求。2006年，STROUS等從環(huán)境DNA中獲得了CandidatusKuenenia stuttgartiensis(K.stuttgartiensis)相對完整的基因序列，在厭氧氨氧化菌的代謝和功能研究中加入了基因組學(xué)分析[57]。在K.stuttgartiensis基因組中，有200多個與厭氧氨氧化有關(guān)的基因。根據(jù)亞硝酸鹽還原酶基因（nirS）的出現(xiàn)，STROUS等提出在厭氧氨氧化反應(yīng)中，可能存在以NO為中間產(chǎn)物的新型代謝途徑[57]。

另外，對基因組的分析還帶來了其他的發(fā)現(xiàn)。在結(jié)構(gòu)上，浮霉菌門細菌的細胞壁一直被認為不含肽聚糖，但在K.stuttgartiensis中卻檢測到一些編碼肽聚糖的基因，近年研究也證實厭氧氨氧化菌的細胞壁中的確含有少量肽聚糖[58]，這表明厭氧氨氧化菌本該屬于革蘭氏陰性菌。

在固定二氧化碳方面，K.stuttgartiensis存在著編碼完整的乙酰輔酶A途徑的基因。隨著關(guān)鍵酶活性的證實，說明厭氧氨氧化菌其實是一類通過乙酰輔酶A途徑進行二氧化碳固定的化能自養(yǎng)菌。

新近研究也表明，在銨的吸收方面，K.stuttgartiensis基因編碼的銨轉(zhuǎn)運蛋白中，有一類只與銨根離子結(jié)合并不參與轉(zhuǎn)運的不同于其他家族成員的蛋白，它們很有可能代表了進化上比較原始的一類銨轉(zhuǎn)運蛋白[59]。

近年來，Brocadia、Jettenia和Scalindua的部分或完全基因組序列也相繼被測出[60-62]。分析表明，不同種類的厭氧氨氧化菌在編碼關(guān)鍵酶的基因上存在一些差異，例如在K.stuttgartiensis和CandidatusScalindua profunda(S.profunda)中存在的nirS，并不存在于CandidatusBrocadia fulgida(B.fulgida)和CandidatusJettenia asiatica(J.asiatica)中，預(yù)示著它們的亞硝酸鹽代謝途徑可能有所不同。

3.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)

轉(zhuǎn)錄組代表的是細胞內(nèi)基因表達的水平，在轉(zhuǎn)錄水平上的分析往往更能代表細菌的活性。2011年，KARTAL等利用蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組分析，闡明了K.stuttgartiensis完整的分子機制[63]：在厭氧氨氧化體內(nèi)，亞硝酸還原酶首先將亞硝酸根離子還原成一氧化氮；然后，一氧化氮與銨在聯(lián)氨生成酶作用下反應(yīng)生成中間產(chǎn)物聯(lián)氨；最后，聯(lián)氨在聯(lián)氨脫氫酶的作用下分解形成氮氣，完成整個厭氧氨氧化循環(huán)（圖2）。

4 展望

厭氧氨氧化不僅在自然界具有重要的地位，在污水處理方面也起著重要的作用[64]。直接氧化銨產(chǎn)生氮氣簡化了硝化-反硝化反應(yīng)過程，節(jié)省了物質(zhì)和能源的消耗。目前已經(jīng)發(fā)展出ANAMMOX、SHANNON-ANAMMOX和CANON等工藝應(yīng)用于污水脫氮處理。

然而，由于厭氧氨氧化菌生長緩慢和對環(huán)境變化敏感的特性，人們對于它們的了解還不夠深入，許多假設(shè)仍待進一步驗證，其中的科學(xué)問題及其應(yīng)用前景仍待深入發(fā)掘。首先，如何獲得厭氧氨氧化菌的純培養(yǎng)，是否能找出浮霉菌門以外的能夠進行厭氧氨氧化的細菌；其次，關(guān)鍵酶類的體外解析是否可以幫助完善這類細菌的代謝通路；再者，以亞硝酸為電子受體的厭氧氨氧化菌和以其他如鐵[65]、錳[66]、硫氧化物[67]等為電子受體的厭氧氨氧化菌的遺傳代謝機制的差異等。

經(jīng)典方法的迅速革新和新興技術(shù)的快速發(fā)展為解決這些問題提供了前所未有的機遇。一方面，作為微生物富集首要途徑的厭氧生物反應(yīng)器已經(jīng)愈發(fā)高效和成熟，與此同時，穩(wěn)定同位素探針（stable isotope probing,SIP）技術(shù)在環(huán)境微生物培養(yǎng)方面的應(yīng)用也會大大加速主導(dǎo)菌群的鑒定[68]；另一方面，合成生物學(xué)的發(fā)展使得越來越多的關(guān)鍵酶類能夠在體外表達，甚至可以重構(gòu)其代謝通路驗證其功能，為厭氧氨氧化過程中關(guān)鍵酶的解析提供了極大的便利。

作為全球氮循環(huán)中至關(guān)重要的一環(huán)，厭氧氨氧化的闡釋不僅可以幫助完善微生物種群與功能之間的聯(lián)系，而且在如何有效地進行環(huán)境的利用和保護及探討整個生態(tài)系統(tǒng)對于全球氣候變化的響應(yīng)方面也具有十分重要的意義。