不同分級NSCLC病灶內(nèi)FoxM1表達(dá)的變化及其與增殖、侵襲基因表達(dá)的相關(guān)性

張靜，熊琦，陶海濤，秦博宇，張國慶

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是臨床最主要的原發(fā)性肺癌病理類型，近年由于體檢普及以及影像學(xué)檢查手段的革新，越來越多的小病灶NSCLC被檢出，臨床患病率呈迅速上升趨勢[1-2]。根據(jù)NSCLC病理分級不同，癌細(xì)胞的惡性程度也存在較大差異，直接影響治療方式的選擇及最終預(yù)后。低分化甚至未分化的NSCLC治療一直是臨床難點，尋找與疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的分子靶點并進行針對性的靶向治療，成為該病治療的新思路。FoxM1是對細(xì)胞分化、器官發(fā)育等多個生命過程均具有調(diào)控作用的重要轉(zhuǎn)錄因子，已經(jīng)有研究證實其可直接影響胃癌、食管癌、肝癌等常見腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，推測其是癌細(xì)胞惡變過程中的重要靶點之一[3-5]。為了明確FoxM1基因在NSCLC中扮演的角色，現(xiàn)分析不同病理分級NSCLC病灶中FoxM1基因表達(dá)及其表達(dá)量與癌細(xì)胞增殖、侵襲等惡性行為的內(nèi)在聯(lián)系，以期為日后NSCLC的靶向治療提供新思路，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年9月—2018年5月中國人民解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科接受肺癌根治術(shù)后的NSCLC患者118例作為NSCLC組，其中男56例,女62例，年齡47～72(64.37±9.15)歲; 合并高血壓35例,糖尿病21例,冠心病15例。取每個NSCLC患者的病灶組織標(biāo)本作為研究樣本，根據(jù)病理分級將其分為高分化亞組49例,中分化亞組54例,低分化亞組15例。另取同期在本院進行肺結(jié)節(jié)切除術(shù)，術(shù)后病理證實為肺腺瘤的肺良性病變患者50例(病灶標(biāo)本50個)作為良性組，其中男22例,女28例，年齡44～75(65.01±10.86)歲;合并高血壓14例,糖尿病8例,冠心病5例。2組患者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬同意并簽署知情同意書。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①NSCLC患者首次確診,且術(shù)前未經(jīng)保守治療；②符合肺癌根治術(shù)指征；③嚴(yán)格無菌條件下獲取并凍存病灶組織，操作過程中無污染；④年齡18～80周歲。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他原發(fā)惡性腫瘤； ②合并具有惡性生物學(xué)行為的良性疾病；③合并全身感染性疾病。

1.3 觀察指標(biāo)與方法 術(shù)中病灶切除后即刻留取病灶組織標(biāo)本1 cm×1 cm，置入凍存管中并放入液氮中冷凍30 min,取出后放置于-80℃冰箱長期保存。

1.3.1 FoxM1基因表達(dá)量測定： 采用實時熒光定量PCR法檢測各組病灶組織中FoxM1 mRNA表達(dá)量，具體操作步驟如下：(1)取凍存標(biāo)本組織并提取樣品RNA；(2)采用紫外吸收法測定RNA質(zhì)量；(3)采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成樣品cDNA，反應(yīng)條件包括70℃干浴3 min→冰水浴降溫至室溫→加逆轉(zhuǎn)錄酶后37℃水浴60 min→95℃干浴3 min→得到逆轉(zhuǎn)錄溶液并凍存于-80℃中；(4)待測樣品管家基因?qū)崟r定量PCR，反應(yīng)條件包括93℃ 2 min→93℃ 1 min→55℃ 2 min，共計40個循環(huán)；(5)DNA模板制備；(6)待測樣品FoxM1基因?qū)崟r定量PCR，反應(yīng)條件包括93℃ 2 min→93℃ 1 min→55℃ 1 min→72℃ 1 min→40個循環(huán)后，72℃ 7 min延伸；(7)引物序列: 5'-ATTGCGGTAGCGATGACTGAC，3'-CTAGGTACGAACCTGAGGAAT；(8)電泳明確PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。上述步驟中涉及的反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購自上海西唐生物科技公司；所用試劑TRIZOL、氯仿、異丙醇、瓊脂糖、EDTA、甲醛等均購自美國Sigma公司。設(shè)置良性組病灶中FoxM1基因表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)值100，計算其在NSCLC組病灶中的相對表達(dá)量。

1.3.2 NSCLC相關(guān)增殖基因、侵襲基因表達(dá)量測定：同樣采用實時熒光定量PCR法檢測NSCLC組、良性組病灶組織中增殖基因(PAX6、HOXB7、EIF5A2、DLC-1、Keap1、PTEN)和侵襲基因(PTTG1、LSD1、TEM8、KLF4、LKB1、RKIP)的mRNA表達(dá)量，具體操作步驟同1.3.1項。 上述基因的引物序列見表1。設(shè)置良性組病灶中上述基因表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)值100，計算NSCLC組病灶中對應(yīng)基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 不同肺部腫瘤病灶組織中FoxM1基因表達(dá)量比較 NSCLC組病灶中FoxM1基因表達(dá)量高于良性組(P<0.01)。隨分化程度降低, FoxM1基因表達(dá)量增加，不同病理分級的病灶組織中FoxM1基因表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 不同肺部腫瘤病灶組織中FoxM1基因表達(dá)量的比較

注：與高分化亞組比較，aP<0.01; 與中分化亞組比較，bP<0.01

2.2 不同肺部腫瘤病灶組織中促增殖及增殖抑制基因表達(dá)量比較 NSCLC組病灶中增殖基因PAX6、HOXB7、EIF5A2 mRNA的表達(dá)量均高于良性組，增殖抑制基因DLC-1、Keap1、PTEN mRNA的表達(dá)量均低于良性組(P<0.01)。NSCLC組中，不同病理分級的病灶組織中上述促增殖及增殖抑制基因表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且隨分化程度降低，PAX6、HOXB7、EIF5A2 mRNA的表達(dá)量增加，DLC-1、Keap1、PTEN mRNA的表達(dá)量減少(P<0.01)，見表3。

表1 NSCLC相關(guān)增殖基因、侵襲基因引物序列

表3 不同肺部腫瘤病灶組織中促增殖基因和增殖抑制基因表達(dá)量的比較

注：與高分化亞組比較，aP<0.01; 與中分化亞組比較，bP<0.01

表4 不同肺部腫瘤病灶組織中促侵襲基因和侵襲基因表達(dá)量的比較

注：與高分化亞組比較，aP<0.01; 與中分化亞組比較，bP<0.01

2.3 不同肺部腫瘤病灶組織中侵襲基因表達(dá)量比較 NSCLC組病灶中促侵襲基因PTTG1、LSD1、TEM8 mRNA的表達(dá)量高于良性組，侵襲抑制基因KLF4、LKB1、RKIP mRNA的表達(dá)量低于良性組(P<0.01)。NSCLC組中，不同病理分級的病灶組織中上述侵襲基因表達(dá)量比較有顯著差異，且隨分化程度降低，PTTG1、LSD1、TEM8 mRNA的表達(dá)量增加，KLF4、LKB1、RKIP mRNA的表達(dá)量減少(P<0.01)，見表4。

2.4 相關(guān)性分析 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，NSCLC病灶內(nèi)FoxM1基因表達(dá)量與增殖基因PAX6、HOXB7、EIF5A2 mRNA的表達(dá)量呈正相關(guān)(r/P=0.419/0.009,0.388/0.013,0.465/0.006)，與DLC-1、Keap1、PTEN mRNA的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r/P=-0.347/0.015,-0.417/0.010,-0.503/0.000)；與侵襲基因PTTG1、LSD1、TEM8 mRNA的表達(dá)量呈正相關(guān)(r/P=0.377/0.016,0.412/0.009,0.509/0.000)，與KLF4、LKB1、RKIP mRNA的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r/P=-0.453/0.003,-0.409/0.010,-0.386/0.019)。

3 討 論

FoxM1基因?qū)儆谵D(zhuǎn)錄因子家族成員，其在胚胎組織中呈普遍表達(dá)、可刺激細(xì)胞增殖及有絲分裂，但生理狀態(tài)下在終末分化的細(xì)胞中表達(dá)量顯著下降[6]。近來研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1基因的異常激活參與了許多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同時可使腫瘤臨床分期增高、浸潤程度增加[7-8]。NSCLC已經(jīng)成為臨床最多見的惡性腫瘤性疾病之一，其發(fā)展過程中的關(guān)鍵分子靶點尋找也是疾病研究的最重要課題之一。本研究中NSCLC病灶組織中FoxM1基因表達(dá)量大幅高于肺部良性疾病病灶組織，說明FoxM1基因激活也參與NSCLC的發(fā)生；同時隨NSCLC病理分化程度下降，F(xiàn)oxM1基因表達(dá)量呈持續(xù)上升趨勢，說明FoxM1基因表達(dá)上升是導(dǎo)致NSCLC惡性程度增加的直接因素之一。

癌細(xì)胞的增殖活性是反映腫瘤惡性程度最直觀的指標(biāo)，檢測具體增殖基因表達(dá)量可間接反映癌細(xì)胞的增殖活力以及腫瘤惡性程度。PAX6、HOXB7、EIF5A2基因在不同研究中被證實可促進NSCLC細(xì)胞增殖[9-11]，具體與其加速細(xì)胞周期進展直接相關(guān)，在腫瘤病灶中普遍存在過表達(dá)；而DLC-1、Keap1、PTEN基因則可抑制NSCLC細(xì)胞增殖[12-14]，在具體癌癥病灶中可發(fā)現(xiàn)其表達(dá)異常下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC病灶中PAX6、HOXB7、EIF5A2基因表達(dá)量大幅高于肺部良性病灶，而DLC-1、Keap1、PTEN基因表達(dá)量則較低，且在 NSCLC病灶內(nèi)部，隨腫瘤分化程度下降，上述基因表達(dá)量的變化趨勢更為顯著，與既往研究結(jié)論基本一致，說明NSCLC細(xì)胞存在異常增殖，且隨病理分級下降這一異常增殖現(xiàn)狀加劇，符合癌細(xì)胞的惡性行為學(xué)特征。相關(guān)性分析指出，NSCLC病灶中FoxM1基因表達(dá)量與PAX6、HOXB7、EIF5A2基因表達(dá)量呈正相關(guān)，與DLC-1、Keap1、PTEN基因表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，結(jié)合各個基因?qū)Π┘?xì)胞增殖的作用，可證實FoxM1基因通過促進癌細(xì)胞的增殖能力而參與NSCLC病情進展。

與細(xì)胞增殖活力相似，癌細(xì)胞侵襲性的獲得是腫瘤發(fā)生淋巴及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，其中伴隨著多種與侵襲基因的表達(dá)變化[15-16]。PTTG1、LSD1、TEM8基因在不同研究中被證實可促進NSCLC細(xì)胞的侵襲能力[17-19]，具體與其促進細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程相關(guān)；而KLF4、LKB1、RKIP基因則屬于典型的抑癌基因，在惡性腫瘤組織中呈低表達(dá)甚至表達(dá)缺失[20-22]，由于其對癌細(xì)胞的惡性行為抑制不足從而間接促進腫瘤進展。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC病灶中PTTG1、LSD1、TEM8基因表達(dá)量呈異常增加，而KLF4、LKB1、RKIP基因表達(dá)量異常下降，且隨腫瘤病理分化程度下降上述基因表達(dá)量變化程度更顯著，明確了NSCLC細(xì)胞侵襲力的變化趨勢。相關(guān)性分析進一步指出，NSCLC病灶中FoxM1基因表達(dá)量與PTTG1、LSD1、TEM8基因表達(dá)量呈正相關(guān)，與KLF4、LKB1、RKIP基因表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，證實FoxM1基因還可以通過促進癌細(xì)胞的侵襲能力而參與NSCLC病情進展。

綜上所述， NSCLC病灶內(nèi)FoxM1基因表達(dá)量異常增加，且隨病理分化程度下降其表達(dá)量進一步上升。FoxM1基因表達(dá)量與NSCLC相關(guān)增殖及侵襲基因表達(dá)量直接相關(guān)，可能由此參與疾病的發(fā)生發(fā)展。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

張靜:負(fù)責(zé)研究構(gòu)思、選擇課題、課題設(shè)計、論文撰寫；熊琦、陶海濤、秦博宇:負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)獲取、統(tǒng)計分析并參與撰寫；張國慶:負(fù)責(zé)研究方案指導(dǎo)、論文修改