罐裝食品與生物基質(zhì)中雙酚-二縮水甘油醚的分析方法研究進(jìn)展

楊潤暉，牛宇敏，邵 兵*

(1.天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.北京市疾病預(yù)防控制中心，食品中毒診斷與溯源技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100013)

雙酚A-二縮水甘油醚(Bisphenol A-diglycidyl ether,BADGE)和雙酚F-二縮水甘油醚(Bisphenol F-diglycidyl ether,BFDGE)是表氯醇與雙酚A(BPA)或雙酚F(BPF)反應(yīng)合成的工業(yè)化合物，是環(huán)氧樹脂、環(huán)氧樹脂漆或乙烯基有機(jī)溶膠樹脂的主要化學(xué)組分，因此常用于大型儲罐和食品容器內(nèi)部的涂覆，以減少食品變質(zhì)，防止金屬腐蝕[1-2]。然而，研究發(fā)現(xiàn)涂層在熱穩(wěn)定和儲存過程中與水性和酸性食品接觸會產(chǎn)生相應(yīng)的水解和氯化衍生物[3-6]。本文將BADGE、BFDGE及其衍生物統(tǒng)稱為雙酚-二縮水甘油醚(Bisphenol-diglycidyl ethers，BDGEs)。BADGE和BFDGE是典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)。據(jù)報(bào)道，BADGE具有比BPA更高的內(nèi)分泌干擾潛能[7]，且其氯化衍生物是雄激素受體的有效拮抗劑[8]。此外，研究還顯示BFDGE具有細(xì)胞毒性、基因毒性、致突變性和內(nèi)分泌干擾作用[9-11]。2005年，歐盟制訂了BADGE組分的特定遷移限量：BADGE及其水解衍生物在食品和食品模擬物中的遷移總量應(yīng)≤ 9 mg/kg；BADGE的氯化衍生物在食品及食品模擬物中的遷移總量≤1 mg/kg[12]。2011年，歐盟禁止BFDGE在食品接觸材料中使用[12]。目前我國尚未制訂相關(guān)的食品安全限量標(biāo)準(zhǔn)，相比歐盟的要求，存在一定的食品安全隱患。本文介紹了BDGEs的污染及人體暴露水平，重點(diǎn)闡述了罐裝食品及生物基質(zhì)中BDGEs的分析方法，并對BDGEs的研究方向進(jìn)行了展望。

1 BDGEs殘留及人體暴露情況

由于BADGE和BFDGE主要用于罐裝食品涂層，因此針對罐裝食品中BDGEs的殘留情況開展了大量研究。其中魚、肉罐頭、奶制品等動(dòng)物性罐裝食品是主要研究對象。在BDGEs中BADGE·2H2O和BADGE·HCl·H2O的檢出率和濃度最高，這證實(shí)了BADGE是包裝材料涂層的主要來源。Cheng等[13]在乳制品中檢出高含量的BADGE·2H2O，含量高達(dá)1 209.6 ng/g。同時(shí)，魚罐頭和肉類罐頭也是高殘留樣本。有研究報(bào)道在西班牙的魚罐頭樣品中BADGE·2H2O的最高檢出量為625 ng/g[14]；在豬肉罐頭中BADGE·HCl·H2O的檢出率為100%，最高檢出量為68.57 ng/g[15]。此外，植物性罐裝食品中也檢測到這類物質(zhì)。Alabi等[16]在蘆筍罐頭中檢出BADGE·2H2O和BADGE·HCl·H2O，含量分別為959 ng/g和533 ng/g。其檢出率和含量與動(dòng)物性罐裝食品相近，然而目前關(guān)于植物性罐裝食品中BDGEs的污染調(diào)查非常有限，因此亟需開展植物性罐裝食品中BDGEs的檢測研究。盡管歐盟禁止在食品接觸材料中使用BFDGE[12]，但在罐裝食品中仍檢測到BFDGE及其衍生物[15-17]。Alabi等[16]在罐頭食品中檢出BFDGE和BFDGE·2HCl，含量分別為21～314 ng/g和19～120 ng/g。除了食品容器的涂層，BDGEs也廣泛應(yīng)用于紡織品生產(chǎn)中。目前已在紡織品和嬰幼兒服裝中檢測到BADGE、BADGE·HCl·H2O、BADGE·2H2O、BFDGE和BFDGE·2H2O，其中BFDGE是顯著的污染物，含量為1.47～132 ng/g[18]。由于BDGEs的廣泛應(yīng)用，其在室內(nèi)空氣[19]、灰塵[20]、污泥[21]、污水[22]以及飲用水[23]等多種環(huán)境基質(zhì)中被檢測到。尤其需要關(guān)注的是，由于水管中環(huán)氧樹脂材料的浸出，飲用水中BADGE的最高檢出濃度為0.24 mg/mL，遠(yuǎn)高于污水(1.15 ng/mL)中的含量水平[22-23]。

人類通過膳食攝入、飲用水以及室內(nèi)灰塵等多種途徑暴露于BDGEs。目前已在人體尿液[5,24-26]、血清[27]、血漿[24,28]、脂肪[28]和母乳[29]樣品中檢測到這類物質(zhì)。其中，尿液中以BADGE和BADGE·2H2O為主，濃度分別為0.075～1.226 ng/mL和0.333～5.816 ng/mL[5,24-26]。與尿液研究結(jié)果類似，血清和血漿中也以BADGE和BADGE·2H2O為主[24,27-28]。Chang等[24]在血漿中檢測到303.593 ng/mL的BADGE·2H2O。另一項(xiàng)針對脂肪組織開展的研究則顯示BFDGE為主要?dú)埩粑铮瑱z出率為100%，含量為19.1～4 500 ng/g[28]。本課題組[29]報(bào)道了母乳中BDGEs的存在，其中BFDGE·2HCl的檢出率為65.0%，最高濃度為0.4～1.0 ng/mL。Wang等[5]研究顯示，中國成人尿液中BADGE及其衍生物的總濃度(1.36 ng/mL)低于美國(3 ng/mL)，可能是由于我國對罐頭食品的消費(fèi)量顯著低于美國。然而目前關(guān)于BDGEs的暴露水平研究集中在歐洲，尤其是西班牙；對于中國等罐頭食品消費(fèi)量低的地區(qū)調(diào)查有限。為了準(zhǔn)確評估這類物質(zhì)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，亟需開展更大范圍內(nèi)BDGEs的監(jiān)測。

2 BDGEs的分析方法

2.1 質(zhì)量控制

由于聚氯乙烯和環(huán)氧樹脂在實(shí)驗(yàn)室材料和設(shè)備中的使用，使得BDGEs在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中廣泛存在。因而在樣品收集、保存和處理過程中，均會帶來一定的BDGEs背景污染，影響目標(biāo)物質(zhì)的準(zhǔn)確定量。因此，建議使用玻璃容器儲存樣品，且先用溶劑清洗玻璃容器，并高溫(400～500 ℃)處理2～4 h。同時(shí)，應(yīng)對每個(gè)樣品批次進(jìn)行過程空白分析以說明背景污染。一項(xiàng)研究在過程空白中檢測到BADGE和BADGE·2H2O，濃度分別為0.02、0.03 ng/mL，遠(yuǎn)低于大多數(shù)尿樣中發(fā)現(xiàn)的濃度[5]。另一項(xiàng)研究在所有過程空白中檢測到BADGE·2H2O，其濃度低于LOQ[30]。針對濃度低于LOQ的背景污染，可將樣品中測量的濃度減去過程空白的檢出濃度，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的準(zhǔn)確定量。

2.2 樣品前處理

對于成分復(fù)雜、殘留量低的罐裝食品和生物基質(zhì)樣品，合適的前處理技術(shù)能夠有效提高目標(biāo)物的回收，降低基質(zhì)效應(yīng)，從而提高檢測靈敏度。目前常見的前處理方法包括液-液萃取法(LLE)、微波輔助萃取法(MAE)、加壓溶劑萃取法(PLE)、基于超分子溶劑(SUPRAS)的分散液-液微萃取法(DLLME)、固相萃取法(SPE)、固相微萃取法(SPME)以及QuEChERS法等。

2.2.1 罐裝食品溶劑萃取是從食品基質(zhì)中提取BDGEs最常用的技術(shù)。萃取溶劑包括戊烷[31]、乙腈[13-14,17,32-35]、正己烷[14-15,36-37]、丙酮[15,37]、乙酸乙酯[6,38]、二氯甲烷[39]、叔丁基甲醚[40-42]等。近年來MAE[15]、PLE[37]等技術(shù)也被用于罐裝食品中BDGEs的提取，利用其高溫高壓的特點(diǎn)可以高效提取目標(biāo)分析物。此外，作為有機(jī)溶劑的替代品，超分子溶劑也被用于提取BDGEs[16]。Alabi等[16]采用超分子溶劑(四氫呋喃-正辛醇)對豆類、蔬菜、水果、海鮮、肉制品和谷物等罐頭食品中的BDGEs進(jìn)行微萃取，回收率為80%～110%。

SPE是食品中BDGEs凈化最常用的技術(shù)。非選擇性吸附劑如C18[37,43-44]、Florisil[44]、NH2[37]、聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)[36]和Oasis HLB[34-35]已被單獨(dú)或組合用于SPE凈化。Casajuana等[44]采用C18柱對嬰兒配方奶粉進(jìn)行固相萃取，以實(shí)現(xiàn)奶粉中BADGE殘留的測定，先將奶粉樣品與甲醇混合并超聲處理以使乳液去穩(wěn)定化，然后用水稀釋以降低粘度，從而在SPE過程中獲得了更好的流速。

此外，QuEChERS由于快速、簡單、安全、成本低等特點(diǎn)已被應(yīng)用于金槍魚罐頭[32]、牛奶[17]及乳制品[13]中BDGEs的分析。Cheng等[13]利用乙腈和1%乙酸萃取分析物，由于C18對去除脂質(zhì)和無極性干擾物特別有效，而PSA通常用于去除大部分糖、有機(jī)酸和極性干擾，因此采用不同濃度的C18和PSA進(jìn)行純化，可得到更清潔的萃取物，該方法的回收率為88.2%～108.2%。

2.2.2 生物基質(zhì)人體生物樣本中BDGEs的檢測主要集中在尿液，此外血清、血漿、母乳和脂肪組織亦有報(bào)道。對于生物樣品(如尿液、血清和血漿)，一般采用乙酸乙酯多次萃取，經(jīng)水洗滌后進(jìn)行測定[5,25-26,28]。用乙酸乙酯-正己烷混合物萃取一些BDGEs的回收率很低(例如BADGE·2H2O為51%)[24]。針對內(nèi)源性基質(zhì)干擾(即脂肪和蛋白質(zhì))較強(qiáng)的脂肪組織和母乳則需要更復(fù)雜的前處理方法，從基體中萃取分析物后需要凈化萃取物。常用的脫脂方式包括正己烷萃取除脂和冷凍除脂。本課題組的研究表明，冷凍除脂效果優(yōu)于正己烷；母乳經(jīng)乙腈提取，-20 ℃冷凍除脂，PRiME HLB進(jìn)一步凈化后，9種BDGEs的回收率為71.33%～114.33%[29]。另一項(xiàng)研究則用丙酮對脂肪組織進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀，甲醇洗滌萃取液，冷凍除脂后9種BDGEs的回收率為98%～125%[28]。此外，部分研究還使用β-葡萄糖醛酸酶/芳香劑硫酸酯復(fù)合酶進(jìn)行酶解，開展尿液中BADGEs的生物監(jiān)測[5,25-26]。但是，在研究其他生物體液時(shí)均未采用酶解[24,27-29]。目前，由于缺乏生物體內(nèi)BDGEs的代謝轉(zhuǎn)化研究，BDGEs是否發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化及其共軛形式未知，亟需開展此方面的研究以準(zhǔn)確評價(jià)其生物毒性和人體暴露水平。

2.3 檢測方法

液相色譜-熒光聯(lián)用技術(shù)(LC-FD)是測定包裝食品中BDGEs的常用檢測方法，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)也有應(yīng)用。然而，由于GC-MS分析的衍生化步驟和LC-FD分析的低靈敏度，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)現(xiàn)已成為分離和定量BDGEs的主流方法。除常用的檢測方法外，熒光偏振法(Fluorescence polarization，F(xiàn)P)[45-46]也被應(yīng)用于包裝食品中BDGEs的檢測。表1、表2總結(jié)了罐裝食品和生物基質(zhì)中BDGEs的色譜分析和檢測條件。

2.3.1 LC-FD法BDGEs在液相色譜的常用流動(dòng)相(水、乙腈和甲醇)中均表現(xiàn)出天然熒光，因此LC-FD非常適合于測定包裝食品中BDGEs。Lapviboonsuk等[32]采用LC-FD法檢測金槍魚罐頭中6種BDGEs，待測物在0.05～20 mg/kg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，方法檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別為0.01～0.02 mg/kg和0.03～0.05 mg/kg。該方法省時(shí)、省力、成本低，但靈敏度較差，不適用于生物樣品中痕量BDGEs的測定。

2.3.2 GC-MS法GC-MS分析需將目標(biāo)化合物乙?；蚬柰榛苌?，之后在電子沖擊電離和單離子監(jiān)測模式下進(jìn)行質(zhì)譜檢測。通過衍生化有利于化合物中游離的羥基官能團(tuán)形成尖銳的峰形，從而提高了其分離能力、靈敏度和準(zhǔn)確度。Casajuana等[44]采用GC-MS法測定5種不同加工方式的全脂牛奶中BADGE殘留，待測物在0.002～4 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，LOD為0.36 μg/L。

2.3.3 LC-MS法BDGEs的LC-MS分析過程通常包括反相C18柱分離、大氣壓電離(API)和多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)下的質(zhì)譜檢測。在API接口中，電噴霧電離(ESI)通常是首選，因?yàn)樗瘸夯瘜W(xué)電離(APCI)具有更好的靈敏度。但Pardo等[37]利用APCI實(shí)現(xiàn)了魚和肉罐頭中BDGEs的高靈敏度檢測，LOQ低至0.8～3.5 ng/g。

在流動(dòng)相(通常為甲醇-水)中添加甲酸銨[6,13-14]或乙酸銨緩沖液[5,24-26,28-29,40,42]可以促進(jìn)BDGEs在電噴霧正離子源(ESI+)下形成[M+NH4]+，從而提高BDGEs的響應(yīng)。本課題組[29]首次報(bào)道了母乳中BDGEs的檢測，以乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相，母乳樣品經(jīng)提取、凈化后采用LC-MS測定。待測物在0.10～50 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，LOD和LOQ分別為0.033～0.50 ng/mL和0.10～1.5 ng/mL。

在化學(xué)生產(chǎn)BFDGE的過程中，苯酚和甲醛的縮合可能發(fā)生在苯酚的鄰位和對位，因此該制劑由ortho-ortho、ortho-para、para-para 3種異構(gòu)體組成。類似的，所有BFDGE衍生物也是3種異構(gòu)體的混合物[47]。因此，相比于其他BDGEs，BFDGE及其衍生物的色譜分離成為儀器分析的難點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，通過優(yōu)化色譜柱和流動(dòng)相條件可以獲得滿意的同分異構(gòu)體峰分辨率。Cheng等[13]比較了ZORBAX SB C18柱和ACQUITY UPLC BEH C18柱的分離性能，發(fā)現(xiàn)BEH C18柱對BFDGE異構(gòu)體的分辨率較高。此發(fā)現(xiàn)與本課題組一致[29]。通常，選擇甲醇或乙腈作為有機(jī)改性劑測定BDGEs。研究表明，乙腈-水比甲醇-水對BFDGE及其衍生物的同分異構(gòu)體的洗脫能力更強(qiáng)，分離效果更好[6,13,16,29]。由于缺乏單體異構(gòu)體的標(biāo)準(zhǔn)品，大多數(shù)研究僅對3種異構(gòu)體的總和進(jìn)行了量化[6,13-15,28-29]。然而，Alabi等[16]發(fā)現(xiàn)在不同食品中BFDGE和BFDGE·2HCl的同分異構(gòu)體分布不同。由于異構(gòu)體可能具有不同的毒性，這些初步研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了對BFDGE及其衍生物的異構(gòu)體形式進(jìn)行個(gè)體化測定的必要性。

表1 罐裝食品中BDGEs的分析方法Table 1 Analytical methods of BDGEs in canned foods

(續(xù)表1)

AnalyteSample/dosagePretreatmentChromatographic columnMobile phaseDetectionLOD(ng/g)/recoveryReferenceBADGE,BADGE·H2O,BADGE·2H2O等魚和肉罐頭/1.25 g二氯甲烷(2×30 mL)提取,凝膠滲透色譜(GPC)凈化LiChrospher250-4乙腈-水LC-FD3/75%～92%[39]BADGE,BADGE·H2O,BADGE·2H2O等蔬菜罐頭、水果、魚、谷物和肉類/0.2 g基于SUPRAS(0.6 mL)的新型分散液液微萃取法(DLLME)Ultrabase C18乙腈-水LC-FD0.3～1.0/80%～107%[16]BADGE,BADGE·2H2O,BADGE·2HCl等豌豆、金槍魚、橄欖、玉米、朝鮮薊罐頭和棕櫚心罐頭/10 mL樣品+氯化鈉(0.75 g),固相微萃取(SPME),解吸:0.15 mL 流動(dòng)相 或置于SPME-LC接口的解吸室XTerra MS C18乙腈-水LC-FD0.7～2.4a/7%～65%[49]BADGE牛奶/10 mL樣品+甲醇(10 mL),超聲后用C18柱固相萃取,Florisil SPE凈化HP-5MS-GC-EI-MS0.36a/119%[44]BADGE,BFDGE牛奶/10 mL樣品+甲醇(10 mL),超聲后用C18柱固相萃取SynergiFusion-RP乙腈-水LC-FD3.0～4.2a/94.5%～97.9%[43]BADGE,BADGE·2H2O,BFDGE等牛奶/5±0.2 g乙腈(5 mL,含0.1%甲酸)提取,無水硫酸鎂除水,上清液用QuECh-ERS凈化劑(0.1 mg PSA和0.1 mg C18)凈化Xcharge C18乙腈-0.1%甲酸水溶液LC-FD1.0～3.1/75.82%～93.86%[17]BADGE,BADGE·H2O,BADGE·2H2O等乳制品/5 g乙腈(15 mL,含1%乙酸)提取,無水硫酸鎂除水,上清液用QuECh-ERS凈化劑(390 mg PSA和190 mg C18)凈化ACOUITYUPLC BEH C18甲醇-0.001 mmol/L甲酸銨UHPLC-ESI+-MS/MS0.008～0.2/94.7%～103.4%[13]BADGE,BADGE·H2O,BADGE·HCl·H2O等金槍魚和生豆類罐頭/(3±0.01) g乙酸乙酯(6 mL)提取,聚四氟乙烯0.22 μm過濾器去除雜質(zhì)Synergi Hydro-RP C18乙腈-水LC-UV0.24～1.22/96.31%～98.76%[38]BADGE,BFDGE金槍魚罐頭二氯甲烷提取(8 mL),正己烷凈化(1 mL)FP0.10～0.49b/77.3%～87.9%[46]BADGE,BADGE·H2O,BADGE·HCl·H2O等肉和水果罐頭(2 g)叔丁基甲醚和甲醇提取,HLB固相萃取柱凈化CORTECS UPLC C18甲醇-5 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸水LC-ESI+-MS/MS0.1～0.5/>75%[40]BADGE,BADGE·H2O,BADGE·HCl·H2O等肉類罐頭(2 g)叔丁基甲醚和甲醇提取,Oasis HLB凈化Eclipse XDB-C18甲醇-5 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸水LC-ESI+-MS/MS10/79.6%～100.9%[41]

(續(xù)表1)

AnalyteSample/dosagePretreatmentChromatographic columnMobile phaseDetectionLOD(ng/g)/recoveryReferenceBADGE,BADGE·H2O,BADGE·HCl·H2O等魚和肉罐頭(2 g)叔丁基甲醚和甲醇提取,正己烷脫脂,HLB固相萃取柱凈化ACQUITY UPLC BEH C18甲醇-5 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸水LC-ESI+-MS/MS0.17/78.5%～102.1%[42]

unit：a.ng/mL，b.mg/L

表2 生物基質(zhì)中BDGEs的分析方法Table 2 Analytical methods of BDGEs in biological matrices

n.r.:not reported；unit：a.ng/g

3 結(jié)論與展望

綜上所述，目前國內(nèi)外對BDGEs的研究主要聚焦罐裝動(dòng)物性食品以及少量生物樣品，考慮到這類物質(zhì)在環(huán)境中的殘留，以及我國對罐裝食品的消費(fèi)量顯著低于歐美等國家，有必要進(jìn)一步考察非罐裝類食品中BDGEs的殘留，尤其應(yīng)增加植物性食品的研究。與BPA相比，人體組織中BDGEs(如BFDGE、BADGE·2H2O)的濃度更高，亟需完善BDGEs的生物監(jiān)測，包括對血清、血漿和母乳的監(jiān)測。因此，研發(fā)一系列簡便、快速、經(jīng)濟(jì)和更高靈敏度的分析方法，以實(shí)現(xiàn)大范圍內(nèi)、各種基質(zhì)中BDGEs的檢測是未來的發(fā)展方向。此外，關(guān)于BDGEs在生物體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化研究非常匱乏，因此亟需開展這方面的研究以準(zhǔn)確評價(jià)其生物毒性和人體暴露水平。