生物堿的高效液相色譜分離分析與純化制備研究進展

王 榮，劉艷芳，王超然，郭志謀，梁鑫淼

(1.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 分離分析重點實驗室，遼寧 大連 116023；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

生物堿是天然產(chǎn)物中藥用活性和成藥性較好的一類化合物，據(jù)統(tǒng)計，美國FDA批準的1 000多種小分子藥物中，堿性藥物的比例超過60%[1]。在目前已發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物中，生物堿在總數(shù)上雖然只占16%，但在具有重要藥理活性的天然產(chǎn)物中占50%，是天然產(chǎn)物新藥開發(fā)中最具潛力的一類化合物[2]。

從19世紀初開始，植物化學(xué)家就一直致力于生物堿的純化制備，通過溶劑萃取、硅膠柱層析、結(jié)晶等植化手段獲得了大量生物堿，并開發(fā)出眾多的堿性藥物[2-4]。但由于傳統(tǒng)技術(shù)的局限，對生物堿分離純化往往收率很低，特別是含量較低的成分極易丟失，還有許多結(jié)構(gòu)類似的生物堿，也因為分離度不夠而無法獲得純品。高效液相色譜是在傳統(tǒng)柱層析基礎(chǔ)上，采用細顆粒的球形硅膠基質(zhì)鍵合固定相和高壓泵輸液方式發(fā)展起來的具有柱效高、分離能力強、重復(fù)性好、速度快等系列優(yōu)點的現(xiàn)代色譜分離方法，目前已成為藥物分析、食品科學(xué)、生命科學(xué)等學(xué)科和產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域不可或缺的重要分析工具[5]。隨著分析型高效液相色譜的普及，制備型高效液相色譜也得到了越來越多的發(fā)展[6]。在天然產(chǎn)物領(lǐng)域，制備型高效液相色譜被廣泛應(yīng)用于黃酮、皂苷、生物堿等成分的純化分離[7-9]，特別是在結(jié)構(gòu)類似物的分離中起到了重要作用，直接推動了許多新化合物的發(fā)現(xiàn)[10-14]。

然而相比于其他類型天然產(chǎn)物，生物堿的分離往往會出現(xiàn)峰形拖尾和載樣量特別低的情況，不僅在傳統(tǒng)硅膠柱上死吸附嚴重，在高效制備填料上也依然是令人頭疼的問題[15-16]。由于峰形拖尾，生物堿往往峰寬較寬，峰高較矮，檢測靈敏度較差，而提高進樣量又會導(dǎo)致色譜峰拖尾加劇，柱效迅速下降，相鄰的成分更易被拖尾峰包裹，這些問題給生物堿的分離分析和純化制備帶來了許多困難。

針對像生物堿這樣的堿性化合物的特殊色譜保留行為，研究者們從流動相和固定相上作了一系列探索并取得了一定進展。本文將主要從堿性化合物的高效液相色譜峰形拖尾的形成機理和相應(yīng)改善方法，以及實際應(yīng)用，生物堿的分離分析和純化制備進展等方面進行綜述。

1 堿性化合物峰形拖尾的內(nèi)在機理討論

在過去幾十年中，許多研究者對堿性化合物的色譜峰拖尾行為展開了研究并提出了相應(yīng)的觀點，其中主要有硅醇基理論、帶電溶質(zhì)相互排斥理論和多位點吸附理論。

1.1 硅醇基理論

圖1 中性化合物和堿性化合物的典型色譜載樣行為差異[22]Fig.1 Distinct overloading behaviors of neutral and basic compounds on typical RPLC[22]

硅醇基理論[17]是最早用于解釋堿性化合物在硅膠基質(zhì)固定相上拖尾現(xiàn)象的理論。該理論認為，硅膠基質(zhì)表面殘留的酸性硅醇基與堿性化合物之間的離子交換作用，是導(dǎo)致堿性化合物拖尾的主要原因。在C18等反相填料的鍵合過程中，由于空間位阻的存在，硅醇基往往不能完全反應(yīng)，即使采用短鏈硅烷試劑進行封尾，仍有大量硅醇基未反應(yīng)[15]。特別是在早期色譜填料制備過程中，使用了Type A類硅膠基質(zhì)，存在較多的金屬離子殘留，會進一步激發(fā)硅醇基的酸性，進而導(dǎo)致堿性化合物拖尾[18]。為此，色譜填料和色譜柱生產(chǎn)廠商通過改進球形硅膠基質(zhì)的生產(chǎn)工藝，并發(fā)展了多種封尾技術(shù)[19-20]。隨著高純硅膠(純度>99.99%)和封尾技術(shù)的普遍應(yīng)用，硅醇基的活性大大降低，如Neue等[21]以鋰離子(Li+)的保留為指標對Waters公司的多種硅膠基質(zhì)及其C18鍵合色譜柱的硅醇基酸性進行評價時發(fā)現(xiàn)，在pH 3.0～7.0范圍內(nèi)，高純硅膠基質(zhì)反相色譜柱(Symmertry C18和XTerra MS C18)對鋰離子均無保留，說明其陽離子交換作用在酸性條件下幾乎可以忽略。但在實際應(yīng)用中，即使在此類高純硅膠色譜柱上開發(fā)堿性化合物的分析方法，仍經(jīng)常需在流動相中添加磷酸鹽等緩沖鹽或其他試劑來改善峰形。另外，研究發(fā)現(xiàn)在不含硅醇基的聚合物色譜柱上，離子化堿性化合物依然出現(xiàn)了拖尾和易過載現(xiàn)象[22](圖1)，而且在硅膠基質(zhì)的反相色譜柱上，強酸性化合物也會表現(xiàn)出與堿性化合物類似的峰形拖尾和展寬現(xiàn)象[23]，表明生物堿的峰形拖尾顯然還存在硅醇基以外的因素。

1.2 帶電溶質(zhì)相互排斥理論

為進一步探究生物堿拖尾的機理，研究者們提出了帶電溶質(zhì)相互排斥理論[23]并采用單分子層Langmuir吸附模型作進一步驗證和闡述[24]。該理論認為，相比于中性化合物，帶有同種電荷的溶質(zhì)在固定相表面存在相互排斥作用，使得固定相表面能夠被吸附的位點數(shù)量減少，從而導(dǎo)致了其載樣量的下降。這種理論能夠在一定程度上解釋堿性化合物在聚合物色譜柱的色譜保留行為，以及強酸性化合物在硅膠基質(zhì)反相色譜保留行為。按照該理論，樣品在非離子形態(tài)時具有最高的載樣量，而在離子狀態(tài)時載樣量會下降。然而，此前的熱力學(xué)研究表明離子化合物與中性化合物的總吸附容量接近[25]，這與單分子層的Langmuir模型矛盾，因此，離子型化合物的拖尾還存在其他因素。

1.3 多位點吸附理論

多位點吸附模型[26-27]是更準確嚴謹?shù)慕忉岆x子型化合物拖尾的理論，相比于帶電溶質(zhì)相互排斥理論的單分子層吸附模型，該理論認為固定相表面還存在其他吸附能量不同的位點，這一方面解釋了此前離子型化合物與中性化合物熱力學(xué)容量相近的結(jié)果，另一方面提供了離子型化合物的動力學(xué)解釋。該理論的主要觀點是，堿性化合物的保留是多種吸附能量不同位點的共同作用結(jié)果，堿性化合物總是先占據(jù)數(shù)量較少的高能吸附位點，當(dāng)高能吸附位點飽和后，才會去占據(jù)數(shù)量較少的低能吸附位點。相比于中性化合物，離子型化合物間的高低能位點間的能量差更大，由此可能導(dǎo)致離子型化合物傳質(zhì)均一性較差，并最終反映在色譜分離上更易出現(xiàn)過載和拖尾的現(xiàn)象。這些不同能量的吸附位點與他們所處的化學(xué)環(huán)境相關(guān)，其中少量的高能位點位于C18鏈內(nèi)層，而大量的低能位點存在于C18鏈表層。該理論通過吸附等溫線的測定，推導(dǎo)出了合適的吸附模型，并從大量的色譜柱案例得到了驗證，較為可靠，但到底為何會產(chǎn)生這種多位點的吸附，目前仍未有明確的結(jié)論，主要歸因于材料表面的不均一性[28]。該理論主要由Guichon等[26-28]提出并反復(fù)驗證，但國內(nèi)關(guān)注者較少，國際上也較少有人據(jù)此提出相應(yīng)的解決方案。按照該理論，降低生物堿對高能位點的吸附，是改善拖尾的一種手段。

綜上所述，堿性化合物在硅膠基質(zhì)色譜柱上的特殊保留行為機理存在較復(fù)雜的因素，相關(guān)的機理探討仍在不斷完善中。

2 改善生物堿拖尾的方法

基于上述堿性化合物峰形拖尾問題的機理探討，研究者們從流動相和固定相兩方面提出了一系列改善措施，這些方法同樣在生物堿的分離分析和純化制備中得到了很好的應(yīng)用。

2.1 流動相方面

為減少硅醇基和堿性化合物的離子交換作用，可以使用低pH值流動相以抑制硅醇基的電離，或使用高pH值流動相抑制生物堿的電離[29]；也可加入有機胺改性劑(如三乙胺[30])競爭占據(jù)離子化硅醇基，從而阻斷堿性化合物與硅醇基間的相互作用。此外，還可通過添加高濃度緩沖鹽[31-32]、離子對試劑[33]或離子液體[34]，以緩和溶質(zhì)間的相互排斥，減少溶質(zhì)與硅羥基的相互作用。這些添加劑的使用對分析水平上峰形的改善起到了一定的作用，但高濃度緩沖鹽、離子對試劑和離子液體會導(dǎo)致更長的柱平衡和柱清洗時間，增大基線噪音，還會腐蝕儀器，影響數(shù)據(jù)質(zhì)量。更重要的是，單純改變流動相條件，并不能完全解決制備水平上的峰形拖尾問題，如低pH值流動相雖然抑制了硅醇基的電離，但會促進生物堿的電離，當(dāng)載樣量增加時，峰形依然會發(fā)生拖尾；此外，高pH值流動相雖可抑制生物堿的電離，但會造成硅膠的溶解，因此還需配合耐堿性的色譜柱。

2.2 固定相方面

通過改進固定相結(jié)構(gòu)來克服堿性化合物拖尾是近些年研究的熱點。隨著硅膠制備工藝的發(fā)展，基于高純硅膠的色譜柱逐漸占據(jù)了主流。利用這類低硅醇基活性的色譜柱對堿性化合物進行分析，峰形優(yōu)于早期硅膠。此外，通過一定程度的封尾或極性基團修飾，還可以進一步屏蔽活性硅醇基，從而獲得更好的峰形。這類色譜柱的代表如Waters公司的Symmetry Shield RP18等。然而，這一類色譜柱通常只能在分析水平獲得較好的峰形，載樣量有限，且其pH值耐受范圍有限。

為滿足堿性化合物在高pH值條件下分析的需求，各色譜柱廠家發(fā)展了一些更為先進的制造技術(shù)。如Agilent公司采用雙封尾技術(shù)，研制了Zorbax Extend C18色譜柱，可在堿性條件下較好地屏蔽硅醇基；Merck公司的Lichrospher RP-select B色譜柱，采用高密度鍵合方式，降低硅醇基暴露在流動相中的幾率；迪馬公司的Spursil C18色譜柱，在硅膠制造的最后階段，在其表面移植了一層硅膠-有機層，從而保護了內(nèi)部的硅醇基，也可在堿性條件下使用。除此之外，Waters公司還提出了有機-無機雜化硅膠的概念，并推出了系列色譜柱，顯著延長了色譜柱在堿性條件下的使用壽命，代表性色譜柱如XBridge系列[35-36]。

需要指出的是，高pH值耐受色譜柱的發(fā)展，雖然一定程度滿足了弱堿性及中等堿性化合物的分離和制備，但由于堿性非常強的化合物(如季銨型生物堿等)即使在堿性條件下仍可保持正離子狀態(tài)，而硅醇基由于在堿性條件下電離出負電荷，從而使生物堿與硅醇基間的離子交換作用加劇，導(dǎo)致堿性化合物的峰形反而更差[37]。

圖2 XCharge C18色譜柱的表面化學(xué)結(jié)構(gòu)[39]Fig.2 Chemical structure of the XCharge C18 column surface[39]

近年來，研究者們還設(shè)計了一些表面正電荷修飾的色譜柱，如Waters公司研制的表面帶電雜化色譜柱CSH系列[38]，以及本課題組設(shè)計的XCharge C18色譜柱[39-40](圖2)。這類色譜柱改善堿性化合物峰形的機理在于色譜柱表面正電荷與堿性化合物溶質(zhì)間的靜電排斥作用，阻止了堿性化合物向硅醇基的靠近，從而改善了峰形[19]。也可用多位點吸附理論對其進行解釋：表面正電荷的存在通過離子排斥作用，使堿性化合物不能接近在內(nèi)層的高能吸附位點，而傾向于在C18鏈上的低能吸附位點吸附，從而使吸附和脫附變得均一同步，峰形也得到了改善[41]。相比于其他種類色譜柱，表面正電荷色譜柱優(yōu)勢明顯：首先，它們對大多數(shù)類型堿性化合物均有較好的分離效果，即使是電荷性較強的季銨型生物堿，也可獲得較好的峰形；其次，無需使用高濃度緩沖鹽或離子對試劑，在低離子強度的揮發(fā)性緩沖鹽或者簡單的酸性條件即可獲得較好的峰形，適合質(zhì)譜分析；此外，在高載樣量條件下，堿性化合物也能保持優(yōu)異的峰形，十分適合制備。利用該類型色譜柱XCharge C18對富含季銨型生物堿的延胡索提取物進行分析，在簡單的甲酸體系下，即可獲得優(yōu)異的峰形，而同條件下采用其他色譜柱分離時，峰形依舊較差(圖3)。盡管通過調(diào)節(jié)流動相添加劑如三乙胺或緩沖鹽，生物堿在其他類型色譜柱也能達到較好的分離效果，但是這些添加劑往往不適合質(zhì)譜分析，或者對載樣量改善有限，不適合制備。

圖3 延胡索提取物在不同反相色譜柱上的色譜圖比較[40]Fig.3 Comparison of chromatograms of Corydalis yanhusuo extract on different reversed phase columns[40]a,b:XCharge C18 column；c：Zorbax Eclipse 5 μm XDB C18；d:Atlantis 5 μm T3 C18；e:XBridge 3.5 μm C18；f:Xterra 5 μm C18；g:inspire 5 μm C18；h:spursil EP 5 μm C18；i:TSKgel 3 μm ODS-100 V；j:self-made 5 μm C18/C1;mobile phase:0.1%formic acid water(A)-CAN(B)；gradient for XCharge C18:0-30 min,0%-30%B；gradient for commercial columns:0-30 min,5%-35%B；30-40 min,35%-60%B；injection volume:(a,c-j) 50 μL and(b) 100 μL；flow rate:1.0 mL/min；column temperature:30 ℃；UV detection:254 nm

為了提供不同的選擇性，包括本課題組在內(nèi)的研究人員，還發(fā)展了離子交換色譜[42-43]、反相/離子交換混合色譜[44]。與傳統(tǒng)的反相色譜相比，離子交換色譜和反相/離子交換混合作用色譜也能夠為生物堿的分離提供良好的峰形和較高的載樣量。這一類色譜柱的不足之處在于使用時通常需加入高濃度緩沖鹽，會增加制備后處理的工作量。

3 生物堿的高效液相色譜分離分析方法

目前，生物堿的高效液相色譜分析方法主要包括反相色譜、離子交換色譜、親水作用色譜以及相應(yīng)的多維色譜。

3.1 反相色譜法

反相液相色譜是分析生物堿的最常用方法，該法依靠固定相和流動相間的疏水作用對中等極性和弱極性化合物進行分離?？晒┥飰A反相分析的固定相和流動相體系眾多，因此要注意它們間的相互配合以達到最優(yōu)的分離效果。如使用常規(guī)C18色譜柱對生物堿進行分析，則需要調(diào)節(jié)流動相添加劑以改善生物堿的峰形。鄒翔等[45]采用Diamonsil C18色譜柱，添加三乙胺并用磷酸調(diào)至pH 3.0，分析了白屈菜不同器官中生物堿的種類及質(zhì)量占比，獲得了較好的線性關(guān)系、精密度和回收率。此外，近些年來，離子液體用作流動相添加劑來改善生物堿峰形多有報道，如朱益雷等[46]以1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽為流動相添加劑，采用Ultimate XB-C18色譜柱，測定了香連丸中小檗堿、藥根堿和巴馬汀3種主要季銨型生物堿含量，并獲得了比三乙胺更好的結(jié)果。

當(dāng)采用耐堿性的色譜柱時，流動相的pH值則可以調(diào)節(jié)至更高水平。林宏英等[47]采用Zorbax Extend-C18色譜柱，以醋酸銨為添加劑，并用氨水調(diào)至pH 8.0，質(zhì)譜法鑒定了13個生物堿成分，并比較了川烏加熱前后生物堿的變化，具有較高的準確度和靈敏度。

采用表面正電荷色譜柱并配合簡單的低離子強度添加劑是近年來發(fā)展起來的一種新的分析方法。采用本課題組自主研發(fā)的XCharge C18色譜柱，Long等[48]在0.1%甲酸的條件下，采用HPLC/CAD對貝母中異構(gòu)體生物堿進行定量分析，獲得了良好的對稱因子和靈敏度。Qing等[49]利用XCharge C18色譜柱對博落回生物堿進行液質(zhì)聯(lián)用分析，獲得了良好的峰形，將該方法應(yīng)用于不同基源藥材的區(qū)分，也獲得了較好的結(jié)果。Le等[50]采用XSelect CSH C18色譜柱，在10 mmol/L甲酸銨條件下，對白毛莨中的生物堿進行了LC-ESI MSn分析，取得了良好的峰形，共鑒定出28個生物堿，其中包括一個新化合物和21個首次在該植物中被鑒定出來的化合物，該結(jié)果體現(xiàn)了優(yōu)異的色譜峰形對質(zhì)譜鑒定的重要性。

3.2 離子交換色譜法

與中等極性和弱極性生物堿相比，強極性生物堿在反相模式下的保留更差，分離更加困難，可采用陽離子交換(SCX)色譜法進行分析。劉瓊等[51]選用Spherisorb SCX色譜柱，以不同離子濃度和pH值的磷酸鹽溶液為流動相，分別對麻黃堿類、鮮益母草膠囊中的水蘇堿、使君子藥材中的胡蘆巴堿、半夏露糖漿中的麻黃堿與偽麻黃堿進行了分析。本課題組Long等[43,52]評價了鹽種類、鹽濃度、pH值和乙腈濃度對幾種強極性生物堿在SCX色譜柱上的峰寬和對稱性的影響，并對其保留機理進行了討論。

圖4 親水作用色譜對唐古特山莨菪餾分的分析[55]Fig.4 Analysis of alkaloid fractions from S.tangutica by hydrophilic chromatography[55]mobile phase:acetonitrile(A)-100 mmol/L NH4Cl(pH 6.8)(B)-water(C)；wavelength:210 nm；flow rate:1 mL/min；column temperature:30 ℃；gradient:0-30 min,90%-80%A,10%B,0%-10%C

3.3 親水作用色譜法

親水作用色譜能有效保留反相色譜中保留較差的強極性化合物，目前已被廣泛應(yīng)用于強極性生物堿成分的分析中。Taujenis等[53]用HILIC-MS/MS測定了煙草中4種生物堿，獲得了較好的定量下限、回收率和準確度。卓榮杰等[54]采用Atlantis HILIC Silica色譜柱分析了葫蘆巴藥材中的葫蘆巴堿，獲得了良好的分離效果和定量結(jié)果。本課題組龍珍[55]利用自制的親水柱TE-Cys對山莨菪中強極性餾分進行了分析，樣品得到了較好的保留和較好的峰形(圖4)。

圖5 SCX/XCharge C18二維體系分離分析山莨菪生物堿餾分[59]Fig.5 Analysis of alkaloid fractions from S.tangutica by SCX/XCharge C18[59]XCharge C18 conditions:acetonitrile(A)-0.1%formic acid(B)；gradient:0-30 min,5%-15%A,95%-75%B；SCX conditions:acetonitrile(A)-100 mmol/L sodium dihydrogen phosphate(pH 2.8)(B)-water(C)；wavelength:210 nm；flow rate:1 mL/min；column temperature:30 ℃；gradient:0-20 min,15%-50%A,30%-30%B,55%-20%C

圖6 XCharge C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)上延胡索生物堿樣品的4個代表性制備色譜圖[38]Fig.6 Four representative preparative chromatograms of the crude alkaloids sample on the XCharge C18 column(150 mm×4.6 mm,5 μm)[38]conditions:ACN(A)-0.1%aqueous formic acid(B)；gradient:0-30 min,5%-15%A；30-40 min,15%-60%A；flow rate:1.0 mL/min；UV wavelength:320 nm；column temperature:30 ℃；ioading amount:10 mg;injections:5th,10th,15thand 20th from top to down

3.4 多維色譜法

由于天然產(chǎn)物組成復(fù)雜，單維色譜中，大量的重疊峰會給定性定量帶來不利的影響。相比于一維色譜，二維色譜能夠為復(fù)雜體系提供更好的峰容量和更高的分辨率，是復(fù)雜體系分離分析的重要工具[56]。在已有的生物堿分離體系中，表面正電荷色譜柱憑借分離生物堿的優(yōu)異性能，常被用于二維體系的構(gòu)建。Wei等[57]發(fā)展了pH值正交的全二維反相色譜法用于延胡索生物堿的分析，第一維采用了峰容量較低的耐堿性色譜柱XBridge RP C18，以1%氨水為添加劑，第二維采用了峰容量更高的表面正電荷修飾的XCharge C18色譜柱，以0.15%甲酸為添加劑，該二維體系獲得了9 095的峰容量。利用本課題組發(fā)展的一系列色譜柱，張敬彩[58]利用反相色譜、離子交換色譜和混合色譜不同的作用機理，針對千層塔生物堿提取物，分別構(gòu)建了XCharge C18/Xaqua C3、XCharge C18/XCharge SCX、XCharge C18/C18WCX 3種不同模式的二維分離方法，并獲得了較好的正交度。本課題組Long等[59]利用反相色譜、離子交換色譜、親水色譜的不同機理，選擇結(jié)構(gòu)類型不同的21種標準品，采用實驗室自制的系列色譜柱和Waters公司的XBridge C18，構(gòu)建并評價了XCharge C18/SCX、XCharge C18/XBridge C18、XCharge C18/TE-Cys 3種二維體系，并最終將XCharge C18/SCX二維體系用于山莨菪生物堿的分析和制備(圖5)。高正交二維分離體系的建立是微量、難分離的生物堿化合物高效制備的前提和基礎(chǔ)。

4 生物堿的高效液相色譜純化制備方法

生物堿純化制備的目的在于高效率地獲得結(jié)構(gòu)新穎的新化合物，為新藥研發(fā)提供先導(dǎo)化合物。生物堿的分離在傳統(tǒng)植化領(lǐng)域一直是較難的對象，特別是死吸附會導(dǎo)致最終樣品的收率低。隨著高速逆流色譜的發(fā)展，很多學(xué)者也嘗試采用該方法來純化生物堿類樣品，并得到了較高的回收率[60-63]。但高速逆流色譜的分辨率較低，一次通常只能用于幾個主要成分的制備，對于生物堿樣品的系統(tǒng)分離，特別是含量較低的生物堿的獲得還存在較大困難。而在普通制備液相色譜中，增加上樣量后，生物堿的峰形拖尾加劇且極易降低分離度。而本課題組針對性發(fā)展的系列填料，不僅在生物堿的分析中取得了很好的應(yīng)用，還可用于天然生物堿的純化制備中，為微量、難分離的生物堿制備提供了一種解決方案。

本課題組Wang等[38]采用表面正電荷XCharge C18色譜柱，以0.1%甲酸為添加劑，在分析柱上即完成了延胡索提取物中2種生物堿的純化，具有較高的載樣量、回收率和重復(fù)性(圖6)；此后，他們將該體系進一步放大，最終發(fā)現(xiàn)了具有鎮(zhèn)痛作用的去氫紫堇球堿[64]。此外，采用強陽離子交換柱(SCX)作為第二維純化的方法，從延胡索提取物中獲得了κ-阿片受體激動劑N-甲基四氫小檗堿[65]。

本課題組Long等采用強陽離子交換柱(SCX)和表面正電荷XCharge C18色譜柱，從唐古特山莨菪中分離出了包含新化合物在內(nèi)的一系列純度較高的化合物[59,66]。將該方法應(yīng)用到唐古特山莨菪活性導(dǎo)向的化合物追蹤中，Du等[67]發(fā)現(xiàn)了6個具有M3受體拮抗活性的托品烷類生物堿，其中也包括新化合物，表明該方法在發(fā)現(xiàn)未知活性化合物方面潛力巨大。

Li等[68]采用正相-反相二維色譜對蓽拔中生物堿進行了純化制備，以正相作為第一維，采用本課題組發(fā)展的XAmide柱，反相作為第二維，采用Waters公司的Atlantis T3柱，該二維體系獲得了58.3%的正交度，分離并鑒定出28個純度較高的酰胺類生物堿，部分生物堿的質(zhì)量達到克級。

在上述生物堿的正交分離系統(tǒng)中，兩維均采用了不同的機理，正交性好，使二維系統(tǒng)的分離能力得到較充分地發(fā)揮，因而可以高效率地制備出難分離的生物堿化合物。

5 展 望

高效液相色譜技術(shù)在生物堿的分離分析和純化制備中具有廣闊的發(fā)展前景。盡管生物堿的高效分離分析方法已經(jīng)取得了較大進步，但其高效液相色譜制備體系仍需不斷完善。針對生物堿的高效制備問題，設(shè)計和制備一些結(jié)構(gòu)不同的新型固定相，獲得優(yōu)異的峰形和載樣量仍然是生物堿純化制備的一個重要發(fā)展方向，比如：正相色譜與反相色譜具有很好的正交性，可作為生物堿正交分離方法的補充，然而在實際對生物堿的分離中，正相色譜重現(xiàn)性差，峰形易前展或拖尾，保留時間隨進樣量漂移，較少用于生物堿的制備。如果能夠解決正相色譜的這些問題，將可以為生物堿的制備體系提供很大的補充。此外，能夠用于強堿性生物堿的高效制備體系也比較缺乏，目前比較成熟的只有表面正電荷色譜柱體系，盡管陽離子交換SCX體系也可用于季銨型生物堿的制備，但該體系需使用大量的緩沖鹽。因此，需發(fā)展相應(yīng)的固定相，解決季銨型生物堿的正交分離問題。

綜上所述，制備型高效液相色譜的發(fā)展和推廣對加速天然生物堿的發(fā)現(xiàn)具有重大意義，多維正交分離的方式在復(fù)雜生物堿的分離上表現(xiàn)出良好的前景，相信隨著新技術(shù)和新方法的發(fā)展，高效液相色譜技術(shù)將在生物堿的分離制備領(lǐng)域具有更加廣闊的應(yīng)用空間。