HDAC抑制劑N2E誘導(dǎo)人肝星狀細(xì)胞LX-2凋亡作用的研究

王曉翔，岑梓文，馮冰虹

(廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

肝病為危害人類(lèi)健康的危險(xiǎn)因素之一，全球每年有超過(guò)100萬(wàn)人死于病毒性肝炎[1]，許多急性肝炎患者和肝炎病毒攜帶者可轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝谆颊?，慢性肝炎部分可發(fā)展為肝硬化，最終導(dǎo)致肝癌，我國(guó)肝癌的發(fā)病率約占全球肝癌死亡人數(shù)的40%，已經(jīng)成為我國(guó)面臨的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[2-3]。肝纖維化(hepatic fibrosis)是由多種原因引起的慢性肝損傷的常見(jiàn)結(jié)果，是肝臟對(duì)一系列慢性刺激損傷修復(fù)的病理反應(yīng)，以細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積為主要特征[4]。目前為止，仍然未出現(xiàn)獲得臨床批準(zhǔn)使用的抗纖維化的藥物，因此研制有效的抗纖維化藥物是現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)[5]。人肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活與增殖是肝纖維化形成的核心環(huán)節(jié)，HSCs的激活機(jī)制及抑制活化途徑的研究已成為防治肝纖維化的關(guān)鍵。目前國(guó)際上抗肝纖維化藥物研發(fā)的思路是從肝纖維化發(fā)生機(jī)制中尋找靶點(diǎn)，由于HSC激活是多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑協(xié)調(diào)的結(jié)果，其復(fù)雜性和未知因素導(dǎo)致阻斷模式的特異性和多樣性。新近研究進(jìn)展表明，表觀(guān)遺傳學(xué)的異常調(diào)控可能是肝纖維化發(fā)病機(jī)制和發(fā)展的主要驅(qū)動(dòng)力[6]，主要表現(xiàn)為由組蛋白乙?；?histone acetylation)所參與的調(diào)節(jié)HSCs的活化增殖環(huán)節(jié)，并提出組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)可能是具有較高潛在應(yīng)用價(jià)值的特異性靶標(biāo)[7-8]。

伏立諾他(vorinostat，SAHA)為首個(gè)被美國(guó)FDA 批準(zhǔn)上市的 HDAC抑制劑，屬于異羥肟酸類(lèi)藥物，對(duì)博來(lái)霉素所誘導(dǎo)的特發(fā)性肺纖維化有顯著的修復(fù)作用[9]。

小分子化合物 N2E與SAHA 同屬異羥肟酸類(lèi)，其化學(xué)名稱(chēng)為N-(2-乙氧基苯基)-N′-羥基辛二酰胺，對(duì)HDAC的抑制效果比SAHA強(qiáng)2倍以上[10]。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小分子化合物 N2E有良好的抗肝纖維化作用，可逆轉(zhuǎn)纖維化，減少肝臟損害。本研究旨在進(jìn)一步探討N2E誘導(dǎo)人肝星狀細(xì)胞LX-2細(xì)胞凋亡作用，初步明確其抗肝纖維化的可能性。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

人肝星狀細(xì)胞LX-2由廣東藥科大學(xué)蘭天博士肝纖維化研究小組提供。N2E通過(guò)特殊方法合成[10]。SAHA(大連美倫生物科技公司)；細(xì)胞周期試劑盒、AnnexinV-APC/PI 試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、Caspase-3分光光度計(jì)法檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；HDAC3一抗(1∶4 000，Abcam)、Caspase-3一抗(1∶500)、α-SMA一抗(1∶500)、TGF-β1一抗(1 500)均購(gòu)自萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基(Thermo公司)；胎牛血清(FBS，Gibico公司)；ECL化學(xué)發(fā)光液(Bio-Rad公司)。

1.2 主要儀器

SW-CJ-2F型凈化工作臺(tái)(蘇州凈化有限公司)；水套式CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)；光學(xué)顯微鏡(Nikon公司)；流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur公司)；SPD-M20A 分光光度計(jì)(日本島津公司)。

1.3 細(xì)胞流式檢測(cè)N2E作用LX2細(xì)胞的細(xì)胞周期

分別設(shè)置空白對(duì)照組，N2E(2.5、5、10 μmol/L)組，SAHA(10 μmol/L)組，給藥24 h后，離心采集細(xì)胞，棄上清，用預(yù)先冷卻的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入預(yù)先冷卻的70%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙醇重懸液，于4 ℃固定過(guò)夜，或-20 ℃長(zhǎng)期固定。細(xì)胞染色，離心收集細(xì)胞，每次1 mL PBS洗滌細(xì)胞，加入 PBS[包括試劑盒中提供的5 μg/ mL碘化物C錠(PI)]500 μL，100 μg/mL RNaseA、0.2%Triton X-100)4 ℃避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀分析：以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，一般計(jì)數(shù)1×105個(gè)細(xì)胞以上，結(jié)果用細(xì)胞周期擬合軟件Flowjo分析。

1.4 AnnexinV-APC/PI雙染法檢測(cè)N2E對(duì)LX-2細(xì)胞的凋亡作用

分別設(shè)置空白對(duì)照組、N2E(2.5、5、10 μmol/L)組，SAHA(10 μmol/L)組，給藥24 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌1次，然后用1×結(jié)合緩沖液洗滌; 使用1×Binding緩沖細(xì)胞和計(jì)數(shù)，細(xì)胞數(shù)為5×106/mL; 收集細(xì)胞，分別加入膜聯(lián)蛋白V-APC、PI 各5 μL，室溫孵育15 min，加入1×Binding緩沖液重懸液400 μL 混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析數(shù)據(jù)。

1.5 MMP法檢測(cè)N2E對(duì)LX-2細(xì)胞凋亡作用

分別設(shè)置空白對(duì)照組、N2E(2.5、10 μmol/L)組、SAHA(10 μmol/L)組以及線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照CCCP組。N2E、SAHA組處理24 h后，收集細(xì)胞上清以及細(xì)胞后離心，去上清，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作染色，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行正常線(xiàn)粒體膜電位(MMP)的檢測(cè)。采用Flowjo軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，得到各組的細(xì)胞MMP變化特點(diǎn)。

1.6 分光光度計(jì)法檢測(cè)N2E作用LX-2后Caspase-3的活性

取試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)說(shuō)明繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(y=331.320 3x+0.242 3，R2=0.997 1)，分別設(shè)置空白對(duì)照組、N2E(2.5、10 μmol/L)組、SAHA(10 μmol/L)組，種皿給藥后，收集細(xì)胞并裂解。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)樣品進(jìn)行處理。最后將處理好的樣品放于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度(A值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出N2E作用LX-2后Caspase-3的活性。

1.7 免疫蛋白印跡

將生長(zhǎng)良好、密度合適的肝星狀細(xì)胞系LX-2細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，分別加入含2.5、5、10 μmol/L的N2E和10 μmol/L的SAHA，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。N2E由無(wú)菌DMSO溶解后，配置成5 mmol/L濃度的母液。裂解液裂解后收集細(xì)胞至EP管中，4 ℃離心35 min(12 000 r/min)，取上清液進(jìn)行細(xì)胞定量，將蛋白進(jìn)行電泳以及轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉1 h后，一抗和內(nèi)參β-actin在4 ℃孵育過(guò)夜，次日二抗孵育45 min，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液(ECL)發(fā)光顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞周期法檢測(cè)N2E對(duì)LX-2的凋亡誘導(dǎo)作用

利用 FlowJo V7.6.2軟件對(duì)N2E處理過(guò)的LX-2細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)期的模擬分析 (圖1 A)。并根據(jù)G1、S、G2期細(xì)胞數(shù)占總數(shù)的百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(圖1 C)。對(duì)比空白對(duì)照組，可以觀(guān)察到N2E組在G1期細(xì)胞占總數(shù)的百分比減少，且在高濃度較為明顯(對(duì)比低、中濃度，高濃度下降了17.08%)。而在S期，細(xì)胞占總數(shù)的百分比隨著藥物濃度的增加而逐漸增加(從低濃度的8.53%逐漸上升至高濃度的14.46%)，且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。N2E組在細(xì)胞的G2/M期細(xì)胞占總數(shù)的百分比有一定提升，但變化不明顯，且沒(méi)有濃度依賴(lài)性。說(shuō)明N2E可能是通過(guò)阻滯細(xì)胞于S期，使其DNA損傷，影響DNA的轉(zhuǎn)錄復(fù)制，來(lái)達(dá)到抑制LX-2細(xì)胞增殖的作用。這與陽(yáng)性藥物SAHA組結(jié)果一致。

2.2 AnnexinV-APC/PI雙染法檢測(cè)N2E對(duì)LX-2的凋亡誘導(dǎo)作用

如圖1 B所示，空白對(duì)照組的成活率和細(xì)胞凋亡率分別在80%以上和20%以下。N2E或SAHA治療24 h后,觀(guān)察到明顯的細(xì)胞凋亡 (圖1 D)。在 2.5 μmol/L N2E的作用下,LX-2細(xì)胞的總凋亡率為23.32%；隨著濃度的增加，LX-2細(xì)胞的凋亡率增加；在10 μmol/L N2E作用下，LX-2細(xì)胞總凋亡率為63.22% (P<0.01)。結(jié)果表明N2E可顯著誘導(dǎo)人肝星狀細(xì)胞凋亡。

A. N2E對(duì)人肝星狀細(xì)胞LX-2細(xì)胞周期的影響； B. N2E對(duì)人肝星狀細(xì)胞LX-2凋亡率的影響； C. N2E對(duì)LX-2細(xì)胞周期的影響； D. N2E對(duì)人肝星狀細(xì)胞LX-2凋亡率的影響； E. N2E對(duì)人肝星狀細(xì)胞LX-2 MMP的影響； F.N2E對(duì)人肝星狀細(xì)胞LX-2 Caspase-3活性的影響；與空白對(duì)照組比較：*P<0.05,**P<0.01。

2.3 MMP法檢測(cè)N2E對(duì)LX-2的凋亡誘導(dǎo)作用

如圖1 E所示，N2E對(duì)人肝星狀細(xì)胞作用24 h，當(dāng)濃度為2.5 μmol/L N2E時(shí)，MMP變化并不明顯，當(dāng)濃度遞增至10 μmol/L時(shí)，可觀(guān)察到MMP較空白對(duì)照組以及低濃度組明顯下降(P<0.05)，此外SAHA的MMP變化與空白對(duì)照組對(duì)比沒(méi)有明顯變化，而CCCP陽(yáng)性對(duì)照組則同高濃度N2E組一樣，表現(xiàn)出明顯的下降變化，保證了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

2.4 Caspase-3分光光度計(jì)法檢測(cè)N2E對(duì)LX-2的凋亡誘導(dǎo)作用

如圖1 F所示，N2E作用LX-2細(xì)胞24 h后，其細(xì)胞的Caspase-3活性與對(duì)照組相比明顯增強(qiáng)；SAHA作用LX-2后，Caspase-3活性并無(wú)明顯的變化。而2個(gè)濃度的N2E均能顯著增加Caspase-3的活性(P<0.01)，提示N2E可能通過(guò)調(diào)控Caspase-3來(lái)誘導(dǎo)人肝星狀細(xì)胞LX-2凋亡。

2.5 N2E作用LX-2后對(duì)HDAC3、α-SMA、Caspase-3以及TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，3個(gè)濃度的N2E(2.5、5.0、10.0 μmol/L)均能顯著下調(diào)HDAC3、α-SMA、TGF-β1以及Caspase-3的表達(dá)水平，并促進(jìn)Cleaved-Caspase-3蛋白的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。同時(shí)，N2E對(duì)LX-2細(xì)胞中的TGF-β1表達(dá)也均有下調(diào)作用，與陽(yáng)性藥SAHA實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。見(jiàn)圖2。

3 討論

細(xì)胞周期(cell cycle)是指細(xì)胞從一次分裂開(kāi)始到下一次分裂結(jié)束的整個(gè)過(guò)程，包括DNA合成相關(guān)的細(xì)胞間期(G1期、S期、G2期)以及細(xì)胞分裂期(M期)2個(gè)階段。細(xì)胞周期的檢測(cè)結(jié)果顯示N2E能阻滯LX-2細(xì)胞于S期，且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性，與陽(yáng)性藥物SAHA組的結(jié)果一致。S期為細(xì)胞復(fù)制過(guò)程中1倍DNA到2倍DNA的階段，N2E阻滯LX-2細(xì)胞停滯在S期，可能是通過(guò)使其DNA損傷，影響DNA的轉(zhuǎn)錄復(fù)制，從而達(dá)到抑制LX-2細(xì)胞增殖的作用。結(jié)果提示N2E不但可以抑制細(xì)胞增殖，還能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。肝星狀細(xì)胞在肝纖維化的發(fā)生以及發(fā)展過(guò)程中都起到了重要的作用，誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡也是抗肝纖維化的一種治療方式[11]。隨后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)LX-2的細(xì)胞凋亡率，使用帶有熒光的APC標(biāo)記的Annexin V-APC，選擇性地與細(xì)胞早期凋亡時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞外翻至細(xì)胞膜外側(cè)的磷脂酰絲氨酸相結(jié)合，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)是否存在凋亡現(xiàn)象。結(jié)果顯示，隨著N2E的濃度遞增，細(xì)胞發(fā)生凋亡的比率顯著增加，表明N2E能誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞LX-2發(fā)生凋亡，且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。

A. Western blot檢測(cè)N2E對(duì)LX-2中HDAC3、α-SMA、TGF-β1以及Caspase-3、Cleaved-Caspase3的蛋白表達(dá)影響； B.蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析；與空白對(duì)照組比較：*P<0.05,**P<0.01。

圖2N2E對(duì)LX-2細(xì)胞中HDAC3以及相關(guān)蛋白的影響

MMP是維持細(xì)胞線(xiàn)粒體氧化磷酸化并產(chǎn)生三磷酸腺苷的先決條件，而MMP的穩(wěn)定性是維持細(xì)胞正常生理功能的前提。 MMP下降是細(xì)胞早期凋亡的重要標(biāo)志。通過(guò)檢測(cè)LX-2在N2E作用下MMP的變化，發(fā)現(xiàn)10 μmol/L N2E作用LX-2后，細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位明顯降低，提示LX-2在N2E作用下可能發(fā)生早期凋亡。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Caspase家族起到十分重要的作用，其中Caspase-3與染色體凝聚、DNA斷裂、凋亡小體形成等密切相關(guān)[12]。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，活化后的Caspase-3能通過(guò)影響細(xì)胞胞漿或者胞核底物來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)一步凋亡。通過(guò)分光光度計(jì)法檢測(cè)了N2E作用LX-2后Caspase-3的活性，檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了N2E誘導(dǎo)LX-2凋亡與活化Caspase-3有關(guān)。

有研究提示，HDAC3調(diào)節(jié)了TGF-β1的穩(wěn)定性[13]，研究發(fā)現(xiàn)在肝纖維化形成和逆轉(zhuǎn)過(guò)程中Ⅰ型膠原和α-SMA的表達(dá)變化伴隨著HDACs的表達(dá)變化。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分析也證明HDAC3的沉默可以恢復(fù)因TGF-β1所誘導(dǎo)的Ⅰ型膠原和α-SMA的高表達(dá)，可見(jiàn)抑制HDAC3可以起到逆轉(zhuǎn)纖維化的作用。

本實(shí)驗(yàn)證明了N2E可明顯下調(diào)肝星狀細(xì)胞LX-2中HDAC3、α-SMA、TGF-β1和Caspase-3的蛋白表達(dá)，以及促進(jìn)活化后的Cleaved-Caspase-3的表達(dá)，說(shuō)明N2E可能通過(guò)作用靶蛋白HDAC3來(lái)促進(jìn)與凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-Caspase-3，同時(shí)抑制α-SMA以及TGF-β1的表達(dá)，提示N2E通過(guò)抑制HDAC3來(lái)誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞LX-2的凋亡，同時(shí)也抑制TGF-β1以及α-SMA的表達(dá)。本研究結(jié)果為組蛋白去乙?；敢种苿㎞2E在抗肝纖維化治療中的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。