深海真菌 Diaporthe phaseolorum FS431次級代謝產(chǎn)物的分離鑒定

郭珩，劉洪新，陳玉嬋，李賽妮，李浩華，陳閃沖2,，章衛(wèi)民，高曉霞

(1.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；3.廣東省微生物研究所/省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070)

海洋環(huán)境復(fù)雜多變，海洋微生物適應(yīng)了高壓、低氧、高鹽、無光照、低溫或高溫的獨(dú)特生存環(huán)境，因此其次級代謝產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜、活性多樣的特點(diǎn)，使其成為尋找活性天然產(chǎn)物最重要的資源之一[1-2]。海洋真菌是海洋微生物中的一個(gè)重要類群，近年來,海洋真菌已成為微生物活性代謝產(chǎn)物研究的熱點(diǎn)，許多研究者從中發(fā)現(xiàn)了不少結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的海洋真菌次級代謝產(chǎn)物，為海洋藥物研發(fā)提供了重要支撐[3-6]。

為了尋找新型的海洋活性天然產(chǎn)物，本課題組前期篩選獲得1株從印度洋沉積物中分離得到的深海真菌DiaporthephaseolorumFS431。利用色譜法對該菌株的發(fā)酵粗提物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TLC顯色豐富且斑點(diǎn)明顯，HPLC分析圖譜中紫外吸收豐富且峰數(shù)量較多，表明該菌株含有較豐富的代謝產(chǎn)物，值得進(jìn)一步深入研究。據(jù)報(bào)道，目前已從不同來源的真菌D.phaseolorum中發(fā)現(xiàn)了一些具有生物活性的化合物，如從紅樹林內(nèi)生真菌D.phaseolorumSKS019中分離到能抑制巨噬細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞的吡喃酮類衍生物[7]，從植物(Combretumlanceolatum)內(nèi)生真菌D.phaseolorum-92C中分離到能殺滅曼氏血吸蟲成蟲的細(xì)胞松弛素類化合物[8]，從海洋真菌Diaporthesp.HLY2中則分離到具有較好的抗Raji淋巴瘤細(xì)胞和抗KB細(xì)胞活性的異苯并呋喃酮類化合物和真菌環(huán)氧二烯Mycoepoxydiene[9]。

為了深入發(fā)掘深海真菌D.phaseolorumFS431的活性次級代謝產(chǎn)物，本研究對該菌株的液體發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了化學(xué)成分的系統(tǒng)分離，從中分離純化得到9個(gè)化合物，依次鑒定為nectriapyrone(1)、pestalotiopyrone B(2)、nectriapyrone B(3)、(R)-甲羥戊酸內(nèi)酯(4)、3,5-dihydroxy-γ-caprolactone(5)、cytochalasin H(6)、cytochalasin J(7)、脫落酸(8)和(1R,2R,4R)-trihydroxy-p-menthane(9)，各化合物的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1分離自Diaporthephaseolum FS431的化合物
Figure1Compounds isolated fromDiaporthephaseolum FS431

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器與試劑

1290-6430A三重四級桿LC/MS(Agilent Technologies公司)；PZ1000B旋轉(zhuǎn)式大容量普通搖床(武漢瑞華儀器設(shè)備有限公司)；LC-20A制備型高效液相色譜儀(島津公司)；AVANCE Ⅲ型500 MHz核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司)；OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會社)；MCP-500分光偏振儀(奧地利Anton Paar公司)；LVG-4A1超凈工作臺(新加坡ESCO公司)；YMC-pack ODS-A制備柱(250 mm×20 mm，5 μm，12 nm，日本YMC公司)；YMC-pack ODS-AQ半制備柱(250 mm×10 mm，5 μm，12 nm，日本YMC公司)；Avanti J-26 XP高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司)；MIR-254-PC恒溫培養(yǎng)箱(日本Panasonic公司)；Sephadex LH-20(瑞典Amersham Biosciences公司)；ODS-A-HG(50 μm， 12 nm，日本YMC*GEL)；GF254 高效薄層板(德國Merck公司)；柱色譜硅膠(100～200目、200～300目，青島海洋化工廠)。

1.2 菌株

菌株FS431從印度洋(N：7°57.75944′，E：89°19.43851′)3 605 m深處的沉積物中分離得到，通過液氮凍融法提取菌株FS431的基因組DNA。采用擴(kuò)增分離rDNA ITS區(qū)，并對產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果提交GenBank，登錄號為MK459544。序列比對結(jié)果顯示，菌株FS431與DiaporthephaseolorumMJ14(GenBank號：KM203581)的序列相似度為99%，故鑒定菌株FS431為Diaporthephaseolorum，菌種保存于廣東省微生物研究所，菌種編號為FS431。

2 提取與分離

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)

在無菌條件下，將4 ℃保藏的菌株FS431接種到制備好的PDA平板培養(yǎng)基上，在27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。發(fā)酵培養(yǎng)基為含海鹽的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)：馬鈴薯汁200 g/L，KH2PO43 g/L，葡萄糖20 g/L，維生素B1 10 mg /L，粗鹽15 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L。在無菌條件下，將活化后的FS431菌體接種至含PDB培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，每個(gè)500 mL三角瓶內(nèi)裝培養(yǎng)基250 mL，在轉(zhuǎn)速120 r/min、28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)7 d，共發(fā)酵120 L。

2.2 發(fā)酵物的提取與分離

120 L發(fā)酵液經(jīng)離心后用4層紗布過濾，得到菌絲體和發(fā)酵液。用等體積的乙酸乙酯對發(fā)酵液萃取4次，40 ℃下將乙酸乙酯層減壓濃縮，得到棕黑色粗提物浸膏53.3 g。浸膏經(jīng)硅膠柱層析(100～200目)，以石油醚-乙酸乙酯(體積比30∶1→0∶1)和二氯甲烷-甲醇(體積比5∶1→1∶1)溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，并用薄層色譜(TLC)檢測，合并相似組分，得到20個(gè)粗組分Fr.1～20。Fr.8(0.82 g)通過Sephadex LH-20(二氯甲烷-甲醇，體積比1∶1)洗脫得到5個(gè)亞組分(Fr.8-1～8-5)；Fr.8-2通過YMC-pack ODS-A制備柱(甲醇-水體系，體積比60∶40，7 mL/min)和YMC-pack ODS-AQ半制備柱(乙腈-水，體積比60∶40，3 mL/min)純化得到化合物1(6.7 mg)。Fr.12(2.3 g)經(jīng)ODS-A-HG柱層析(甲醇-水，體積比50∶50→100∶0)分離得10個(gè)亞組分(Fr.12-1～12-10)；Fr.12-3(0.29 g)經(jīng)Sephadex LH-20(純甲醇)洗脫、YMC-pack ODS-A制備柱(甲醇-水，體積比50∶50，7 mL/min)以及YMC-pack ODS-AQ半制備柱(乙腈-水，體積比35∶65，3 mL/min)分離純化得化合物8(1.7 mg)。Fr.13(1.8 g)經(jīng)ODS-A-HG柱層析(甲醇-水，體積比30∶70→100∶0)分離得3個(gè)亞組分(Fr.13-1～13-3)，F(xiàn)r.13-3(0.12 g)經(jīng)正相硅膠柱層析(200～300目，正己烷-乙酸乙酯，體積比50∶1→10∶1)、YMC-pack ODS-AQ半制備柱(甲醇-水，體積比65∶35，2 mL/min)分離純化得化合物9(18 mg)。Fr.14(3.2 g)經(jīng)Sephadex LH-20(二氯甲烷-甲醇，體積比1∶1)洗脫得到7個(gè)亞組分(Fr.14-1～14-7);Fr.14-1(1.6 g)再次由Sephadex LH-20(純甲醇)洗脫得Fr.14-1-1～Fr.14-1-3。Fr.14-1-1(30 mg)經(jīng)正相硅膠柱層析(200～300目，二氯甲烷-甲醇，體積比50∶1→5∶1)梯度洗脫，純化得到化合物6(17 mg)。Fr.14-1-2(180 mg)通過正相硅膠柱層析(200～300目，正己烷-乙酸乙酯，體積比20∶1→1∶1)梯度洗脫得Fr.14-1-2-1和Fr.14-1-2-4。Fr.14-1-2-1(60 mg)用正相硅膠層析柱(二氯甲烷-甲醇，體積比200∶1→10∶1)梯度洗脫分離純化得化合物4(10 mg)和5(7 mg)。Fr.14-1-2-4(30 mg)通過YMC-pack ODS-AQ半制備柱(甲醇-水，體積比50∶50，2 mL/min)純化得化合物2(1.2 mg)。Fr.16(1.8 g)經(jīng)Sephadex LH-20(二氯甲烷-甲醇，體積比1∶1)洗脫，分離得到6個(gè)亞組分(Fr.16-1～Fr.16-6)。Fr.16-1(180 mg)用正相硅膠柱層析(200～300目，正己烷-乙酸乙酯，體積比50∶1→1∶1)分離純化得化合物7(14 mg)。Fr.16-2(374 mg)用正相硅膠柱層析(200～300目，二氯甲烷-甲醇，體積比50∶1→10∶1)分離純化得化合物3(27.8 mg)。

3 活性測試

3.1 細(xì)胞毒活性測試

采用SRB法[10]測定9個(gè)化合物的細(xì)胞毒活性。取對數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞(HepG-2)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、人神經(jīng)癌細(xì)胞(SF-268)和人肺癌細(xì)胞(NCI-H460)作為供試細(xì)胞株，先用胰酶消化，進(jìn)行臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)；臺盼藍(lán)排斥試驗(yàn)檢測細(xì)胞活力大于95%后，再用新鮮培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104個(gè)/mL，將細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入180 μL的細(xì)胞懸液，并設(shè)3個(gè)空白孔調(diào)零，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，每孔加入20 μL待測樣品，空白對照加20 μL培養(yǎng)基，陽性對照加入質(zhì)量濃度為20 μg/mL的順鉑，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。接著，加入50%冷三氯醋酸50 μL固定細(xì)胞，4 ℃放置1 h，用蒸餾水洗滌5次，自然揮干。然后，每孔加入質(zhì)量濃度為4 mg/mL的SRB溶液100 μL，室溫下染色30 min，去上清，再用1%冰醋酸洗滌5次，自然揮干。最后，每孔加入濃度為10 mmol/mL的Tris溶液200 μL，用酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光值(A)，采用公式“細(xì)胞生長抵制率=(A空白對照組-A樣品組)/A空白對照組)×100%”計(jì)算待測樣品對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率，結(jié)果表明，當(dāng)試藥濃度為100 mmol/L時(shí)，所有化合物均無明顯的細(xì)胞毒活性。

3.2 抗氧化活性測試

采用DPPH法[11]測定9個(gè)化合物的抗氧化活性。精確稱取一定量的待測樣品、維生素C和DPPH，分別用DMSO、無水乙醇、無水乙醇配制成濃度為2 mg/mL、2 mg/mL和0.2 mmol/L的溶液。在96孔酶標(biāo)板中設(shè)置以下幾個(gè)實(shí)驗(yàn)組：樣品組：100 μL樣品溶液+100 μLDPPH溶液；樣品背景組：100 μL樣品溶液+100 μL無水乙醇；陽性對照組：100 μL維生素C溶液+100 μLDPPH溶液；陰性對照組：100 μL無水乙醇+100 μLDPPH溶液；空白對照組：200 μL無水乙醇。5個(gè)實(shí)驗(yàn)組室溫反應(yīng)30 min后，用酶標(biāo)儀測定517 nm處的吸光度(A)，用公式“清除率=[1-(A樣品-A樣品背景)/(A陰性對照-A空白對照)]×100%”計(jì)算樣品對DPPH的清除率，結(jié)果表明，所有化合物清除DPPH自由基的能力均很弱。

4 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物4：無色油狀，-13.6 (c0.1,MeOH)，ESI-MSm/z:153.0[M+Na]+，分子式為C6H10O3。1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ:4.55(1H,m,H-6a),4.36(1H,m,H-6b),2.57(2H,m,H-3),1.97(1H,m,H-5a),1.84(1H,m,H-5b),1.33(3H,s,CH3-7)。13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:173.7(C-2),68.5(C-4),67.6(C-6),45.1(C-3),36.5(C-5),29.4(CH3-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物4為(R)-甲羥戊酸內(nèi)酯[(R)-mevalonolactone]。

化合物6：淺黃色固體，+47.9 (c0.1,MeOH)，ESI-MSm/z:516.2[M+Na]+，分子式為C30H39NO5。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.30(2H,t,J=7.5 Hz,CH),7.23(1H,m,CH),7.19(2H,d,J=6.8 Hz,CH),5.74(1H,dd,J=16.6,2.5 Hz,CH),5.63(1H,ddd,J=15.3,9.5,1.5 Hz,CH),5.52(1H,dd,J=16.6,2.4 Hz,CH),5.42(1H,t,J=2.4 Hz,CH),5.30(1H,ddd,J=15.2,10.3,4.8 Hz,CH),5.20(1H,s,CH),4.98(1H,s,CH),3.81(1H,d,J=10.0 Hz,CH),3.29(1H,ddd,J=8.2,5.5,2.9 Hz,CH),2.93(1H,t,J=10.0 Hz,CH),2.88(1H,dd,J=13.2,5.5 Hz,CH),2.72(1H,dd,J= 13.2,8.2 Hz,CH),2.64(1H,m,CH),2.27(3H,s,CH3),2.17(1H,dd,J=5.4,2.8 Hz,CH),2.02(1H,dd,J=10.98,4.5 Hz,CH),1.79(1H,m,CH),1.76(1H,m,CH),1.73(1H,m,CH),1.54(1H,m,CH),1.28(3H,s,CH3),1.02(3H,d,J=6.4 Hz,CH3),0.57(3H,d,J=6.8 Hz,CH3)。13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:177.0(C-1),171.9(21-OCOCH3),151.1(C-6),139.0(C-14),138.4(C-19),137.7(C-1′),130.9(C-3′5′),129.6(C-2′6′),129.3(C-4′),127.9(C-13),126.9(C-20),113.5(C-12),78.5(C-21),74.8(C-18),72.6(C-7),55.0(C-17),55.0(C-3),53.7(C-9),49.9(C-4),47.8(C-8),45.2(C-10),44.5(C-15),33.5(C-5),30.6(C-23),29.3(C-16),26.7(C-22),20.7(21-OCOCH3),13.6(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物6為cytochalasin H。

化合物7：白色固體，+38.5 (c0.1,MeOH)，ESI-MSm/z:474.2 [M+Na]+，分子式為C28H37NO4。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.31(2H,d,J=7.5 Hz,CH),7.23(1H,d,J= 7.5,6.8 Hz,CH),7.21(2H,dd,J=6.8 Hz,CH),5.83(1H,dd,J=16.5,2.3Hz,CH),5.74(1H,dd,J=16.6,2.3 Hz,CH),5.57(1H,dd,J=15.4,9.5 Hz,CH),5.26(1H,m,CH),5.22(1H,s,CH),5.01(1H,s,CH),3.77(1H,d,J=10.1 Hz,CH),3.72(1H,t,J=2.3 Hz,CH3),3.33(1H,m,CH),2.90(1H,t,J= 10.1 Hz,CH),2.82(1H,dd,J=13.5,6.0 Hz,CH),2.75(1H,dd,J=13.5,6.0 Hz,CH),2.75(1H,s,CH),2.61(1H,dd,J=5.2,3.4 Hz,CH),1.98(1H,dd,J=12.3,4.8 Hz,CH),1.80(1H,m,CH),1.75(1H,m,CH),1.69(1H,m,CH),1.51(1H,d,J=10.8 Hz,CH),1.26(3H,s,CH3),1.00(3H,d,J=6.7 Hz,CH3),0.84(3H,d,J=6.7 Hz,CH3)。13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:178.8(C-1),151.9(C-6),138.7(C-14),137.5(C-1′),137.4(C-19),132.2(C-20),131.1(C-2′6′),129.5(C-3′5′),129.4(C-13),127.8(C-4′),113.0(C-12),76.7(C-21),75.1(C-18),72.5(C-7),55.1(C-3),55.0(C-17),55.0(C-9),49.9(C-4),46.6(C-8),45.0(C-10),44.6(C-15),34.0(C-5),31.1(C-23),29.4(C-16),26.7(C-22),14.0(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物7為cytochalasin J。

化合物9：無色晶體，-23.4 (c0.1,MeOH)，ESI-MSm/z:211.0 [M+Na]+，分子式為C10H20O3。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:3.51(1H,dd,J=3.3,1.4 Hz,CH),1.93(2H,ddd,J=13.4,10.1,3.5 Hz,CH2),1.81(1H,m,CH),1.59(1H,m,CH),1.42(1H,m,CH),1.24(1H,s,CH),0.92(3H,d,J=1.4 Hz,CH3),0.91(3H,d,J=1.4 Hz,CH3)。13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:75.7(C-2),75.7(C-4),72.0(C-1),39.0(C-8),34.8(C-3),30.4(C-5),30.3(C-6),27.1(C-7),17.3(C-10),17.2(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物9為(1R,2R,4R)-trihydroxy-p-menthane。

5 討論

本文從深海真菌DiaporthephaseolorumFS431的發(fā)酵產(chǎn)物中分離并鑒定了9個(gè)化合物，包含3個(gè)吡喃酮類衍生物、2個(gè)內(nèi)酯類化合物、2個(gè)細(xì)胞松弛素類化合物、1個(gè)脫落酸和1個(gè)單環(huán)單萜，其中化合物2、4、5和8為首次從Diaporthe屬真菌中分離得到。

Nectriapyrone(1)、pestalotiopyrone B(2)和nectriapyrone B(3)是α-吡喃酮類化合物，據(jù)報(bào)道該類化合物有廣泛的生物活性，其中nectriapyrone(1)對金黃色葡萄球菌具有抑制活性，其MIC為30 μg/mL[20]，能抑制小鼠腦中單胺氧化酶(MAO)的活性，還可以刺激B16-F1黑色素瘤細(xì)胞中DOPA黑色素的形成[21-22]。Cytochalasin H(6)和cytochalasin J(7)具有抗瘧疾活性，能殺滅惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum 3D7)[23]。本研究對這9個(gè)化合物進(jìn)行了活性測試，但沒有發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒和抗氧化活性，為了充分挖掘這些化合物的潛在藥用價(jià)值，在今后的研究中將測試它們其他生物活性，為開發(fā)海洋真菌活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。