介質(zhì)阻擋放電氦等離子體-氣相色譜測定綠豆中脂肪酸含量

賈鵬禹，孫 蕊，趙晶晶，馮乃杰，鄭殿峰,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319）

綠豆是我國重要的雜糧作物之一，可簡單蒸煮食用或加工成多種產(chǎn)品，作為良好的藥食同源食材深受大眾喜愛[1]。綠豆品質(zhì)關(guān)系到原糧加工性能及其營養(yǎng)價值，綠豆中的脂肪酸組成是綠豆品質(zhì)形成的重要指標(biāo)，因此脂肪酸含量及其分析方法研究對綠豆等雜糧生產(chǎn)及科學(xué)研究具有指導(dǎo)意義[2-4]。

糧食中脂肪酸含量分析主要采用氣相色譜法，多采用不同極性的石英毛細(xì)管柱進(jìn)行組分分離[5-6]，結(jié)合氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）或質(zhì)譜進(jìn)行檢測[7-8]，其中FID是文獻(xiàn)報(bào)道中最為常見的檢測器。在樣品前處理方面，主要采用溶劑萃取、索氏提取或超臨界萃取等方法提取脂肪[9-11]，經(jīng)濃縮后再由氫氧化鉀-甲醇等方法進(jìn)行甲酯化后上機(jī)分析。雖然目前的脂肪酸組分測定方法較為成熟，但在樣品前處理方面存在樣品量需求大，有機(jī)溶劑消耗多及流程繁瑣等不足。與此同時，在作物逆境生理或化學(xué)調(diào)控研究領(lǐng)域，受環(huán)境脅迫或化學(xué)調(diào)控下的原糧品質(zhì)受到關(guān)注，而在上述特定研究中，供試樣品量較少的問題給分析方法的靈敏度及重現(xiàn)性帶來新的挑戰(zhàn)，因此有必要創(chuàng)新分析方法。近年來，日本島津公司推出介質(zhì)阻擋放電氦等離子體檢測器（dielectric barrier discharge ionization detector，BID），是一種通用型檢測器，利用高純氦氣在絕緣介質(zhì)上產(chǎn)生氦等離子體，釋放出高能量光子（17.7 eV）用以離子化目標(biāo)組分，可測定除氖和載氣氦以外的全部化合物，包括無機(jī)氣體和可揮發(fā)有機(jī)物[12-17]。目前該檢測器的應(yīng)用多集中在永久性氣體（H2、O2、N2、CO、CH4和CO2）等組分的分析檢測，如高爐煤氣、水煤氣、化工氣、合成氣、填埋氣的檢測分析中[18-23]，對有機(jī)化合物的檢測鮮有報(bào)道。本課題組在預(yù)實(shí)驗(yàn)中通過對37 種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品測試發(fā)現(xiàn)BID對脂肪酸甲酯類化合物具有較高的靈敏度及良好的線性范圍，有望能通過此檢測器提升或改進(jìn)原有方法，因此本實(shí)驗(yàn)擬在深入比較BID和FID對脂肪酸檢測性能的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)際樣品的檢測要求，采用BID建立綠豆中脂肪酸組成分析方法，實(shí)現(xiàn)通過少量樣品即可滿足脂肪酸快速分析的目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用綠豆品種為‘綠豐2號’，該品種為農(nóng)業(yè)部審定的黑龍江省適種品種，于2017年5月種植于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所冷害試驗(yàn)基地并于當(dāng)年收獲，收獲樣品在自然干燥后清除雜質(zhì)，并置于網(wǎng)袋內(nèi)于陰涼干燥處保存，測試前采用3100型實(shí)驗(yàn)室錘式旋風(fēng)粉碎磨于16 800 r/min粉碎處理10 min，過100 目篩待用。

異辛烷、甲醇（色譜純） 天津市大茂化學(xué)試劑廠；氫氧化鉀（優(yōu)級純） 天津市科密歐試劑公司；無水硫酸鈉（優(yōu)級純） 天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；37 種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品（序列號：965931N2190083） 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；色譜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（正十二烷、正十四烷、正十六烷，質(zhì)量濃度100 ng/μL，瓶號：BW3093） 中國計(jì)量科學(xué)研究院；超純氦氣（純度99.999 9%，瓶號：00020654） 吳江梅塞爾工業(yè)氣體有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nexis GC-2030氣相色譜儀（配有BID、FID、150 位自動進(jìn)樣器、LabSolutions色譜工作站）、GCMS-QP2010 Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有12 位自動進(jìn)樣器，GCMS solution質(zhì)譜工作站） 日本島津公司；ML104電子分析天平（感量為0. 000 1 g） 瑞士梅特勒-托利多公司；TGL-16B小型臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；3100型實(shí)驗(yàn)室錘式旋風(fēng)粉碎磨 瑞典波通公司。

1.3 方法

1.3.1 氣相色譜儀系統(tǒng)校正

為保證BID檢測方法的可靠性及BID與FID性能比較的系統(tǒng)一致性，本實(shí)驗(yàn)在測試前進(jìn)行儀器系統(tǒng)的校正，所用載氣為超純氦氣以消除氣源影響[23]。依據(jù)日本島津公司標(biāo)準(zhǔn)安裝報(bào)告書（QMS-2021）要求，在待機(jī)狀態(tài)下，利用系統(tǒng)自檢模式掃描一段BID背景信號，計(jì)算信號噪聲及基線漂移。在噪聲及漂移值達(dá)標(biāo)后，平行采集5 次色譜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（正十二烷、正十四烷、正十六烷）的出峰時間及峰面積，進(jìn)行靈敏度及精密度考察；利用色譜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別通過BID及FID系統(tǒng)進(jìn)行測試并記錄組分保留時間，通過儀器氣體流量增益校正使BID和FID各組分出峰時間保持一致。

1.3.2 儀器檢測條件

1.3.2.1 BID

色譜柱：HP-88石英毛細(xì)管柱（100 m×0.25 mm，0.25 μm）88%-氰丙基/芳基-聚硅氧烷固定液；載氣：超純氦氣（純度99.999 9%）；載氣流量：1.5 mL/min；程序升溫：由120 ℃起始保持1 min，以10 ℃/min升至175 ℃保持10 min，以5 ℃/min升至210 ℃保持5 min，再以5 ℃/min升至230 ℃保持10 min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；隔墊吹掃流量：3 mL/min；分流比：1∶60；檢測器溫度：280 ℃；等離子體放電氣體流量：40 mL/min；進(jìn)樣體積：1 μL。

1.3.2.2 FID

色譜進(jìn)樣口程序升溫測試條件與BID相同。檢測器溫度：280 ℃；氫氣流量：25 mL/min；空氣流量：250 mL/min；尾吹氣流量：30 mL/min。

1.3.2.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用組分定性條件

色譜進(jìn)樣口程序升溫測試條件與BID相同。質(zhì)譜接口溫度：250 ℃；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；電子電離源：70 eV；掃描模式：SCAN；掃描范圍：m/z 29～550；溶劑延遲時間：8 min。

1.3.3 FID與BID對組分信號響應(yīng)能力的比較

參考Franchina等[15]的方法。在最佳儀器條件下，對37 種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品分別采用FID與BID進(jìn)行檢測，每種檢測器平行進(jìn)樣5 次采集峰面積及峰面積歸一化數(shù)據(jù)，分別計(jì)算峰面積及峰面積歸一化平均值，以平均值比較2 種檢測器對各組分信號響應(yīng)強(qiáng)度及響應(yīng)能力。利用SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)一步對FID和BID兩種檢測器對各脂肪酸甲酯組分峰面積及峰面積歸一化數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，考察2 種檢測器對各目標(biāo)組分的靈敏度及準(zhǔn)確性差異。

1.3.4 樣品前處理

參考田甜等[24]研究方法并重新設(shè)計(jì)。準(zhǔn)確稱取樣品50.0 mg于1.5 mL離心管中，依次加入1.00 mL異辛烷、30.0 μL氫氧化鉀-甲醇溶液和10.0 mg無水硫酸鈉，封蓋振搖60 s，靜置5 min后再次振搖60 s，12 000 r/min離心10 min，取上層清液加入樣品瓶中上機(jī)檢測。

1.3.5 組分定性與定量方法學(xué)考察

實(shí)際樣品組分定性采用標(biāo)準(zhǔn)品保留時間定性，并采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀電子電離源（70 eV）結(jié)合NIST譜庫檢索輔助定性[25]。在方法學(xué)考察前，將混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級稀釋并分別進(jìn)樣采集目標(biāo)組分峰面積，將各組分質(zhì)量濃度對應(yīng)峰面積進(jìn)行線性回歸計(jì)算得出回歸方程及相關(guān)系數(shù)，依據(jù)回歸方程及3 倍信噪比計(jì)算檢測限。對同一樣品按六邊形分布劃分等距取樣點(diǎn)，于6 個取樣點(diǎn)平行取樣進(jìn)行樣品前處理并分別上機(jī)檢測，以各組分峰面積計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差考察方法重現(xiàn)性。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品獲得的色譜圖在數(shù)據(jù)處理前通過相同的背景基線文件消除程序升溫產(chǎn)生基線漂移的影響，積分方法采用峰底連線及雙峰谷點(diǎn)中心切割方式，采用外標(biāo)法及峰面積歸一化法對實(shí)際樣品定量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖像處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 19.0（IBM SPSS Statistics）統(tǒng)計(jì)分析軟件對BID組和FID組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。圖像處理方法采用LabSolutions 5.90（Shimadzu Corporation）色譜處理軟件和Origin 8.5圖形處理軟件（OriginLab）對采集色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行峰面積積分、峰標(biāo)記及譜圖成像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣相色譜儀系統(tǒng)校正結(jié)果

在最終的系統(tǒng)校正條件下，BID基線噪聲值為74.00 μV，漂移值為1 233.36 μV。色譜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)正十二烷、正十四烷和正十六烷平均保留時間分別為2.095、3.234 min和6.024 min，平均峰面積分別為1 648 536、1 655 980和1 643 613，其中第3個峰正十六烷保留時間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.006%，峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.405%。BID和FID分別測定正十六烷保留時間偏差為0.018%，上述說明儀器狀態(tài)符合測試要求。

2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性結(jié)果

圖 1 37 種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品的BID氣相色譜圖Fig. 1 BID GC profiles of mixed standards of 37 fatty acid methyl ester

實(shí)驗(yàn)采用37 種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品對BID進(jìn)行系統(tǒng)適應(yīng)性考察，在最終測試條件下獲得BID氣相色譜如圖1所示。由圖1可知，色譜系統(tǒng)對組分分離狀況良好，BID對溶劑和37 種脂肪酸甲酯的信號響應(yīng)正常，對各組分出峰幾乎無歧視效應(yīng)，說明BID作為氣相色譜一種通用型檢測器對脂肪酸甲酯具有良好的系統(tǒng)適應(yīng)性。22.5 min后的基線漂移由程序升溫引起，可通過扣除空運(yùn)行獲得的背景文件達(dá)到平直狀態(tài)，滿足定量要求。

2.3 BID與FID對組分信號響應(yīng)能力的比較

表 1 BID與FID信號響應(yīng)性能比較Table 1 Comparison of signal response performance of BID and FID

續(xù)表1

如表1所示，經(jīng)各峰面積均值比較，BID較FID對各組分靈敏度均高出1 個數(shù)量級，部分組分信號響應(yīng)比達(dá)到15 倍以上，為針對少量實(shí)際樣品采用微型樣品前處理方法檢測提供前提條件。峰面積歸一化結(jié)果表明，2 種檢測器的測試準(zhǔn)確性相當(dāng)，說明BID對各組分響應(yīng)能力相當(dāng)，幾乎無組分歧視。單因素方差分析結(jié)果表明，2 種檢測器對各組分峰面積數(shù)據(jù)的差異均顯著，對各組分峰面積歸一化數(shù)據(jù)除花生酸和二十碳二烯酸外均差異不顯著，對花生酸和二十碳二烯酸2 種組分的響應(yīng)表現(xiàn)為增強(qiáng)，其原因可能在于BID對高碳數(shù)脂肪酸甲酯的離子化效率更高[15]。上述進(jìn)一步說明BID對各組分響應(yīng)靈敏度高且數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性好，證明采用BID建立脂肪酸含量測定方法具有可行性。

2.4 方法學(xué)考察結(jié)果

表 2 目標(biāo)組分線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Table 2 Linear equations, correlation coefficients and linear ranges for target components

由表2可知，BID對目標(biāo)組分表現(xiàn)出較高的靈敏度和良好的線性響應(yīng)范圍。方法中各組分相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.04%～1.35%之間，具有較高的重現(xiàn)性，證明采用微型樣品前處理方法在BID高靈敏度的線性區(qū)間內(nèi)具有較好的方法適應(yīng)性。

2.5 樣品檢測及方法應(yīng)用結(jié)果

圖 2 綠豆樣品的BID氣相色譜圖Fig. 2 BID gas chromatography profile of mung bean sample

由圖2可知，以峰面積歸一化對各脂肪酸組成進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果顯示被測綠豆樣品中棕櫚酸相對含量為（24.610±0.305）%，硬脂酸為（3.979±0.050）%，油酸為（9.010±0.107）%，亞油酸為（43.865±0.456）%，γ-亞麻酸為（0.162±0.002）%，α-亞麻酸為（16.818±0.212）%，山崳酸為（1.266±0.016）%，二十碳五烯酸為（0.290±0.004）%，其中5 種含量較高的脂肪酸組分檢測結(jié)果與前人的研究報(bào)道[6]相似。與前人研究方法比較，由于BID方法的高靈敏度，能夠檢測樣品中微量組分如γ-亞麻酸等，可為相關(guān)研究提供更多組分信息。在進(jìn)行大量樣品檢測應(yīng)用后，證明所建方法可滿足環(huán)境脅迫及化學(xué)調(diào)控下綠豆脂肪酸品質(zhì)的檢測要求，同時樣品需求量及實(shí)際消耗量僅為常規(guī)方法的百分之一，同時由于采用簡化的樣品前處理方法，樣品的檢測效率也得到提高。

3 結(jié) 論

本研究基于BID氣相色譜技術(shù)并采用微型樣品前處理建立綠豆中脂肪酸組成測定方法，該方法檢測器系統(tǒng)適應(yīng)性強(qiáng)、靈敏度高、色譜柱組分分離選擇性好[26-27]。與以往研究報(bào)道相比，由于采用高靈敏度檢測器，能夠測出原糧中5 種常見脂肪酸之外的3 種微量組分[28]，且對微量組分檢測的峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1.35%，證明其靈敏度和穩(wěn)定性與質(zhì)譜檢測器相當(dāng)[29]；采用微型樣品前處理所需固體樣品量達(dá)到毫克級，能滿足珍貴樣品的分析檢測[30]，在實(shí)際應(yīng)用中，本方法可實(shí)現(xiàn)單一綠豆植株不同結(jié)莢點(diǎn)內(nèi)綠豆的脂肪酸組成分析，提高研究層次；實(shí)驗(yàn)試劑消耗少，所用甲酯化試劑及溶劑約為文獻(xiàn)報(bào)道所用量5%～20%，且試劑為低值試劑，可節(jié)約分析成本[31]；樣品前處理流程簡單、快速、通量高，單一樣品前處理流程可在15 min內(nèi)完成，提高了分析效率。本研究所建方法可為作物栽培、種質(zhì)資源及食品科學(xué)研究提供技術(shù)保障，可拓寬BID的應(yīng)用范圍，為其在微量或痕量有機(jī)物分析方法學(xué)領(lǐng)域提供實(shí)踐基礎(chǔ)。