豬支原體肺炎弱毒活疫苗與滅活疫苗聯(lián)合免疫的免疫效果評(píng)估

彭 濤，馬梓承，王宏宇，孟凡亮，劉照虎，肖一紅，劉思當(dāng),2,3*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018；2.山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018；3.山東省畜禽疫病防制工程技術(shù)研究中心，山東 泰安 271018)

豬支原體肺炎(Mycoplasma pneumonia of swine，MPS)，俗稱(chēng)豬氣喘病、豬地方流行性肺炎，其病原是豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)。MPS 是一種以氣喘和咳嗽為主要癥狀的豬呼吸系統(tǒng)慢性傳染病，其感染率高，全球豬場(chǎng)均存在不同程度的MPS[1]。MPS 的剖檢病變特征為肺臟尖葉和心葉呈“ 肉樣”或“ 蝦肉樣”實(shí)變，也稱(chēng)之為“ 胰腺樣變”[2]。哺乳仔豬、保育豬、育肥豬、公豬以及母豬均能夠感染 Mhp[3]。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，全球豬群MPS 感染陽(yáng)性率約為70 %～80 %，發(fā)病率為40 %以上[4]。患病豬生長(zhǎng)發(fā)育不良，料肉比高[5-7]，極大的增加了養(yǎng)殖成本并降低了豬肉的品質(zhì)。因此，研究如何對(duì)該病進(jìn)行有效防控具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

對(duì)于該病的防治措施主要是使用抗菌藥物以及疫苗免疫，但由于Mhp 易產(chǎn)生耐藥性，所以疫苗免疫是目前防控該病的主要發(fā)展方向[6]。目前商品化MPS 疫苗的種類(lèi)繁多，免疫方式或免疫程序多樣，如何制定科學(xué)合理的免疫程序，使豬群既能夠獲得良好的免疫效果又不至于造成嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)，是每個(gè)豬場(chǎng)急需解決的問(wèn)題[8]。本研究選取市場(chǎng)上較為常用的MPS 滅活苗和弱毒活疫苗單獨(dú)或聯(lián)合免疫，對(duì)免疫豬群的應(yīng)激反應(yīng)及免疫效果進(jìn)行檢測(cè)評(píng)估，為豬場(chǎng)MPS 免疫程序的制定以及疫苗的開(kāi)發(fā)生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 疫苗及實(shí)驗(yàn)豬來(lái)源 MPS 滅活苗和弱毒活疫苗(廠(chǎng)家試驗(yàn)證明該疫苗株不能水平傳播)購(gòu)自某公司生產(chǎn)的市售產(chǎn)品(公司已批準(zhǔn)該試驗(yàn))；實(shí)驗(yàn)豬購(gòu)自山東省興岳綠源養(yǎng)殖場(chǎng)，該豬場(chǎng)經(jīng)產(chǎn)母豬產(chǎn)后10 d經(jīng)MPS 活疫苗滴鼻同時(shí)滅活苗聯(lián)合免疫，豬群常規(guī)免疫豬瘟、豬偽狂犬病及豬圓環(huán)病毒病疫苗。

1.2 主要試劑 肌酸激酶及乳酸脫氫酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；皮質(zhì)醇放射免疫分析藥盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所；MPS 抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自IDEXX 公司；豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病毒(PRV)及豬圓環(huán)病毒2 型(PCV2)抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自韓國(guó)金諾公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)豬的疫苗免疫 本實(shí)驗(yàn)選取40 頭10日呈陰性齡仔豬，實(shí)驗(yàn)豬經(jīng)鼻拭子采樣PCR 檢測(cè)無(wú)Mhp感染，引物如表1 所示[9]。將實(shí)驗(yàn)豬隨機(jī)平均分為4組，編號(hào)為 A、B、C、D組，每組 10 頭，每頭豬打耳號(hào)后仍由原母豬哺乳飼養(yǎng)，斷奶后，將4組豬混合大群同欄飼養(yǎng)，保證生長(zhǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)方式以及營(yíng)養(yǎng)狀況等因素完全相同。A組肌肉注射免疫滅活疫苗，2 mL/ 頭份；B組弱毒活疫苗噴鼻免疫，1 mL/ 頭份；C組每頭肌肉注射滅活疫苗2 mL 同時(shí)活疫苗1 mL 噴鼻免疫；D組為空白對(duì)照(不免疫)。

表1 Mhp 特異性引物Table 1 Mhp specific primers

1.4 應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 疫苗免疫后1 d～3 d，每天仔細(xì)觀(guān)察并記錄仔豬的各種臨床表現(xiàn)，如采食、飲水和精神狀態(tài)等。疫苗免疫后第3 d，每組隨機(jī)選取5 頭豬經(jīng)前腔靜脈采血，分離血清后置-80 ℃凍存，進(jìn)行血清肌酸激酶(CK)活力、乳酸脫氫酶(LDH)活力、皮質(zhì)醇激素(Cor)以及血清應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，檢測(cè)方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 Mhp 病原檢測(cè) 豬在疫苗免疫180 d 后出欄屠宰，分別從每組豬的肺尖葉和心葉取少量肺組織，將每頭豬肺組織樣品混合，加入滅菌PBS 研磨成勻漿，-80 ℃反復(fù)凍融 3 次，9 000 r/min 離心 5 min，取上清 200 μL，提取核酸，-20 ℃凍存?zhèn)溆?。按? 退火溫度，30 個(gè)循環(huán)后，PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 Mhp 抗體檢測(cè) 分別在免疫后 3 d、30 d、90 d、180 d，經(jīng)前腔靜脈采血，分離血清，利用 ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)免疫豬Mhp 抗體水平。

1.7 免疫豬群體重的變化 疫苗免疫時(shí)對(duì)各組豬只稱(chēng)重，計(jì)算每組豬的平均初始體重；免疫后180 d各組豬屠宰時(shí)再次稱(chēng)重，計(jì)算各組豬的平均出欄重，計(jì)算平均增重。

1.8 肺臟眼觀(guān)病變?cè)u(píng)分 將飼養(yǎng)180 d 的豬屠宰后，摘取各組豬的完整肺臟，采用100 分制評(píng)估豬肺臟病變程度(表2)，計(jì)算各肺葉體積占整肺體積的比例對(duì)各個(gè)肺葉進(jìn)行評(píng)級(jí)[10](左尖葉5 %、右尖葉6 %、左心葉 7 %、右心葉 9 %、左隔葉 32 %、右隔葉36 %、副葉5 %)，并根據(jù)肺臟表面肉眼可見(jiàn)病變面積占該肺葉表面積的比例，計(jì)算統(tǒng)計(jì)將各肺葉病變比例相加求和評(píng)定肺臟病變等級(jí)。

表2 肺臟病變比例與等級(jí)判定Table 2 The proportion of lung lesions and the degree

1.9 肺臟鏡檢病變?cè)u(píng)分 將每組豬肺臟的7 個(gè)肺葉單獨(dú)取樣，常規(guī)方法制作石蠟切片，HE 染色，鏡檢肺組織間質(zhì)性肺炎病變，據(jù)病變程度分為無(wú)病變、輕度、中度、重度間質(zhì)性肺炎 4 個(gè)等級(jí)，分別計(jì) 0 分、1 分、2 分、3 分，將每組豬肺臟的 7 個(gè)肺葉病變分?jǐn)?shù)相加，統(tǒng)計(jì)肺臟總體病變程度，最后計(jì)算出每組豬的肺臟平均病變程度。

1.10 常見(jiàn)病毒病的抗體水平檢測(cè) 取免疫后30 d、90 d、180 d 采集的血清，采用 ELISA 試劑盒對(duì) CSFV、PRRSV、PRV gE、PCV2 抗體水平進(jìn)行檢測(cè)，分析不同的MPS 疫苗免疫對(duì)常見(jiàn)病毒病疫苗免疫或感染產(chǎn)生的影響。

2 結(jié) 果

2.1 疫苗免疫后各組豬應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

2.1.1 CK 活力值檢測(cè) 經(jīng)試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，A組、B組、C組豬CK活力值分別為0.303 U/mgprot、0.43 U/mgprot、0.673 U/mgprot，均比對(duì)照組豬CK活力值 0.282 U/mgprot 高；其中 A組豬 CK活力值最低，C組豬CK 活力值明顯高于其他組，差異極顯著(p＜0.01) (圖1)，表明 A組疫苗免疫對(duì)豬群應(yīng)激反應(yīng)較小，C組疫苗免疫對(duì)豬群應(yīng)激反應(yīng)相對(duì)較大。

圖1 各組豬平均CK 活力值檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Average CK activity values of pigs in each group

2.1.2 LDH 活力值檢測(cè) 經(jīng)試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，A組、B組、C組豬 LDH 活力值分別為 3981.699 U/L、4339.869 U/L、4094.118 U/L，與對(duì)照組豬 3688.889 U/L相比，有升高的趨勢(shì)，其中A組豬 LDH 活力值最低，B組豬LDH 活力值最高，但統(tǒng)計(jì)分析差異不顯著(p＞0.05) (圖2)，表明各組疫苗免疫豬后，對(duì) LDH水平影響不顯著。

圖2 各組豬平均LDH 活力值檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Average LDH activity values of pigs in each group

2.1.3 Cor 活力值的檢測(cè) 經(jīng)試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，A組、B組、C組豬 Cor 活力值分別為 89.85 pg/mL、92.91 pg/mL、150.05 pg/mL，與對(duì)照組豬 81.61 pg/mL比較有明顯的升高，其中 A組豬 Cor 最低，C組Cor 高于其它組，差異極顯著(p＜0.01) (圖3)，表明A組疫苗免疫對(duì)豬群應(yīng)激反應(yīng)較小，C組疫苗對(duì)豬群應(yīng)激反應(yīng)較大。

2.1.4 應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)整體分析 疫苗免疫后，應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，A組疫苗免疫對(duì)豬應(yīng)激反應(yīng)較小，C組疫苗免疫對(duì)豬應(yīng)激反應(yīng)相對(duì)較大。但從豬整體情況來(lái)看：各組疫苗免疫后，對(duì)豬的精神狀態(tài)、采食量、飲水量均未見(jiàn)明顯影響，表明各組疫苗免疫均未對(duì)豬造成嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)。

圖3 各組豬平均Cor 活力值檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Average Cor activity values of pigs in each group

2.2 各組豬Mhp 病原檢測(cè) 180 d 屠宰后取各組豬的肺臟進(jìn)行 PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示：對(duì)照組 Mph 豬陽(yáng)性率最高，為 50 % (5/10)；A組、B組、C組豬同樣存在Mhp 感染，但陽(yáng)性率較低，3組豬陽(yáng)性率分別為 ：A組 40 % (4/10)；B組 30 % (3/10)；C組30 % (3/10)，表明 A、B、C組經(jīng)疫苗免疫后，均有效降低了豬群Mhp 的感染率。

2.3 各組豬Mhp 抗體水平檢測(cè) 免疫后不同時(shí)間各組豬抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，B、C組豬Mhp 抗體陽(yáng)性率明顯高于 A組。在疫苗免疫后 30 d，B、C組豬抗體陽(yáng)性率均為 80 %，A組僅為 40 %。S/P 值A(chǔ)、B、C組分別為0.452、0.641、0.782，C組 最高，B組次之，B、C組均達(dá)到了較高的抗體水平；疫苗免疫后90 d，雖然抗體水平雖然有所降低，3個(gè)免疫組豬抗體陽(yáng)性率均為 60 %，B、C組豬 S/P值分別為0.790、0.773，但仍維持在較高的抗體水平，A組抗體水平較低，維持在 0.48 左右，表明 A組疫苗免疫后，機(jī)體未產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答反應(yīng)；在免疫后 30 d 與 90 d 時(shí)，對(duì)照組豬的抗體陽(yáng)性率為0。根據(jù)相關(guān)資料查閱得知母源抗體一般維持3～4 周，對(duì)照組豬免疫后 3 d (13日齡)，Mhp 抗體陽(yáng)性率高達(dá)100 %，而免疫后30 d 其抗體陽(yáng)性率為0，表明母源抗體存在時(shí)間 ＜40日齡，這一實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合母源抗體消減規(guī)律；結(jié)合免疫后180 d 迫殺時(shí)各組豬 Mhp 病原檢測(cè)均為陽(yáng)性(表3，圖4)，表明各疫苗免疫組后期均未能阻止Mhp 感染。

2.4 免疫豬平均增重結(jié)果 A組、B組、C組豬與對(duì)照組相比，平均增重分別提高了1.37 %、13.38 %和21.53 % (圖5)；C組豬平均日增重明顯高于其它組，差異顯著(p＜0.05)。表明 C組疫苗免疫對(duì)豬產(chǎn)生了較好保護(hù)，提高了其生產(chǎn)性能。

表3 免疫后不同時(shí)間各組豬平均抗體陽(yáng)性率檢測(cè)結(jié)果Table 3 The average positive antibody rate of each group at each stage

圖4 各階段每組豬抗體平均水平Fig.4 Levels of antibody in each group at each stage

圖5 各組豬免疫后的平均增重水平Fig.5 The average body weight-gain of the pigs in each group

2.5 免疫豬肺臟病變?cè)u(píng)分

2.5.1 肺臟眼觀(guān)病變?cè)u(píng)分 對(duì)各組豬肺臟眼觀(guān)病變測(cè)量及計(jì)算，結(jié)果顯示，A組、B組、C組、D組豬肺臟總體病變比例分別為35.71 %、37.67 %、32.49 %、47.25 %，病變程度D組＞B組＞A組 ＞C組，對(duì)照組豬病變程度最高，與其它組相比差異顯著(p＜0.05)，C組病變程度最輕。表明，疫苗免疫后，均可以減少肺臟的病變程度，其中C組疫苗免疫效果最好，更加有效的減輕了肺臟的病變程度。

2.5.2 免疫豬肺臟鏡檢病變?cè)u(píng)分 為了進(jìn)一步判定Mhp 對(duì)不同免疫程序的豬肺臟感染程度，將肺臟鏡檢評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)設(shè)立如下(表4)。結(jié)果顯示：A組、B組、C組、D組肺臟病變分?jǐn)?shù)分別為：50、45、38、59。其中D組和A組肺臟鏡檢病變最嚴(yán)重，肺泡壁增厚，支氣管周?chē)馨图?xì)胞浸潤(rùn)，呈嚴(yán)重的間質(zhì)性肺炎病變，C組肺臟鏡檢病變程度較輕。表明A組疫苗免疫后，未對(duì)豬肺臟產(chǎn)生較好的保護(hù)；B組對(duì)豬肺臟的保護(hù)也較差；C組疫苗免疫后，有效減少了肺臟病變的產(chǎn)生，獲得了較好的免疫保護(hù)。

表4 各組豬肺臟鏡檢評(píng)分Table 4 The pulmonary microscopy scores

2.6 常見(jiàn)病毒病抗體水平檢測(cè) 將免疫后不同時(shí)間各組豬的血清進(jìn)行 CSFV、PRRSV、PRV gE、PCV2抗體水平檢測(cè)，結(jié)果顯示各組之間抗體平均OD450nm值未見(jiàn)明顯差異(p＞0.05) (圖6)，表明各組豬經(jīng)MPS疫苗免疫后未對(duì) CSFV、PRRSV、PRVgE、PCV2 的血清抗體水平產(chǎn)生顯著影響。各組豬免疫后具體指標(biāo)如表5所示。

圖6 免疫后不同時(shí)間各組豬常見(jiàn)病毒抗體水平的比較Fig.6 Comparison of antibody levels at different days post vaccinations

表5 各組豬綜合指標(biāo)Table 5 Comprehensive indicators of each group

3 討 論

MPS 是造成豬場(chǎng)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的重要疫病之一，如何有效防控Mhp 感染是每個(gè)豬場(chǎng)急需解決的問(wèn)題。本研究采用MPS 滅活疫苗以及弱毒活疫苗可單獨(dú)或聯(lián)合免疫，進(jìn)行Mph 病原、應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)以及有關(guān)疾病的抗體檢測(cè)，計(jì)算平均增重并進(jìn)行肺臟病變?cè)u(píng)分，為MPS 免疫程序的科學(xué)制定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，達(dá)到有效控制MPS 的目的。

疫苗免疫后血清應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)顯示，滅活苗免疫組豬血清 CK、LDH 以及 Cor 的含量較低，而活苗免疫組豬含量較高，表明滅活苗免疫應(yīng)激反應(yīng)小于活疫苗免疫，尤其是弱毒苗與滅活苗聯(lián)合免疫會(huì)產(chǎn)生更加明顯的應(yīng)激反應(yīng)。但從豬整體情況來(lái)看，各疫苗免疫后未見(jiàn)明顯的異常表現(xiàn)，表明各組疫苗免疫均未對(duì)豬產(chǎn)生嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)。

對(duì)肺組織的Mhp 病原檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組豬陽(yáng)性率最高，3 個(gè)免疫組豬后期同樣存在Mhp 感染，但陽(yáng)性率較低，表明疫苗免疫雖然不能完全阻斷 Mhp 感染，但能有效降低豬 Mhp 的感染率。Villarreal 等比較了田間條件下疫苗免疫對(duì)仔豬Mhp 感染的影響，免疫組和對(duì)照組豬的Mhp 檢出率分別為14 %和 36 %[11]，這表明 MPS 疫苗不能完全阻止Mhp 的感染定植，部分豬被感染，但與對(duì)照組相比，疫苗免疫降低了豬的病原檢出率，本研究結(jié)果與該報(bào)道一致。

對(duì)疫苗免疫后各組Mhp 抗體水平檢測(cè)結(jié)果表明，活苗免疫組和聯(lián)合免疫組具有更高的抗體陽(yáng)性率，兩者陽(yáng)性率相同。但聯(lián)合免疫組免疫后30 d 檢測(cè)抗體S/P 值明顯高于活疫苗免疫組，滅活苗免疫組抗體水平較低。表明采用MPS 滅活疫苗和弱毒活疫苗聯(lián)合免疫，更能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。同時(shí)，對(duì)照組豬抗體水平趨勢(shì)顯示，40日齡時(shí)母源抗體已消失；在疫苗免疫后180 d 各組豬抗體水平急劇上升，抗體陽(yáng)性率均為100 %，表明豬在100日齡后全部發(fā)生了Mhp 感染，這是否意味著早期一次疫苗免疫，在免疫后90 d～180 d 時(shí)，疫苗保護(hù)力有所下降已不足以保護(hù)豬免受Mhp 的感染，一免后間隔一段時(shí)間加強(qiáng)免疫是否會(huì)取得更好的免疫效果，有待于試驗(yàn)驗(yàn)證。

對(duì)豬平均增重對(duì)比結(jié)果顯示C組豬平均日增重明顯高于A(yíng)、B 兩組，表明滅活苗和活苗聯(lián)合免疫對(duì)豬產(chǎn)生了較好保護(hù)，提高了其生產(chǎn)性能。Maes 等對(duì)不同商品豬經(jīng)MPS 疫苗免疫對(duì)其平均日增重的影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)免疫可以使豬的平均日增重提2 %～8 %[12]，與本研究結(jié)果一致。

對(duì)肺臟眼觀(guān)以及鏡檢病變?cè)u(píng)分，總體來(lái)看，疫苗免疫后各組豬肺臟病變程度均小于空白對(duì)照組，表明疫苗免疫后能對(duì)豬肺臟產(chǎn)生免疫保護(hù)。但鏡檢顯示滅活苗免疫組豬的肺臟MPS 的特征性病變?nèi)匀惠^明顯，病變較重，其對(duì)豬肺臟的保護(hù)力較低；活疫苗單獨(dú)免疫組豬的肺臟病變也較明顯甚至眼觀(guān)病變?cè)u(píng)分還不如滅活苗單獨(dú)免疫組；聯(lián)合免疫組豬的肺臟病變比例小，病變程度輕，對(duì)豬肺臟產(chǎn)生了較好保護(hù)。

各組豬 CSFV、PRRSV、PRVgE、PCV2 抗體水平差異不顯著，表明各組MPS 疫苗免疫未對(duì)常見(jiàn)病毒病疫苗免疫或感染產(chǎn)生顯著影響。該實(shí)驗(yàn)還意外發(fā)現(xiàn)，在豬未免疫 PRRSV 疫苗的背景下，MPS 疫苗免疫后90 d 檢測(cè)時(shí)PRRSV 抗體呈陰性，免疫后180 d，PRRSV 抗體呈陽(yáng)性，表明豬在育肥后期感染了 PRRSV；豬在 10日齡時(shí)免疫 PCV2，免疫后30 d 抗體水平較高，免疫后90 d 時(shí)抗體水平呈陰性，表明豬體內(nèi)PCV2 抗體水平消失，出欄屠宰時(shí)PCV2 抗體水平呈強(qiáng)陽(yáng)性，S/P 值急劇升高，表明實(shí)驗(yàn)豬在100日齡后也發(fā)生了PCV2 感染。

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，MPS 滅活疫苗和弱毒活疫苗聯(lián)合免疫的效果顯著好于二者的單獨(dú)免疫，聯(lián)合免疫雖然應(yīng)激反應(yīng)較大，但對(duì)豬未產(chǎn)生明顯的不良影響。另外，1 次免疫3 個(gè)月后免疫保護(hù)力會(huì)明顯下降，存在感染風(fēng)險(xiǎn)。由于條件限制本次實(shí)驗(yàn)每組僅設(shè)10 只實(shí)驗(yàn)豬，因此結(jié)論是基于較少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物得出的，具有一定的誤差，對(duì)于生產(chǎn)實(shí)際的指導(dǎo)作用有待于大數(shù)據(jù)的驗(yàn)證和支持。

基于試驗(yàn)結(jié)果，自繁自養(yǎng)場(chǎng)MPS 的免疫可參考如下免疫程序：(1)商品豬免疫程序：7日齡～10 齡活疫苗1 倍量滴鼻，同時(shí)滅活苗1 倍量肌肉注射；若豬場(chǎng)感染壓力大建議二次加強(qiáng)免疫，即28日齡左右滅活苗1 倍量肌肉注射。(2)種豬：前期按商品仔豬免疫；后備豬配種前兩次滅活苗肌肉注射，間隔4 周；經(jīng)產(chǎn)母豬產(chǎn)后21 d 滅活苗肌肉注射。