四川部分地區(qū)犬圓環(huán)病毒的病原檢測(cè)及基因組特征

嚴(yán) 楠，馮 帆，李明翔，湯 承，岳 華

(西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041)

犬圓環(huán)病毒(Canine Circovirus, CanineCV)是無囊膜的環(huán)狀單鏈DNA 病毒，于2012年首次在美國(guó)發(fā)現(xiàn)[1]。隨后的研究表明，該病毒可以引起犬急性腹瀉、嘔吐等癥狀[2-3]。作為一種新型圓環(huán)病毒，CanineCV 對(duì)犬科動(dòng)物的危害受到越來越多的關(guān)注[4-5]。CanineCV 不僅存在于犬的腸道內(nèi)，還在其肝臟、脾臟和淋巴組織中被檢測(cè)到，表明該病毒可能與宿主免疫抑制有關(guān)[2]，其致病機(jī)制可能與豬圓環(huán)病毒2型(Porcine Circovirus，PCV-2)相似[6-7]。最近的研究顯示，CanineCV常與犬細(xì)小病毒2型(Canine parvovirus，CPV-2)、犬冠狀病毒(Canine Coronavirus，CCoV)和犬瘟熱病毒(Canine distempervirus，CDV）共感染，在腸道疾病中起協(xié)同作用從而導(dǎo)致臨床癥狀加重[6]；或者在其它病原體損傷宿主腸道上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞后，CanineCV 的致病性發(fā)生變化，從而加重病情[7]。由于CanineCV 還沒有合適的細(xì)胞培養(yǎng)體系，其確切的致病性仍不清楚。目前，Gen-Bank 中所有完整的CanineCV 基因組大小均為2 063 nt，具有3 個(gè)開放閱讀框(ORF)，其中ORF1 編碼病毒復(fù)制酶蛋白(Rep)，ORF2編碼衣殼蛋白(Cap)，ORF3編碼的蛋白功能尚不清楚[1,3-4]。

該病毒目前已在美國(guó)、意大利、泰國(guó)和德國(guó)等地區(qū)流行[1,3,5,8]，但國(guó)內(nèi)關(guān)于該病毒的研究報(bào)告較少。2016年孫文超等從廣西地區(qū)20份犬血清樣本中檢測(cè)出 1份CanineCV 陽性并獲得其基因組，隨后建立了 CanineCV 熒光定量 PCR 檢測(cè)方法[9-10]；汪偉等進(jìn)行了CanineCV Rep 蛋白的原核表達(dá)及CanineCV ORF3 基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建[4,11]；但CanineCV 在國(guó)內(nèi)的流行狀況仍不清楚，還未見到對(duì)犬腹瀉樣本進(jìn)行CanineCV 調(diào)查的報(bào)道。本研究采用熒光定量PCR 方法檢測(cè)四川部分地區(qū)犬腹瀉樣本的CanineCV，豐富該病原在國(guó)內(nèi)的流行病學(xué)資料；采用PCR 方法擴(kuò)增出6 個(gè)完整的CanineCV Rep 基因序列以及1 株CanineCV 四川流行株的完整基因組，有助于了解CanineCV 國(guó)內(nèi)流行株的遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 犬腹瀉樣品 208份寵物犬腹瀉糞便樣品于2015年～2017年采集自四川省6 家寵物醫(yī)院，其中141份來自成都市 4 家寵物醫(yī)院(2015年39份、2016年62份和 2017年40份)，32份來自西昌 市 1家寵物醫(yī)院(2015年10份、2016年12份和 2017年10份)，35份來自遂寧市 1 家寵物醫(yī)院(2015年12份 、2016年13份和 2017年10份)。取適量糞 便樣品與PBS 緩沖液，按照1∶10 的比例稀釋渦旋振蕩5 min，4 ℃ 12 000 r/min 離心 15 min。離心后取上清液置于EP 管中，儲(chǔ)存在-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 膠回收提取試劑盒、核酸提取試劑盒購自O(shè)MEGA BIO-TEK公司。DNA Marker Ⅱ 、TRIzolTM、Prime ScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD19-T 載體試劑盒均購自 TaKaRa 公司。E.coliDH5α 購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 犬腹瀉糞便樣本的檢測(cè) 采用核酸提取試劑盒提取 208份犬糞便樣本的 DNA，根據(jù) Hsu[8]建立的CanineCV 的熒光定量 PCR 方法對(duì) 208份糞便樣本DNA 進(jìn)行檢測(cè)。按照TRIzol 試劑盒說明書提取CanineCV 陽性糞便樣本 RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。隨后對(duì)CanineCV 陽性樣本參照文獻(xiàn)[12]分別檢測(cè) CPV-2、CCoV 和 CDV，以調(diào)查該樣品混合感染情況。

1.4 CanineCV 完整Rep 基因的擴(kuò)增及序列分析參考文獻(xiàn)[9]中的引物(Rep-F：5'-GTATTACCCGG CACCTCGTC-3' 和 Rep-R：5'-CGGAGCGAGAGGCC TTTATC-3')擴(kuò)增Rep 全基因，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以提取的CanineCV陽性樣本 DNA 為模板，采用 25 μL 反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為 94 ℃ 5 min；94 ℃ 55 s、56 ℃ 50 s、72 ℃1 min，共 40 個(gè) 循環(huán) ；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn) 物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收純化后克隆至pMD19-T 載體，篩選陽性重組質(zhì)粒，重組菌液由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序鑒定。測(cè)序后將所獲得序列與GenBank 中的相似序列應(yīng)用MegAlign(DNAStar 7.0)軟件進(jìn)行同源性分析，并采用MEGA 7 軟件 ClustalW 法進(jìn)行序列比對(duì)，利用Neighbor-Joining 法建立系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，重復(fù)次數(shù)為1000。

1.5 CanineCV 四川株(CD17/2016)全基因組擴(kuò)增及分析 設(shè)計(jì)3 對(duì)擴(kuò)增上述獲得的CanineCV 四川株(CD17/2016)的全基因組的引物，其中1 對(duì)引物參照 文 獻(xiàn) [9](Rep-F：5'-GTATTACCCGGCACCTCGTC-3'/Rep-R：5'-CGGAGCGAGAGGCCTTTATC-3')，另外兩對(duì)引物參照GenBank 中登錄的CanineCV 序列(KC241984 和 KT734814)設(shè)計(jì)(CanineCV-P2F：5'-TA TCGGCGGCTCAGTATCAT-3'/CanineCV-P2R：5'-CA GACACTTCTACATCCCAAATC-3'；CanineCV-P3F：5'-TCGTGACACTGAATGGCGTTTG-3'/Canine CVP3R：5'-GAGGTGTGCTGTGTCTGTGACGAGG-3')。以CD17/2016 的 DNA 為模板，利用3 對(duì)引物分別擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序后利用SeqMan (DNAStar 7.0)軟件拼接序列。將獲得的CanineCV 全基因組序列利用BLAST 軟件(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)與參考序列比較分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)分析不同年份CanineCV 的陽性率，采用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，檢驗(yàn)方法為 χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 CanineCV 的陽性率及與其它病原共感染的情況 采用PCR 方法檢測(cè)四川部分地區(qū)CanineCV 的感染情況，結(jié)果顯示，208份犬腹瀉糞便樣品中共檢出32 個(gè) CanineCV 陽性樣本，平均陽性率為 15.4%；成都市的平均陽性率為16.3 % (23/141)；西昌市的平均陽性率為12.5 % (4/32)；遂寧市的平均陽性率為14.3 % (5/35)。32份 CanineCV陽性樣品中，25份與 CPV-2 混合感染，18份與 CCoV 混合感染，14份與CDV 混合感染。對(duì)不同年份的CanineCV 陽性率統(tǒng)計(jì)與分析，結(jié)果顯示，3年間CanineCV 的陽性率無顯著差異(p＞0.05) (表1)。本研究首次對(duì)國(guó)內(nèi)腹瀉犬糞便樣本進(jìn)行了CanineCV 的調(diào)查，結(jié)果表明CanineCV 已經(jīng)在四川部分地區(qū)腹瀉寵物犬中流行，并且與 CPV-2、CCoV 和 CDV 混感率很高，這與對(duì)美國(guó)和臺(tái)灣地區(qū)的犬腹瀉糞便中CanineCV 感染的調(diào)查結(jié)果相似[2,8]。已經(jīng)證實(shí)，CanineCV 與 CPV-2等重要腸道病毒的混合感染會(huì)加重患病犬的臨床表現(xiàn)并使得治療更加困難[6-7]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于犬腹瀉病原的診斷常限于 CPV-2、CCoV 和 CDV 等常見病原，本研究結(jié)果建議把CanineCV 作為犬腹瀉病原診斷的一個(gè)檢測(cè)內(nèi)容。

2.2 CanineCV Rep 基因序列分析 利用引物Rep-F/Rep-R 從 6份陽性樣品中擴(kuò)增出了 984 bp 的目的片段，克隆后測(cè)序獲得了 6 株 CanineCV(CDX2/2017、CDX8/2017、CQS2/2016、CQS8/2016、CQM7/2016 和 CD17/2016) 完整的 Rep 基因序列(MG266900～MG266904 和 MG266899)，序列長(zhǎng)度均為 912 bp，編碼303aa?；诤塑账嵝蛄型葱苑治鲲@示6 株Rep 序列同源性為99.6 %～99.9 %，與GenBank 中參考株的Rep 基因序列同源性為82.5 %～97.6 %。遺傳進(jìn)化分析顯示，本研究獲得的6 條Rep 基因序列與部分意大利、德國(guó)和美國(guó)病毒株聚在一個(gè)大分支，但聚為一個(gè)獨(dú)特的亞支(圖1)，本研究6 條 Rep 基因序列與GenBank 中的其它 CanineCV Rep 序列相比有4 個(gè)相同核苷酸的同義替換(51T、195T、234T、345C)。Rep 蛋白為 CanineCV 基因組中最大的 ORF1 所編碼，主要參與病毒的復(fù)制[11]。為進(jìn)一步研究中國(guó)CanineCV Rep 基因的分子特征，本研究獲得了6 條完整的CanineCV Rep 基因序列。結(jié)果顯示中國(guó)CanineCV 株的Rep 基因具有遺傳多樣性，而四川部分地區(qū)的 CanineCV 株的 Rep 基因具有4 個(gè)相同核苷酸的同義替換，表現(xiàn)出共進(jìn)化的趨勢(shì)。盡管CanineCV Rep 中同義替換的意義還不清楚，但在鴨圓環(huán)病毒和類圓環(huán)病毒中，Rep 序列中的同義替換時(shí)有發(fā)生，可能是進(jìn)化過程中的中性選擇壓力所導(dǎo)致的[13-14]。

表1 犬腹瀉糞便樣品CanineCV 陽性率及混合感染結(jié)果Table 1 Analysis of the CanineCV positive samples

2.3 CanineCV 基因組序列分析 利用引物Rep-F/Rep-R、CanineCV-P2F/CanineCV-P2R 和 Canine CV-P3F/CanineCV-P3R 從1份陽性樣品中擴(kuò)增出了984 bp、391 bp 和 970 bp 的目的片段，測(cè)序后拼接獲得了的CanineCV CD17/2016 株的完整基因組序列(MG266899)?；?因組 長(zhǎng) 度 為 2 063 bp，共 3 個(gè)ORF，其 ORF1 編碼病毒復(fù)制酶蛋白 Rep (303aa)；ORF2 編碼病毒衣殼蛋白 Cap (270aa)；ORF3 全長(zhǎng)519 bp，編碼 172aa。CD17/2016 的基因組有兩個(gè)位于起始密碼子和終止密碼子之間的基因間隔區(qū)(長(zhǎng)度為 203 bp 和 135 bp)。相比于其它 CanineCV 株，包括本研究中獲得的另外5 條Rep 基因序列，CD17/2016 株的Rep 基因中共有10 個(gè)核苷酸的非同義替換，導(dǎo)致Rep 蛋白具有7 個(gè)獨(dú)特的氨基酸變化(255H、256F、257Y、258T、279R、297S、299T)，所有的變化均集中在Rep 蛋白aa255～aa299 之間，位于 Rep 的 3' 端。目前關(guān)于 CanineCV Rep 基因各區(qū)域的功能尚不清楚，但來自PCV-2 的研究表明，Rep 3' 端區(qū)域的氨基酸變化可以導(dǎo)致PCV-2 的致病性改變[15]。因此，有必要進(jìn)一步研究 CanineCV CD17/2016 株Rep 3' 端區(qū)域氨基酸變化的生物學(xué)意義。

本研究首次對(duì)國(guó)內(nèi)犬腹瀉樣本進(jìn)行CanineCV感染的調(diào)查，結(jié)果顯示CanineCV 已經(jīng)在四川部分地區(qū)的寵物犬中流行，因此建議把CanineCV 作為犬腹瀉病原診斷的一個(gè)檢測(cè)內(nèi)容。本研究獲得了1株 CanineCV 四川株的全基因組，與國(guó)內(nèi)登錄在GenBank 的另外兩個(gè)基因組(KT946839.1 和MF797786.1)遺傳距離關(guān)系較遠(yuǎn)，有助于了解 CanineCV 國(guó)內(nèi)流行株的遺傳多樣性。

圖1 基于Rep 全基因核苷酸序列遺傳進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic tree (N-J) based on the complete Rep gene of CanineCV