肝片吸蟲MeCatL-B融合基因的構(gòu)建、表達及其間接ELISA檢測方法的建立

王熙鳳，孟慶玲*，喬 軍，張 凱，張國武，貢莎莎，黃運福，才學(xué)鵬

(1.石河子大學(xué) 動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

肝片吸蟲病是由肝片吸蟲(Fasciola hepatica，F(xiàn)h)寄生于牛、羊等反芻動物肝臟膽管中引起的一種蠕蟲病。家畜常在放牧中食含囊蚴的牧草被感染，囊蚴在宿主體內(nèi)約經(jīng)7 周～8 周進入肝膽管中[1]，以組織細胞和血液為食，造成肝臟出血和穿孔，引發(fā)肝炎、膽管炎及全身性中毒等癥狀[2]。Fh 成蟲每天可產(chǎn)生約20 000～24 000 個蟲卵隨糞便和膽汁排出體外[3]，嚴重威脅人畜健康。片形吸蟲病在全世界廣泛流行，每年造成經(jīng)濟損失達 20～30 億美元[4-5]，被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為重要的人獸共患寄生蟲病之一。

Fh 病傳統(tǒng)的診斷方法是檢測糞便中的蟲卵檢測，然而只有當蟲體進入膽管發(fā)育成熟后(感染后約12 周)才會排卵[6]，因此糞便蟲卵檢查不適合 Fh 早期感染的診斷。目前，常用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清中特異性抗體來診斷該病，該方法可以在感染后 2 周～4 周檢出，且檢出率相對較高，F(xiàn)h排泄分泌產(chǎn)物(Excretory-secretory products，ESP)常 用作包被抗原進行ELISA 檢測[7]。

ESP 抗原在蟲體侵襲宿主、免疫逃避及應(yīng)對環(huán)境改變等方面發(fā)揮著重要作用[8]。組織蛋白酶(Cathepsin，Cat)是 ESP 中最豐富的蛋白水解酶，占Fh ESP 總分泌量的 10 %～27 %[9]，Cat 中不同種類的組織蛋白酶 L 和 B 蛋白(CatL、CatB)可以在成蟲期和童蟲期分泌表達[10]，是Fh 完成體內(nèi)寄生必不可少的蛋白酶。目前，對于 CatL 和 CatB 的免疫學(xué)特性已有一定研究，但對兩種蛋白融合表達的研究較少。因此，本研究對CatL1D和CatB4 基因的優(yōu)勢抗原表位集中區(qū)段進行融合，原核表達rMeCatL-B 后經(jīng) western blot 分析其反應(yīng)原性，以 rMeCatL-B 為抗原建立一種檢測Fh 特異性抗體的間接ELISA 方法，為Fh 病血清學(xué)診斷試劑盒的研發(fā)奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及實驗動物 大腸桿菌DH5α 和BL21 (DE3)感受態(tài)細胞、原核表達載體pET-32a(+)和Fh 成蟲均由石河子大學(xué)寄生蟲實驗室保存；21份Fh 陰性血清、綿羊細粒棘球蚴(Eg)陽性血清由本實驗室鑒定并保存；綿羊細頸囊尾蚴(Ct)陽性血清、綿羊弓形蟲(Tg)陽性血清、綿羊Fh 標準陽性血清均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所惠贈；97份待檢綿羊臨床血清樣品采自新疆庫車縣和沙灣縣牧區(qū)。

1.2 主要試劑 TransStartFastPfu Fly DNA Polymerase 試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA Marker、pMD19-T (simple)、T4 DNA Ligase、限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、IPTG、蛋白Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自 TaKaRa 公司；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、TMB 和 DAB 顯色劑均購自天根生化科技(北京)有限公司；TRIzol 購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗綿羊IgG-HRP 購自康為世紀生物公司；商品化Fh抗體ELISA 試劑盒購自上海北諾生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計根據(jù)GenBank 中CatL1D(EU835857.1)和CatB4 (KM099340.1)的基因序列，利用 ABCpred 和 DNAStar 等軟件分析CatL1D和CatB4 基因中的優(yōu)勢抗原表位，根據(jù)優(yōu)勢抗原表位集中區(qū)段設(shè)計2 對特異性引物(表1)，CatL1D(315 bp～723 bp)和CatB4 (111 bp～513 bp)基因預(yù)期擴增長度分別為408 bp 和402 bp，引物由華大基因生物公司合成。

表1 引物序列及酶切位點Table 1 Primer sequences and restriction sites

1.4 FhMeCatL-B融合基因的構(gòu)建 利用TRIzol法提取綿羊 Fh 的總 RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。以 cDNA 為模板，利用 2 對特異性引物分別擴增CatL1D和CatB4 基因。PCR反應(yīng)體系為：5×PrimeSTAR Buffer 10 μL，dNTP Mixture 4 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各 1 μL，DNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 補足至 25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 4 min、94 ℃ 40 s、63 ℃40 s、72 ℃ 40 s，35 個循 環(huán)；72 ℃ l0 min。擴增產(chǎn)物分別經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目的條帶，將回收的CatL1D和CatB4 擴增產(chǎn)物等體積混合作為模板，以CatL1D-F/CatB4-R 為引物進行重疊延伸PCR反應(yīng)，獲得MeCatL-B融合基因。重疊延伸PCR 反應(yīng)條件 72 ℃延伸 1 min 20 s，其余條件與上述PCR 一致，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收擴增產(chǎn)物克隆于pMD19-T (simple)載體中，PCR 和雙酶切篩選出陽性重組質(zhì)粒由新疆昆泰銳生物技術(shù)有限公司測序，將測序正確的重組質(zhì)粒命名為pMD-MeCatL-B。

1.5 原核表達載體pET-MeCatL-B 的構(gòu)建及其誘導(dǎo)表達與鑒定 將 pMD-MeCatL-B 和 pET-32a(+)質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后用T4 DNA Ligase 過夜連接，轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細胞中，挑取單菌落，經(jīng)菌液PCR 和雙酶切篩選出陽性重組質(zhì)粒，測序后將正確的重組質(zhì)粒命名為pET-MeCatL-B。

重組質(zhì)粒 pET-MeCatL-B 轉(zhuǎn)化至 BL21 (DE3)感受態(tài)細胞內(nèi)，挑取單菌落經(jīng)菌液PCR 篩選出陽性菌。將陽性菌培養(yǎng)至 OD600nm值為 0.6～0.8 時，經(jīng)1.0 mmol/L IPTG 誘導(dǎo) 8 h，8 000 r/min 離心 10 min收集菌體，重懸菌體后超聲波破碎，12 000 r/min 離心2 min 收集上清及沉淀，以相同條件下pET-32a(+)空載體誘導(dǎo)6 h 和未誘導(dǎo)的重組菌作為對照，SDS-PAGE 分析重組蛋白 MeCatL-B (rMeCatL-B)的表達。利用Ni2+-NTA 柱純化后的重組蛋白采用不同濃度尿素透析復(fù)性，測定蛋白濃度后經(jīng)蔗糖濃縮至終濃度為 1 mg/mL。以綿羊 Fh 陽性血清(1∶1 000)為一抗，兔抗綿羊 IgG-HRP(1∶3 000)為二抗，western blot 分析rMeCatL-B 的反應(yīng)原性。

1.6 基于Fh rMeCatL-B 間接ELISA 檢測方法的建立 在96 孔板中采用方陣滴定法確定最佳抗原包被濃度(5 μg/mL、7.5 μg/mL、10 μg/mL、12.5 μg/mL和 15 μg/mL)和Fh陰、陽性血清稀釋倍數(shù)(1∶50、1∶100、1∶2 00、1∶4 00)，封閉液(5 %脫脂奶粉、1 %BSA 和 1 %明膠)封閉 1 h，兔抗綿羊 IgG-HRP 稀釋倍數(shù)(1∶1 000 、1 ∶2 500 、1 ∶5 000)，孵育時間(30 min、60 min、90 min)，以TMB顯色劑顯色20 min，測定OD450nm值確定最佳反應(yīng)條件。

采用優(yōu)比后的rMeCatL-B 間接ELISA 方法檢測21份已知的 Fh 陰性血清，每份樣品重復(fù) 3 孔，取其平均值，計算總樣本 OD450nm時的平均值()和標準方差(SD)，根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理，算出臨界值+3SD，當 OD450nm值 ≥+3SD 時，判為陽性；OD450nm值 ＜+3SD 時，判為陰性。

1.7 特異性試驗 利用上述建立的間接ELISA 方法分別對綿羊 Eg、Ct、Tg 陽性血清各 6份進行檢測，同時設(shè)置Fh 陰陽性血清做對照。根據(jù)上述已確定的陰陽性臨界值判定檢測結(jié)果，驗證所建立的間接ELISA 方法的特異性。

1.8 敏感性試驗 將標準的綿羊Fh 陽性血清，按照 1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1 ∶12 800、1 ∶25 600倍比稀釋，利用建立的間接ELISA 法檢測，確定檢測出Fh 陽性血清的最高稀釋度，以確定其敏感性。

1.9 重復(fù)性試驗 取3份已知的Fh 陽性血清和3份陰性血清，每份血清樣品重復(fù)3 孔，采用同一批次包被的酶標板，利用建立的間接ELISA 方法進行批內(nèi)重復(fù)性試驗；采用不同批次包被的酶標板，檢測上述6份血清樣品，每份樣品重復(fù)3 孔，進行批間重復(fù)性試驗，分別計算變異系數(shù)，驗證該方法的重復(fù)性。

1.10 臨床樣品檢測 采用本研究建立的間接ELISA 方法與商品化Fh ELISA 抗體檢測試劑盒對97份綿羊臨床血清樣品進行檢測，分析檢測結(jié)果，計算該方法與商品化Fh ELISA 抗體試劑盒檢測結(jié)果的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 FhMeCatL-B融合基因的擴增與鑒定結(jié)果利用 RT-PCR 法擴增CatL1D和CatB4 基因，結(jié)果顯示，CatL1D和CatB4 基因擴增片段大小分別約為408 bp 和 402 bp，重疊延伸 PCR 擴增產(chǎn)物在 810 bp處有一條清晰的條帶，與預(yù)期目的條帶大小相符，表明正確構(gòu)建了MeCatL-B融合基因。

2.2 重組質(zhì)粒pET-MeCatL-B 的雙酶切鑒定 重組質(zhì)粒 pET-MeCatL-B 經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，得到約5 900 bp 的載體片段和810 bp 的目的片段，與預(yù)期大小一致，表明 MeCatL-B 融合基因已正確克隆于pET-32a(+)載體中。

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達、純化及鑒定 將重組質(zhì)粒 pET-MeCatL-B 轉(zhuǎn)化 BL21 (DE3)進行誘導(dǎo)表達，經(jīng)SDS-PAGE 檢測顯示，誘導(dǎo)后重組菌在 46 ku 處存在與預(yù)期分子質(zhì)量大小相符的蛋白，而未誘導(dǎo)的重組菌和誘導(dǎo)后的上清液中均無該蛋白條帶，表明rMeCatL-B 主要以包涵體的形式表達(圖1A)。經(jīng)Ni2+-NTA 柱純化后，可以檢測到與預(yù)期大小相符的rMeCatL-B 蛋白條帶(圖1A 第 4 泳道)，純化后的重組蛋白純度為92 %，濃度為 2.765 mg/mL。Western blot 結(jié)果顯示，在46 ku 處檢測到目的條帶，而陰性對照無該條帶(圖1B)，表明表達的 rMeCatL-B 能夠與Fh 陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性。

圖1 重組蛋白 MeCatL-B 的 SDS-PAGE 檢測(A)及western blot 鑒定(B)Fig.1 Analysis of the expressed rMeCatL-B by SDS-PAGE (A)and western blot (B)

2.4 間接ELISA 檢測方法的建立 采用方陣滴定法確定 ELISA 最佳反應(yīng)條件，結(jié)果顯示，rMe-CatL-B 抗原最佳包被濃度為 12.5 μg/mL，血清最適稀釋倍數(shù)為 1∶100，此時的 P/N 值最大。封閉條件以含5 %脫脂奶粉的PBST 37 ℃封閉1 h 效果最佳；兔抗綿羊 IgG-HRP 最佳稀釋度為 1∶2 500，最佳反應(yīng)條件為 37 ℃孵育 1 h，TMB 顯色 20 min。

將21份經(jīng)商品化Fh 抗體ELISA 試劑盒檢測為陰性的綿羊血清，利用建立的間接ELISA 法進行檢測。經(jīng)計算陰性血清 OD450nm平均值為 0.179，標準方差 SD 為 0.032，陰陽性臨界值+3SD=0.275。當待測樣品 OD450nm值≥0.275 時，判為陽性；OD450nm值 ＜0.275 時，判為陰性。

2.5 特異性試驗結(jié)果 利用建立的間接ELISA 方法對綿羊 Eg、Ct、Tg、Fh 陽性血清及 Fh 陰性血清進行檢測，結(jié)果顯示僅 Fh 陽性血清為陽性，其余均為陰性(圖2)，表明建立的間接ELISA 法具有良較強的特異性。

2.6 敏感性試驗結(jié)果 將綿羊Fh 標準陽性血清倍比稀釋后，利用建立的間接ELISA 方法進行檢測，結(jié)果顯示，當標準陽性血清稀釋到1∶6 400 時仍為陽性，稀釋到 1∶12 800 后檢測為陰性(圖3)，敏感性為1∶6 400，表明該方法敏感性較好。

2.7 重復(fù)性試驗結(jié)果 選取6份不同血清分別進行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗，結(jié)果顯示，批內(nèi)最大變異系數(shù)為 4.89 %，批間最大變異系數(shù)為 5.17 % (表2)，變異范圍均小于10 %，表明本試驗建立的rMe-CatL-B 間接ELISA 法具有較好的重復(fù)性。

圖2 特異性試驗結(jié)果Fig.2 The specificity test of the indirect ELISA

圖3 敏感性試驗結(jié)果Fig.3 The sensitivity test of the indirect ELISA

表2 間接ELISA 重復(fù)性試驗(n=6)Table 2 Repeatability assay for the indirect ELISA (n=6)

2.8 臨床血清樣品的檢測對比試驗 利用建立的rMeCatL-B 間接 ELISA 法與商品化 Fh ELISA 抗體試劑盒分別對97份綿羊臨床血清樣品進行檢測，結(jié)果顯示，rMeCatL-B 間接ELISA 方法檢測出陽性血清90份，商品化試劑盒檢出陽性血清94份，兩種方法的總符合率為95.88 % (表3)，表明本實驗建立的間接ELISA 與商品化Fh ELISA 抗體試劑盒符合率較高，同時表明本研究建立的 rMeCatL-B 間接ELISA 法可以用于Fh 的臨床監(jiān)測。

表3 rMeCatL-B 間接ELISA 與商品化 Fh 抗體ELISA試劑盒檢測結(jié)果比較Table 3 Comparison of detection results between rMeCatL-B ELISA and commercial Fh antibody ELISA test kit

3 討 論

近年來，隨著Fh 病感染率和發(fā)病率的不斷增高，耐藥性的增強，該病的防控愈發(fā)困難。因此，研發(fā)Fh 病血清學(xué)診斷方法和疫苗具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，CatL、脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)和谷胱甘肽-S- 轉(zhuǎn)移酶(GST)是Fh 重要的免疫原性蛋白[11-13]。Robinson 等對Fh 成蟲、新脫囊幼蟲及未成熟成蟲ESP 中蛋白組分進行分析[9]，結(jié)果顯示，成蟲 ESP中有13 個分泌蛋白屬于CatL；新脫囊幼蟲分泌的蛋白中含 7 個 CatL 和 1 個 CatB；未成熟成蟲 ESP中有 14 個蛋白屬于 CatL，表明 Cat 在 Fh ESP 中分泌量較大，存在于Fh 生長各階段，是 Fh 寄生過程中必不可少的一類蛋白酶，因此Cat 在Fh 血清學(xué)診斷和疫苗的研發(fā)中具有重要的價值[14]。

目前，F(xiàn)h 病的血清學(xué)診斷主要依賴于免疫學(xué)檢測方法，其中ELISA 是最常用的診斷方法。黃維義用不同免疫學(xué)方法檢測Fh 病發(fā)現(xiàn)，免疫擴散法檢出率為70 %，間接血凝試驗檢出率為80 %～90 %，而 ELISA 法的檢出率可達 90 %[15]。Abdolahi Khabisi等以Fh ESP 為抗原利用捕獲ELISA 法檢測感染動物的糞便樣品，敏感性為 90 %[7]。Salimi-Bejestani等以Fh ESP 為抗原建立了間接ELISA 檢測方法，在實驗牛感染后2 周～4 周血清中檢測到Fh 抗體，其敏感性較高，但存在一定的非特異性[16]。目前建立的 ELISA 法所用的包被抗原均為 Fh ESP，由于ESP 抗原為一種混合抗原，成分復(fù)雜，雖然其具有較高的敏感性，但特異性不強；加之ESP 不能大量獲得，并且目前尚沒有標準化的制備及純化工藝，導(dǎo)致不同批次的ELISA 敏感性和特異性存在較大的差異。因此，研發(fā)Fh 高特異性和敏感性的抗原蛋白是提高Fh 間接ELISA 試劑盒特異性和敏感性的關(guān)鍵。目前，國外已有學(xué)者以 CatL1、CatL3、CatL5等為抗原建立了檢測Fh 抗體的ELISA 法，但因試驗中檢測的樣本數(shù)量有限，且蟲體在移行過程中分泌的抗原存在差異[17-18]，導(dǎo)致單一抗原建立的ELISA法診斷效率較低。因此，本研究將 Fh 成蟲期分泌表達的兩個(CatL、CatB)基因融合表達后建立間接ELISA 法，評估了該融合抗原蛋白的特異性和敏感性。

本實驗擴增了FhCatL1D和CatB4 基因優(yōu)勢抗原表位集中區(qū)段，采用重疊延伸PCR 法將CatL1D和CatB4 兩個基因進行融合，構(gòu)建了MeCatL-B融合基因，在原核表達載體高效表達后純化目的蛋白rMeCatL-B，western blot 分析證實 rMeCatL-B 可以被Fh 陽性血清特異性識別，具有較強的反應(yīng)原性。本實驗以rMeCatL-B 為抗原建立的間接ELISA 法特異性強、敏感性高，重復(fù)性好，其與商品化 Fh 抗體ELISA 試劑盒對綿羊臨床血清樣品同時進行檢測，兩種方法的符合率為95.88 %。本研究為進一步研發(fā)Fh 病ELISA 診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)。