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    NtCycB2基因表達對煙草腺毛發(fā)生的影響

    2019-05-20 03:13:38孟盈閆筱筱王召軍張洪映楊欣玲楊永鋒崔紅
    中國煙草學(xué)報 2019年2期
    關(guān)鍵詞:腺毛株系葉面

    孟盈,閆筱筱,王召軍,張洪映,楊欣玲,楊永鋒,崔紅*

    1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué),煙草學(xué)院,鄭州市文化路95號 450002;

    2 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司,鄭州市隴海東路72號 450000

    煙草植株的氣生部分密被腺毛,對植株抗性和煙葉質(zhì)量具有重要影響[1]。栽培煙草的腺毛主要由三種類型混合組成。其中,長柄分泌型腺毛為主要類型,是二萜和糖脂合成的重要場所,二者不僅是重要香氣前體物質(zhì)[2],對蚜蟲抗性也有較大影響[3]。短柄分泌型腺毛是葉面抗性蛋白的合成場所,在抑制孢子萌發(fā)和抵抗真菌侵染中起重要作用[4]。構(gòu)成了煙株與環(huán)境間的物理屏障,可以有效地防御各種非生物脅迫及生物脅迫[5]。因此,提高腺毛密度是煙草品質(zhì)和抗性改良的重要途徑之一,而這依賴于對煙草腺毛形態(tài)發(fā)生分子機制的全面解析。

    雖然,擬南芥單細(xì)胞腺毛發(fā)生分子機制研究已取得了突破性進展,但多細(xì)胞腺毛與單細(xì)胞腺毛在發(fā)生調(diào)控機制上有并不相同[6-8]。細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)在真核細(xì)胞分裂過程中起調(diào)控作用,對細(xì)胞增殖及植物發(fā)育有重要意義[9]。Cyclins共有A、B、C、D、H、L、T、U、SDS和J18-type 10個家族,功能各不相同[10]。其中,B-型細(xì)胞周期蛋白(B-type cyclins)控制核內(nèi)復(fù)制(G2)期轉(zhuǎn)向分裂(M)期的轉(zhuǎn)換[11],過量表達CycB2的水稻能促進細(xì)胞分裂,加快水稻根系的生長,與CDKB2相互作用后調(diào)節(jié)水稻根系的生長發(fā)育[12];在種子發(fā)育過程中也可以發(fā)揮作用,玉米CycB2與CDKA相互作用后,共同參與調(diào)控胚乳發(fā)育過程中的細(xì)胞周期[13];對腺毛發(fā)生也有影響,CycB1;2在GL2啟動子控制下在擬南芥腺毛中表達,可使單細(xì)胞腺毛轉(zhuǎn)變?yōu)閰采亩嗉?xì)胞型腺毛[14]。SlCycB2是從番茄wooly突變體中發(fā)現(xiàn)的B型細(xì)胞周期蛋白基因,當(dāng)SlCycB2的表達受到抑制時,非分泌型腺毛(III和V型)明顯增多,分泌型腺毛(I和IV型)消失;當(dāng)SlCycB2過表達時,非分泌型腺毛及分泌型腺毛都明顯減少[15-16]。這反映出多細(xì)胞腺毛發(fā)生調(diào)控機制的精細(xì)和復(fù)雜性,也說明B型細(xì)胞周期蛋白在多細(xì)胞腺毛發(fā)生調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有舉足輕重的地位。

    煙草腺毛密度受到多種栽培因素[17-23]與環(huán)境因子[24-27]的影響,但其遺傳調(diào)控機制還不清晰。雖然有研究表明NtCycB2在煙草中的過表達及在番茄中異源表達都出現(xiàn)抑制腺毛發(fā)生的現(xiàn)象[16],但該基因在煙草中的表達模式及對不同類型腺毛發(fā)生的調(diào)控模式并未報道。為此,本研究采用RT-PCR技術(shù),進行煙草K326 NtCycB2克隆和生物信息學(xué)分析,分別構(gòu)建過表達載體和基因編輯載體進行遺傳轉(zhuǎn)化分析,通過腺毛形態(tài)的比較研究解析了,深入解析NtCycB2表達對煙草腺毛形態(tài)發(fā)生的調(diào)控作用,旨在為煙草葉面化學(xué)分子定向改良奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    供試材料煙草K326無菌苗培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱,培養(yǎng)溫度為25℃、濕度為60%,光照條件為16 h光/8 h暗。

    1.2 基因克隆和序列分析

    利用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計NtCycB2克隆引 物(F1:ATGAGCCGAAGAAATGGAAAT,R1:CTAACTGATATTCCTCCTAGTAG)和高保真Pfu酶進行PCR擴增,PCR反應(yīng)條件為94°C 10min;94°C 30s,58°C 30s,72°C 30s,35次 循 環(huán);72°C 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,使用天根公司DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段,回收產(chǎn)物連接到pMD19-T載體,轉(zhuǎn)化Escherichia coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽性克隆,酶切鑒定后送深圳華大公司進行測序驗證。

    根據(jù)茄科基因組網(wǎng)站(https://solgenomics.net/)、中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫(V3.0)和擬南芥TAIR網(wǎng)站(https://www.arabidopsis.org)獲取相關(guān)CycB2基因的序列。利用Prosite數(shù)據(jù)庫(https://www.expasy.org/tools/)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì),使用ProtParam程序(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測氨基酸分子量。利用Clustal Omega program(https://www.ebi.ac.uk/ Tools/msa/clustalo/)和MEGA5.0軟件進行進化和多序列比對分析。利用NCBI Conserved Domain Database(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)分析CycB2基因的保守結(jié)構(gòu)域。

    1.3 基因表達模式分析

    選擇五葉期生長一致的幼苗進行非生物脅迫處理:100μmol·L-1MeJA溶液進行外源激素處理,150mmol·L-1NaCl溶液進行高鹽脅迫,20% PEG6000溶液進行滲透脅迫,4℃進行低溫脅迫和42℃進行高溫脅迫。分別在脅迫處理0、1、6、12和24h進行樣品收集,經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃。Trozol法提取RNA。反轉(zhuǎn)錄程序參照Invitrogen公司的M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒說明書進行。

    以煙草L25核糖體蛋白(L18908)(F2:GCTTTCTT CGTCCCATCA,R2:CCCCAAGTACCCTCG TAT)為內(nèi)參[28],按照Invitrogen公司的2×RealStar Green Fast Mixture(SYBR Green)試劑盒說明書,利用F1/R1引物進行實時定量RT-PCR。20 μL反應(yīng)體系:SYBR Green Mix 10.0 μL,上、下游引物(10.0 μmol L-1)各0.5 μL,cDNA 1.0 μL,RNasefree H2O 8.0 μL。反應(yīng)條件為95°C 10 min;95°C 10s,60°C 30s,72°C 30s,40次 循 環(huán);在72°C延伸步驟收集熒光信號,溶解曲線為:95°C,15s。采用2-△△Ct法[29]進行誤差分析。

    1.4 載體構(gòu)建

    利用NtCycB2克隆引物(F3:CGGGATCCATG AGCCGAAGAAATGGAAAT,R3:CGGAATTCC TAACTGATATTCCTCCTAGTAG,下劃線標(biāo)注的酶切位點分別是BamHI和EcoRI)進行PCR擴增。將測序正確的目的基因連接到過表達載體構(gòu)成pCXSNFLAG-NtCycB2。

    根據(jù)測序得到的NtCycB2的CDS序列,首先設(shè)計并合成gRNA靶位點序列(Targeting Sequence:GATCAACCACCCACAAGTGG,下劃線標(biāo)注的是Protospacer Adjacent Motifs,即PAM區(qū)),并添加BsaI酶切位點。Oligo二聚體與CRISPR/Cas9載體進行連接:CRISPR/Cas9載體2.0μL,Oligo二聚體1.0 μL,Enzyme Mix 1.0 μL,無菌水H2O補充至10.0 μL。最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中構(gòu)成NtCycB2-knock out基因編輯載體(圖1)。

    圖1 NtCycB2基因敲除載體結(jié)構(gòu)Fig.1 Vector structure of NtCycB2-knock out

    1.5 煙草遺傳轉(zhuǎn)化與鑒定

    煙草轉(zhuǎn)基因采用葉盤轉(zhuǎn)化法[30]。NtCycB2過表達載體和基因敲除載體轉(zhuǎn)化后將葉片組織轉(zhuǎn)移到含有潮霉素(60.0 mg·L-1)的分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)和抗性篩選。獲得的敲除表達抗性株系進行靶位點附近序列的測序分析,通過檢測靶位點堿基突變情況確定敲除株系。

    利用F1/R1引物對過表達抗性株系進行RT-PCR檢測分析,方法同1.3。

    1.6 腺毛形態(tài)觀察

    葉片腺毛組織化學(xué)染色法參考Lin和Wagner的方法[31]。將葉片在0.2%(w/v)羅丹明B水溶液中浸染30min,用蒸餾水漂洗三次,使用無菌濾紙吸干表面水分后,利用超景深顯微鏡(基恩士VHR-5000,日本)對葉片表面進行觀察,并在上表皮中部隨機選擇3個視野進行腺毛密度統(tǒng)計分析。

    1.7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計方法

    所有數(shù)據(jù)使用EXCEL進行整理,應(yīng)用SPSS17.0軟件(IBM,美國)進行顯著性分析,數(shù)據(jù)處理采用單因子方差(One-way ANOVA)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 NtCycB2基因克隆及生物信息學(xué)分析

    以K326的DNA為模板,利用NtCycB2克隆引物進行PCR擴增后,結(jié)果如圖2所示。經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)該基因編碼區(qū)長333bp,共兩個拷貝,NtCycB2-1、NtCycB2-2核苷酸同源性達94%,氨基酸相似性100%。編碼110個氨基酸,分子量為12.2kD,理論等電點為8.60,酸性氨基酸殘基(Asp+Glu)總數(shù)為11,堿性氨基酸殘基(Arg+Lys)總數(shù)為14,其分子式為C509H847N153O169S11。

    圖2 煙草NtCycB2基因克隆Fig.2 PCR amplification of NtCycB2

    圖3 NtCycB2蛋白與近源物種同源蛋白的多序列比對Fig.3 Multiple sequence alignment of NtCycB2 protein and relative species homolog protein

    NCBI網(wǎng)站在線分析CycB2基因具有三個典型的Motifs:I、II和III(圖3),其中,Motifi和II構(gòu)成WD40結(jié)構(gòu)域,MotifiII構(gòu)成RING-Like結(jié)構(gòu)域。蛋白序列比對分析結(jié)果表明K326 NtCycB2蛋白序列與其親本絨毛煙草(NtomCycB2:Ntom_KB972106.1)和林煙草(NsylCycB2:Nsyl_KD960057.1)的蛋白序列相同,與香料煙巴斯瑪(BXCycB2:Ntab-BX_AWOK-SS231466)、白 肋 煙TN90(TN90CycB2:Ntab-TN90_AYMY-SS4464)和紅花大金元(HDCycB2:Ntab0642370.1)的蛋白序列也相同;而與本氏煙(NbCycB2-1:Niben101Scf10299g00003.1和NbCycB2-2:Niben101Scf10396g00002.1)蛋 白序列的同源性均為96.36%,與番茄(SlCycB2:Solyc10g083140)、擬南芥(AtCycB2:AT5G06270和AtCycB3:AT3G11600)蛋白序列的同源性分別為71.05%、52.38%、和51.20%。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果也表明,CycB2在栽培煙草不同類型、不同品種及其親本之間高度保守,但與本氏煙NbCycB2存在較大差異,與番茄SlCycB2及擬南芥AtCycB2的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4)。

    圖4 CycB2蛋白的系統(tǒng)進化樹分析Fig.4 Phylogenetic analysis of CycB2 protein

    2.2 NtCycB2基因表達模式分析

    為研究NtCycB2的組織表達特性,分別對煙草根、莖、葉、去腺毛葉、花和腺毛中NtCycB2表達水平進行RT-PCR檢測分析,結(jié)果如圖5A所示。腺毛和花中NtCycB2的表達水平最高,分別是根的7.6倍和5.2倍。NtCycB2表達水平在根和莖中較低,在葉片中相對較高,但在去腺毛葉片中明顯降低。由此推測,NtCycB2主要在煙草腺毛中富集表達,這與SlCycB2在番茄腺毛中特異表達相一致。

    圖5 NtCycB2基因表達模式分析Fig.5 Response of NtCycB2 to different stress treatments

    為研究NtCycB2對逆境的應(yīng)答模式,采用RTPCR技術(shù),分析了水分、鹽、溫度、MeJA等脅迫條件下葉片NtCycB2表達水平的變化規(guī)律。在PEG和NaCl處理下,NtCycB2表達水平隨處理時間延長而逐漸降低(圖5-B,C),表明干旱和鹽脅迫對NtCycB2表達具有一定的抑制作用。在高溫處理下,NtCycB2表達水平隨處理時間延長而逐漸升高,而在低溫處理下顯示出明顯降低的趨勢,說明溫度對NtCycB2表達具有一定的誘導(dǎo)作用。在MeJA處理12h時NtCycB2表達量陡升,在24h時又明顯降低,表明了MeJA對NtCycB2表達的調(diào)控具有一定的時間效應(yīng)。

    2.3 遺傳轉(zhuǎn)化與篩選鑒定

    2.3.1 NtCycB2基因敲除

    采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將NtCycB2-knockout表達載體轉(zhuǎn)化K326,對獲得的潮霉素抗性苗進行PCR擴增和測序,在所檢測的40株抗性苗中,有19株在靶位點序列檢測到了雙峰現(xiàn)象,編輯效率接近50%。在T1代中篩選中,獲得了4個在靶位點序列發(fā)生了插入或缺失突變的純合突變體。如圖6顯示,NtCycB2-ko-2的序列中第76堿基位置后出現(xiàn)C插入;NtCycB2-ko-3的序列中第73堿基位置的CCA缺失,第76堿基位置后出現(xiàn)C插入;NtCycB2-ko-15的序列中第73堿基位置的CCAC缺失;NtCycB2-ko-16第76堿基位置后出T插入。這些插入和缺失最終都導(dǎo)致了NtCycB2翻譯的終止。

    圖6 NtCycB2基因敲除株系中NtCycB2序列分析Fig.6 Sequence analysis of NtCycB2 among different NtCycB2-knockout lines

    2.3.2 NtCycB2基因過表達

    采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pCXSN-FLAG-NtCycB2表達載體轉(zhuǎn)化K326,并對抗性芽/幼苗進行潮霉素抗性篩選。采用RT-PCR技術(shù)對該植株(NtCycB2-OE-1)和4個基因敲除株系(NtCycB2-ko-2、NtCycB2-ko-3、NtCycB2-ko-15和NtCycB2-ko-16)的純合突變體進行NtCycB2表達水平分析,結(jié)果如圖7所示。NtCycB2-OE-1植株中NtCycB2的表達量明顯較高,是對照K326的3.1倍。而四個敲除株系中NtCycB2表達量與對照相近,表明其在轉(zhuǎn)錄水平并無明顯變化。

    2.4 NtCycB2轉(zhuǎn)基因植株腺毛形態(tài)觀察和腺毛密度分析

    對NtCycB2敲除和過表達株系幼苗進行了形態(tài)學(xué)觀察,結(jié)果如圖8所示,NtCycB2-ko-2植株形態(tài)與對照相似,但莖和葉上的腺毛更為濃密,整個植株呈現(xiàn)多毛狀態(tài)(圖8B)。NtCycB2-OE-1植株與對照形態(tài)有所不同,不僅葉片和莖表面光滑少毛,而且葉面光亮、葉片卷曲,形狀不規(guī)則(圖8C)。

    經(jīng)羅丹明染色后對不同株系的腺毛進行觀察,圖8-D、E和F顯示了NtCycB2表達對莖部腺毛發(fā)生的影響。與對照相比,NtCycB2-ko-2莖上腺毛濃密,腺柄較長,腺頭較為飽滿;而NtCycB2-OE-1莖表十分光滑,長柄腺毛幾乎消失,僅觀察到少量的短柄分泌型腺毛。圖8-G、H和I顯示了NtCycB2表達對葉面腺毛發(fā)生的影響。與對照相比,NtCycB2-ko植株葉面的腺毛數(shù)量顯著增加,大部分為長柄分泌型腺毛,腺頭著色較深,表明其物質(zhì)代謝和分泌功能旺盛;而NtCycB2-OE-1葉面分泌型腺毛和非分泌型腺毛數(shù)量明顯減少,僅有少量的短柄分泌型腺毛存留。

    圖8 NtCycB2基因敲除和過表達株系的腺毛分析(150×)Fig.8 Trichome analysis of NtCycB2 knock-out lines and overexpression line(150×)

    分別取NtCycB2敲除株系和過表達株系的幼葉進行上表皮腺毛密度統(tǒng)計分析,結(jié)果如圖9所示。4個NtCycB2敲 除 株 系NtCycB2-ko-2、NtCycB2-ko-3、NtCycB2-ko-15和NtCycB2-ko-16植株的葉面腺毛總數(shù)顯著高于對照。其中,長柄型或短柄型的分泌型腺毛的密度都顯著增加,而非分泌型腺毛的密度則沒有明顯改變。NtCycB2-OE-1株系中分泌型腺毛和非分泌型腺毛數(shù)量均顯著減少,且均呈現(xiàn)顯著性差異。該結(jié)果表明,NtCycB2對煙草腺毛發(fā)生尤其是分泌型腺毛的發(fā)生,具有明顯的負(fù)向調(diào)控作用。

    圖9 NtCycB2敲除和過表達株系的葉面腺毛密度統(tǒng)計Fig.9 Statistics of trichome density of leaf surface of NtCycB2 knock-out line and over-expression line

    3 討論和結(jié)論

    植物腺毛作為表皮細(xì)胞的特化結(jié)構(gòu),在植物抵御環(huán)境脅迫[32]和次生代謝產(chǎn)物積累[33]等方面發(fā)揮重要作用。煙草腺毛由多種分泌型和非分泌型腺毛混合組成,既形成了煙株與外界的物理屏障和化學(xué)屏障,同時又是重要的香氣前體物質(zhì)合成場所。因此,提高煙草腺毛密度是煙草的重要目標(biāo)。但栽培煙草遺傳背景狹窄、腺毛密度變異較小[34],常規(guī)的雜交育種難以有所突破。而利用關(guān)鍵基因的表達調(diào)控進行分子改良,是煙草腺毛密度改良的主要途徑。

    模式植物擬南芥為代表的單細(xì)胞腺毛發(fā)生已被逐步解析[35],但多細(xì)胞腺毛發(fā)生的分子機制還不清楚。最近研究發(fā)現(xiàn)番茄多細(xì)胞腺毛發(fā)生受到B型周期蛋白的調(diào)控,為煙草腺毛分子改良提供了理想的靶點。因此,本文克隆并分析了K326的B型周期蛋白NtCycB2。雖然NtCycB2氨基酸序列在栽培煙草不同類型和不同品種中高度保守,但與番茄SlCycB2相似性僅71.05%,預(yù)示二者之間的功能同中存異。為闡明NtCycB2在煙草腺毛發(fā)生中的調(diào)控作用,分別對該基因進行了過表達和敲除表達研究。形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),NtCycB2過表達植株莖和葉光滑少毛,葉片上除了少量短柄分泌型腺毛外,長柄分泌型和非分泌型腺毛基本消失;而NtCycB2敲除植株中莖葉呈現(xiàn)多毛現(xiàn)象,分泌型腺毛密度顯著增加,而非分泌型腺毛無明顯變化。該結(jié)果證明,NtCycB2對煙草分泌型腺毛具有顯著的負(fù)調(diào)控作用,這與番茄的研究結(jié)果有所不同。番茄共有7種類型的腺毛,包括4種分泌型(I、IV、VI與VII)和3種非分泌型(II、III和V)[36]。SlCycB2對III和V型非分泌型腺毛具有明顯的負(fù)調(diào)控作用,SlCycB2過表達和抑制都會導(dǎo)致I型腺毛的完全消失,對于其它類型腺毛發(fā)生無明顯影響[16]。B型細(xì)胞周期蛋白在煙草和番茄中都具有調(diào)控腺毛發(fā)生的功能,但調(diào)控模式存在明顯差異,其中原因并不清楚。這充分說明了多細(xì)胞腺毛發(fā)生調(diào)控機制的復(fù)雜性,其不僅具有物種特異性,也具有腺毛類型的特異性。而NtCycB2對煙草分泌型腺毛顯著的負(fù)調(diào)控作用,預(yù)示其在煙草葉面化學(xué)定向改良中具有較大的應(yīng)用潛力。其一,該基因的靶標(biāo)-長柄分泌型腺毛是葉面化學(xué)物質(zhì)合成的重要場所;其二,該基因的負(fù)向調(diào)控模式有利于基因編輯技術(shù)的應(yīng)用,而基因編輯技術(shù)改良品種無疑具有較大的公眾接受性和應(yīng)用空間。

    當(dāng)然,在此之前還應(yīng)充分評估NtCycB2表達對煙草生長發(fā)育的影響。NtCycB2表達模式分析發(fā)現(xiàn),該基因主要在腺毛和花中高表達,這與SlCycB2相一致,預(yù)示其主要影響植物的腺毛和花器的發(fā)育過程。SlCycB2過表達導(dǎo)致了胚胎發(fā)育受阻和不育[37],NtCycB2過表達使煙苗形態(tài)出現(xiàn)了異常,說明其過表達對植物生長發(fā)育和生殖有一定負(fù)作用。但到目前為止,還沒有關(guān)于CycB2敲除影響植株生長發(fā)育的報道。在本研究中,NtCycB2敲除后,煙苗腺毛濃密,發(fā)育正常,生長旺盛,預(yù)示其在生產(chǎn)中具有較好的應(yīng)用潛力。當(dāng)然,下一步但還需要進行田間比較試驗,以闡明NtCycB2敲除對煙株農(nóng)藝性狀、葉面化學(xué)、煙葉質(zhì)量及其可用性的重要影響,為煙草葉面化學(xué)的定向改良奠定基礎(chǔ)。

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