綜合評分法優(yōu)選黃芪中6種皂苷類成分的提取工藝

王亞麗，田 曼，李 江，王昌利，葛人杰，李 歡，王 媚，顏永剛，張 崗

(陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，陜西 西安 712046)

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) B-ge. var. mongholicus ( Bge.) Hsiao 或莢膜黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) B-ge 的干燥根[1]。中藥黃芪是我國最常用的大宗中藥材之一，具有補(bǔ)氣健脾、升陽舉陷、益衛(wèi)固表、利尿消腫、托毒生肌的功效，是補(bǔ)氣要藥，在中藥中被譽(yù)為“補(bǔ)氣圣藥”?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪中主要含有皂苷類、黃酮類、黃芪多糖、氨基酸、生物堿及微量元素等多種有效成分，具有增強(qiáng)免疫系統(tǒng)、抗氧化、延緩衰老、抗病毒等作用[2]。其中黃芪總皂苷是黃芪中主要的一類活性物質(zhì)，具有降血壓、降血糖、改善胰島素抵抗活性、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗血栓、抗風(fēng)濕、抗腫瘤、保護(hù)心臟等生物活性[3-8]。本實驗在對黃芪中6種皂苷成分提取方法、提取溶劑進(jìn)行初篩的基礎(chǔ)上，以黃芪甲苷，黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，異黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ的含量為評定指標(biāo)，采用綜合評分與正交實驗設(shè)計相結(jié)合優(yōu)選黃芪皂苷最佳提取工藝條件，為黃芪皂苷成分的客觀評價提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀系列：Empower pro色譜工作站，在線脫氣機(jī)，四元高壓梯度泵，自動進(jìn)樣器，柱溫箱，Waters 2420 ELSD Detector檢測器；KQ-2500E數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DK-98-II電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；GZX-9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；FW177中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩(45目，孔徑0.40mm)，浙江恒幸儀器設(shè)備制造有限公司。

1.2 試藥

對照品黃芪甲苷(批號10212-201603)、黃芪皂苷Ⅲ(批號10215-201611)、黃芪皂苷Ⅱ(批號10214-201701)、異黃芪皂苷Ⅱ(批號20417-201701)、黃芪皂苷Ⅰ(批號10213-201610)、異黃芪皂苷Ⅰ(批號20416-201605)均購自南昌貝塔生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。黃芪Astragali Radix藥材采自步長集團(tuán)宕昌縣黃芪種植基地，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤高級實驗師鑒定為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranace-us(Fisch.)Bge. var. mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。實驗用水為娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司生產(chǎn)；乙腈和甲醇均為色譜純，購自美國賽默飛世爾科技有限公司；冰醋酸(色譜純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法

建立同時測定黃芪中6種皂苷成分含量的HPLC方法。

2.1.1色譜條件 色譜柱為Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫 25 ℃；流動相為 0.3% 冰醋酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，0～12 min，18% B；12～35 min，18% B→30% B；35～43 min，30% B；43～60 min，30% B→55% B；60～70 min，55% B→70% B；70～80 min，70% B→100%B；系統(tǒng)平衡時間 20 min；流速 1.0 mL/min；進(jìn)樣量 10 μL；蒸發(fā)光散射檢測器條件：漂移管溫度 60 ℃，噴霧器溫度 36 ℃，增益值 130，供氣壓力 80 psi。對照品及樣品的液相色譜見圖1。

t/min

注：1.黃芪甲苷;2.黃芪皂苷Ⅲ; 3.黃芪皂苷Ⅱ;4.異黃芪皂苷Ⅱ; 5.黃芪皂苷Ⅰ; 6.異黃芪皂苷Ⅰ

圖1 混合對照品溶液D(A)及樣品(B)的HPLC-ELSD色譜

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱定對照品黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ適量，用甲醇超聲溶解制成含有100 μg/mL黃芪甲苷、500 μg/mL黃芪皂苷Ⅲ、200 μg/mL黃芪苷Ⅱ、80 μg/mL異黃芪皂苷Ⅱ，1 300 μg/mL黃芪皂苷Ⅰ、520 μg/mL異黃芪皂苷Ⅰ的混合對照品溶液C；精密稱定對照品黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ適量，用甲醇超聲溶解制成含有60μg/mL黃芪甲苷、270μg/mL黃芪皂苷Ⅲ、100 μg/mL黃芪皂苷Ⅱ、50 μg/mL異黃芪皂苷Ⅱ、650 μg/mL黃芪皂苷Ⅰ、250 μg/mL異黃芪皂苷Ⅰ的混合對照品溶液D。分別將混合對照品溶液C、D放于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.1.3 供試品溶液制備 將黃芪藥材于50 ℃干燥24 h，打粉，過45目篩，精密稱量粉末5.0 g，置500 mL圓底燒瓶中，精密加入80%甲醇200 mL，浸泡12h后，加熱回流提取3次，每次1 h，過濾，濾液蒸干，加入100 mL水溶解殘渣，將溶液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，石油醚萃取3次，每次200 mL，棄去石油醚層，將非石油醚層轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)皿中，濃縮干燥，加甲醇定容到10 mL容量瓶中，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)慮液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 將“2.1.2”項下混合對照品溶液D按“2.1.1”色譜條件依次進(jìn)樣2 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、16 μL，重復(fù)測定3次，以進(jìn)樣量的對數(shù)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積的對數(shù)(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程及線性范圍見表1。

表1 6種皂苷類成分的線性關(guān)系與線性范圍

2.1.5 精密度試驗 取混合對照品溶液D，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣量10 μL，計算黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ的峰面積RSD分別為1.62%、2.01%、1.59%、1.98%、2.29%、2.36%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性考察 依據(jù)最優(yōu)提取工藝，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ的峰面積RSD分別為2.25%、2.21%、1.72%、2.10%、2.83%、2.41%，結(jié)果表明本實驗的重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性考察 取最優(yōu)提取工藝所得供試品溶液，分別在制備后的0、4、8、12、16、24 h各進(jìn)樣1次，每次進(jìn)樣量10 μL，測定黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ的峰面積RSD分別為2.09%、2.15%、2.77%、2.26%、2.53%、2.64%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率 精密稱定同一批已知含量的黃芪粉末1.0 g，共6份，分別精密加入混合對照品溶液C1.0 mL。按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，進(jìn)樣量15 μL。結(jié)果黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ的平均回收率依次為102.75%、98.89%、96.91%、100.06%、99.34%、96.68%，RSD依次為2.48%、1.75%、2.16%、2.68%、2.76%、2.59%。

2.2 黃芪中6種皂苷成分提取工藝研究

2.2.1 提取方法考察 (1)超聲提取法：精密稱取黃芪粉末:5.0g，置500mL的錐形瓶中，精密加入甲醇200mL，浸泡12h后，超聲提取1次，提取1h，即得超聲提取液。

(2)回流提取法：精密稱取黃芪粉末5.0 g，置500 mL的圓底燒瓶中，精密加入甲醇200 mL，浸泡12 h后，加熱回流提取1次，提取1 h，即得回流提取液。

將上述兩種提取方法所得提取液按照“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，從6種皂苷類成分的總提取量來看，甲醇回流法提取量較高。結(jié)果見表2。

表2 不同提取方法對6種皂苷類成分總提取量的影響 (mg·g-1)

2.2.2 提取溶劑考察 精密稱取黃芪粉末5.0 g，置500 mL的圓底燒瓶中，精密加入提取溶劑200 mL，浸泡12 h后，加熱回流提取時間1 h，提取1次，考察80%甲醇與不同體積分?jǐn)?shù)乙醇(80%、90%、95%)提取對黃芪中6種皂苷類成分含量的影響。結(jié)果表明甲醇比乙醇更適合用來提取黃芪中這6種皂苷類成分。結(jié)果見表3。

表3 不同提取溶劑對6種皂苷類成分總提取量的影響 (mg·g-1)

2.2.3 醇提工藝的因素和水平優(yōu)化 以上試驗表明選用80%甲醇加熱回流提取黃芪中6種皂苷類成分較合適，為優(yōu)化甲醇回流提取工藝，對甲醇體積分?jǐn)?shù)(因素A)、提取時間(因素B)及提取次數(shù)(因素C)進(jìn)行了3因素3水平的正交試驗。因素水平見表4。

表4 正交試驗因素水平

精密稱取黃芪粉末各5.0 g，按照L9(34)正交試驗設(shè)計表中確定的條件進(jìn)行實驗，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，分別計算這6種皂苷類成分的含量，并進(jìn)行多指標(biāo)綜合評分。評分時以各指標(biāo)的最大值為參照對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，再給出各指標(biāo)的權(quán)重。賦予指標(biāo)權(quán)重采用專家評分法，即同行專家依據(jù)黃芪中這6種皂苷類成分在黃芪總皂苷提取工藝整體評價中的相對重要程度，獨立給出各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)；查閱近10年來黃芪藥材中黃芪皂苷類成分提取工藝以及含量測定相關(guān)文獻(xiàn)107篇，其中83篇檢測了黃芪甲苷，18篇檢測了黃芪皂苷Ⅲ，22篇檢測了黃芪皂苷Ⅱ，20篇檢測了黃芪皂苷Ⅰ，4篇檢測了異黃芪皂苷Ⅱ，2篇檢測了異黃芪皂苷Ⅰ。將專家評分法與各指標(biāo)在近10年來黃芪皂苷類成分提取工藝以及含量測定相關(guān)文獻(xiàn)中被檢測的頻率統(tǒng)計相結(jié)合對各指標(biāo)設(shè)定權(quán)重，同時，鑒于黃芪甲苷是黃芪中增強(qiáng)機(jī)體免疫的主要有效成分之一[9]，并通常作為評價黃芪藥材及制劑質(zhì)量的常用指標(biāo)性成分，故本實驗取權(quán)重系數(shù)分別為：黃芪甲苷權(quán)重為0.6，黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ權(quán)重均為0.1，異黃芪皂苷Ⅰ權(quán)重為0.04、異黃芪皂苷Ⅱ權(quán)重為0.06。按照下列公式求出綜合評分值(Y)，以綜合評分值進(jìn)行統(tǒng)計分析。正交試驗安排及結(jié)果見表5，方差分析見表6。

Yi=0.6X/0.1212+0.1×(Z/0.6447+M/0.2751+N/1.6691)+0.06P/0.1134+0.04Q/0.6020，(X為黃芪甲苷含量、Z為黃芪皂苷Ⅲ含量、M為黃芪皂苷Ⅱ含量、N為黃芪皂苷Ⅰ含量、P為異黃芪皂苷Ⅱ含量、Q為異黃芪皂苷Ⅰ含量)，i=1,2,3,.....9。

表5 正交試驗結(jié)果 (mg·g-1)

表6 正交試驗方差分析

注：F0.05(2,2)=19.00。

2.2.4 正交試驗結(jié)果分析 以綜合評分值為標(biāo)準(zhǔn)，由表5直觀分析可知，在所選因素水平范圍內(nèi)，各因素的作用主次順序為A(提取溶劑體積分?jǐn)?shù))>C(提取次數(shù))>B(提取時間)，理論上以A1B2C3為最優(yōu)組合，即80%甲醇回流提取3次，每次提取2 h。由表6方差分析結(jié)果表明，因素A(甲醇體積分?jǐn)?shù))和因素C(提取次數(shù))均為主要影響因素，對各指標(biāo)成分的提取有顯著性影響(P<0.05)，因素B(提取時間)對提取結(jié)果不具有顯著性影響(P>0.05)，由于提取時間對試驗結(jié)果的影響經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗不具有顯著性，為了降低成本、節(jié)約時間、提高效率，故最終確定最優(yōu)組合為A1B1C3，即80%甲醇回流提取3次，每次提取1 h。

2.2.5 正交驗證試驗 為進(jìn)一步考察優(yōu)選工藝的可靠性及穩(wěn)定性，取3份藥材按篩選得到的最佳提取工藝A1B1C3進(jìn)行正交驗證試驗，結(jié)果黃芪甲苷，黃芪皂苷Ⅲ、Ⅱ，異黃芪皂苷Ⅱ，黃芪皂苷Ⅰ，異黃芪皂苷Ⅰ的平均提取量分別為0.1098、0.4783、0.2694、0.1256、1.4356、0.5496mg·g-1，RSD值均小于2.74%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

3.1 流動相的選擇

在實驗前，通過查閱大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，HPLC-ELSD法測定黃芪皂苷類成分含量時選用的流動相主要有乙腈-酸水溶液[10-12]和乙腈-水[13-17]洗脫系統(tǒng)，經(jīng)實驗考察，乙腈-0.3%冰醋酸作為流動相時，基線噪音小，色譜峰的分離度、峰形均優(yōu)于乙腈-0.3%甲酸溶液和乙腈-水，由于考慮到酸性洗脫系統(tǒng)對色譜柱的損害，為保護(hù)色譜柱，所以適當(dāng)降低冰醋酸濃度，但隨著冰醋酸濃度的降低，色譜峰靈敏度亦隨著變低，故本實驗最終采用乙腈-0.3%冰醋酸溶液作為流動相。

3.2 評價指標(biāo)的選擇

通過查閱文獻(xiàn)，黃芪中黃芪甲苷，黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，異黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ等皂苷類成分具有抗腫瘤、抗肝纖維化、抗衰老、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用。采用單一指標(biāo)成分進(jìn)行工藝優(yōu)選與中藥多組分、多靶點的作用特點有一定偏離，考慮到單一成分作為中藥提取工藝評價指標(biāo)的局限性，故本實驗以黃芪中6種皂苷類成分的含量作為研究指標(biāo)。

3.3 數(shù)據(jù)處理分析

據(jù)文獻(xiàn)報道，黃芪皂苷提取主要以總皂苷或黃芪甲苷工藝篩選為主，涉及的成分過于籠統(tǒng)或單一，考慮其藥理作用較少。故本實驗采用多指標(biāo)綜合評分法結(jié)合正交試驗設(shè)計來篩選黃芪中6種皂苷類成分最佳提取工藝。不僅利用正交試驗方法進(jìn)行相關(guān)因素和水平的考察，同時也考慮到了黃芪甲苷和其他5種具體的皂苷成分的含量和藥理作用。采用多指標(biāo)的正交試驗設(shè)計進(jìn)行工藝優(yōu)選時，首先需要針對指標(biāo)間的重要性差異給各指標(biāo)設(shè)定權(quán)重系數(shù)，進(jìn)行綜合評分后再做統(tǒng)計分析。本實驗從專家評分和近10年來相關(guān)文獻(xiàn)統(tǒng)計情況兩方面考慮，最后給出各指標(biāo)權(quán)重，這樣進(jìn)行統(tǒng)計分析優(yōu)選出的工藝更具有科學(xué)性和合理性，為后期黃芪的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了實驗參考。