超聲制備中長鏈結(jié)構(gòu)酯納米乳液及其體外消化的研究

胡蔣寧 熊超越 李 想 徐 玉 鄧澤元

（1 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 遼寧大連116034 2 南昌大學(xué)食品學(xué)院 南昌330031）

茶油是我國一種具有保健功能的植物油脂，對高血壓、心臟病等疾病有很好的預(yù)防作用，擁有廣大的發(fā)展前景[1]。茶油富含長鏈甘油三酯，在體內(nèi)消化吸收慢。為克服這一缺陷，將長鏈的甘油三酯（LCT）結(jié)合到中鏈的甘油三酯（MCT）分子上，得到的中長鏈結(jié)構(gòu)酯（MLCT）不僅具備MCT 消化吸收快的特點，還兼具LCT 的優(yōu)勢。MLCT[2]是一種天然油脂經(jīng)結(jié)構(gòu)重組或改性而得到的具有特殊營養(yǎng)功效或生理功能的油脂[3-5]，目前被美國、日本等國家運用于食品強化劑、家庭食用油、嬰幼食品等食品工業(yè)領(lǐng)域[6-7]，然而，MLCT 不溶于水的特性，使其在水相中的應(yīng)用上受到一定的阻礙。

近幾年來，納米乳液在食品工業(yè)中的應(yīng)用得到極大的發(fā)展。其作為傳輸系統(tǒng)，可以改善親脂性物質(zhì)的水溶性、穩(wěn)定性等，而且可使功能性物質(zhì)在人體內(nèi)得到更好的吸收。制備乳液的方法有高能乳化法和低能乳化法。超聲乳化技術(shù)作為高能乳化的一種，具有成本低、時間短、乳化得到的粒徑小等優(yōu)點[8-11]。吐溫80 是一種小分子的乳化劑，相對于大分子的乳化劑而言，吸附到油水界面的速率快，制備的納米乳液粒徑更小[12]。

因體內(nèi)試驗具有費時及成本高的弊端，故大量的學(xué)者傾向于成本低、效率高的體外試驗。通過模擬，可以測定不同類型的脂質(zhì)在胃、腸消化中發(fā)生的化學(xué)及結(jié)構(gòu)的變化[13]。pH-stat 法是模擬脂肪在小腸內(nèi)消化常用的方法，用滴定消耗堿的量來確定脂肪被酶水解后釋放脂肪酸的量[14]。Dahan等[15]用pH-stat 法對中鏈和長鏈的甘油三酯進(jìn)行體外消化的比較。本文以吐溫80 為乳化劑，通過超聲乳化技術(shù)制備中長鏈結(jié)構(gòu)酯納米乳液，對乳液穩(wěn)定性進(jìn)行分析，并對其體外消化進(jìn)行研究，為中長鏈結(jié)構(gòu)酯納米乳液應(yīng)用于食品工業(yè)及其他行業(yè)上提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

茶油，江西贛森食品有限公司；樟樹籽油，溶劑法提取；Lipozyme RM IM（酶活150 IU/g），丹麥諾維信公司；胰脂肪酶，BR 級，美國Sigma 公司；胃蛋白酶，BR 級，美國Sigma 公司；吐溫80 食品級，氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、膽鹽、無水氯化鈣等均為分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

AR1140 電子分析天平，美國奧豪斯貿(mào)易公司；SHA-C 恒溫磁力攪拌器，金壇市榮華儀器制造有限公司；GA92-IIDA 型超聲波細(xì)胞粉碎機，無錫市上佳生物科技有限公司；Nano-ZS90 粒度分析儀，英國馬爾文公司；CX31 電子顯微鏡，日本東京Olympus 有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶法合成中長鏈結(jié)構(gòu)酯 精確稱取物質(zhì)的量比1∶1 的樟樹籽油與茶油50 g，置于具塞錐形瓶中。加入10% wt 的固定化RMIM 脂肪酶，錐形瓶中充入氮氣而后密封，將其放入恒溫磁力攪拌器，保持溫度60 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min 條件下反應(yīng)3 h。終止反應(yīng)，過濾除去固定化脂肪酶。濾液低溫下保存以備分析。

1.2.2 中長鏈結(jié)構(gòu)酯納米乳液制備 將乳化劑吐溫80 加入油相（中長鏈結(jié)構(gòu)酯）中，油相水相分別加熱至75 ℃；在普通攪拌條件下將油相加入水相制備粗乳液，轉(zhuǎn)速為600 r/min，攪拌冷卻至40℃，超聲乳化形成納米乳液。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 超聲時間對納米乳液平均粒徑的影響油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，吐溫80 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，乳化溫度75 ℃條件下制備粗乳液。在功率分別為200，400，600，800，1 000 W 的超聲條件下反應(yīng)15 min。測定所制備納米乳液的平均粒徑。

1.2.3.2 超聲功率對納米乳液平均粒徑的影響油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，吐溫80 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，乳化溫度75 ℃條件下制備粗乳液。在超聲功率400 W 的超聲條件下超聲時間分別為5，10，15，20，30 min。測定所制備納米乳液的平均粒徑。

1.2.3.3 油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)對納米乳液平均粒徑的影響 乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，6%，8%，10%，12%的油相至水相中，乳化溫度為75 ℃，超聲頻率400 W，超聲時間15 min。測定所制備納米乳液的平均粒徑。

1.2.3.4 乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)對納米乳液平均粒徑的影響 油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%，2%，3%，4%，5%，乳化溫度75 ℃，超聲頻率400 W，超聲時間15 min。測定所制備納米乳液的平均粒徑。

1.2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗，選取三因素三水平，以平均粒徑為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析。

1.2.5 穩(wěn)定性考察

1.2.5.1 pH 值穩(wěn)定性 乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，將乳化溫度75 ℃，超聲功率400 W，超聲時間15 min 條件下制備的納米乳液分裝于4 支試管中，分別調(diào)pH 至3.0，5.0，7.0，9.0于室溫條件下測定納米乳液的平均粒徑及電位。

1.2.5.2 儲藏穩(wěn)定性 將制備的納米乳液于常溫下放置7，15，30，60 d 測定納米乳液的平均粒徑和電位。

1.2.6 模擬胃腸液體外消化 為考察茶油納米乳液及中長鏈結(jié)構(gòu)酯納米乳液的生物利用情況，用優(yōu)化所得最佳條件制備茶油及中長鏈結(jié)構(gòu)酯納米乳液，在Liu[16]和Garrett[17]等人研究方法的基礎(chǔ)上，模擬其體外胃腸消化過程，同時測定不同階段的電位及粒徑。

胃液消化過程如下：首先配制模擬胃液，7 mL HCl，2 g NaCl 和3.2 g 胃蛋白酶混合，定容至1 L。通過1.0 mol/L 的 HCl 調(diào)節(jié)胃液pH 值為1.2。取5 mL 的納米乳液于100 mL 燒杯中，加入15 mL 的胃液，調(diào)節(jié)pH 穩(wěn)定在1.2，在37 ℃磁力攪拌條件下，250 r/min 攪拌2 h。

腸液消化過程如下：取胃液消化后的液體10 mL，依次加入4 mL 48.5 mg/mL膽鹽，1 L 750 mmol/L 氯化鈣溶液，5 mL 12 mg/mL 胰脂肪酶?；旌暇鶆颍灰?.05 mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)體系的pH至7.0，模擬腸液消化過程。在此過程中，通過加入0.01 mol/L 的NaOH 來維持體系pH 維持在7.0。記錄不同時間段消耗NaOH 的體積，以計算游離脂肪酸的釋放率。整個腸液消化過程維持在常溫條件下，磁力攪拌轉(zhuǎn)速為250 r/min，攪拌時間2 h。

1.2.6.1 粒徑和電位分析 為避免多重散射帶來的干擾，將制備的中長鏈結(jié)構(gòu)酯納米乳液用去離子水稀釋100 倍。采用Nano-ZS90 粒度分析儀于常溫下測定納米乳液的電位和粒徑。

1.2.6.2 乳液微觀形態(tài)的觀察 將制備的乳液原樣及胃液腸液消化后的液體，取少量于載玻片上，蓋上蓋玻片，用光學(xué)顯微鏡觀察其微觀形態(tài)，并拍照。放大倍數(shù)400 倍。

1.2.7 脂肪酸釋放率的測定 在模擬腸液消化過程中，中長鏈結(jié)構(gòu)脂在胰脂肪酶的作用下不斷被水解成為游離脂肪酸，在此過程中，一分子的甘油三酯，水解成為一分子的甘油一酯和兩分子的游

離脂肪酸 （如下反應(yīng)式所示）。因此，通過消耗NaOH 的體積，可計算出體系中結(jié)構(gòu)脂水解后釋放出游離脂肪酸（FFAs）的量。

m——樣品中中長鏈結(jié)構(gòu)酯的總質(zhì)量（g）；M——中長鏈結(jié)構(gòu)酯的平均分子質(zhì)量（g/mol）；C——滴定消耗NaOH 溶液的濃度（mol/L）；V——消化t 時所消耗NaOH 的體積（L）。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

在不同的超聲功率，超聲時間，乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)和油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下制備中長鏈甘油酯納米乳液，其對乳液粒徑的影響如圖1。

圖1 超聲功率、超聲時間、乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)及油相的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對納米乳液平均粒徑的影響Fig.1 Effects of ultrasound powers，ultrasound process time，emulsifier content and oil content on the particle size of nano-emulsions

2.1.1 超聲功率對乳液粒徑的影響 圖1a為超聲功率對納米乳液平均粒徑的影響。當(dāng)超聲功率為400 W 時有最小粒徑110.3 nm，隨著超聲功率的增加，平均粒徑呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢。超聲輻射乳液的聚合源于空化效應(yīng)，存在一個最佳功率值，超聲的強度越大，分散作用增強，強烈的剪切作用形成更小的液滴。但過大時，增加了粒子間相互碰撞的可能性，更容易聚集而使粒徑增大[17]。

2.1.2 超聲時間對乳液粒徑的影響 圖1b為超聲時間對納米乳液平均粒徑的影響。隨著超聲時間的增加，平均粒徑減小。這與Vaiyapuri 等[18]的研究一致。但超聲時間的延長會造成能耗及成本增加，故選擇15～20 min 最佳。

2.1.3 乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳液粒徑的影響 圖1c為乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)對納米乳液平均粒徑的影響。乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時，有最小平均粒徑87.37 nm。平均粒徑隨著乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)先減后增的趨勢。當(dāng)乳化劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時，沒有足量的乳化劑來乳化油滴，所以粒徑較大。而乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過3%時，乳化劑過量，多余的乳化劑吸附于液滴表面，導(dǎo)致乳液粒徑的增加[19]。

2.1.4 油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳液粒徑的影響 圖1d為油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)對納米乳液平均粒徑的影響。當(dāng)油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%時有最小平均粒徑87.37 nm。隨著油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，納米乳液的粒徑先減小后增加。陳冬等用超聲制備姜油納米乳液也有類似的趨勢[20]。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取超聲時間15 min，以超聲功率，乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)3 個指標(biāo)為自變量，平均粒徑為響應(yīng)值進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗。因素水平設(shè)計表如表1所示。

試驗設(shè)計與結(jié)果如表2所示，利用Design Expert 8.0 軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，得到回歸模型方程（A，B，C 分別表示超聲功率、油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)、乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)），系數(shù)方差分析如表3所示。

R=82.14+2.50A+0.40B+4.10C+10.37AB+7.12AC+15.75A2+22.25B2+11.75C2該回歸模型P＜0.05，說明模型顯著。而失擬項不顯著（P＞0.05）；說明該方程有良好的模擬性，可用于優(yōu)化本試驗的設(shè)計，以確定所制備乳液的最佳平均粒徑。從表4的數(shù)據(jù)可知，A2、B2、AB （P＜0.01）差異極顯著，AC、C2（P＜0.05）差異顯著。3 個因素對乳液平均粒徑的影響從小到大依次為超聲功率，乳化劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表1 因素水平設(shè)計表Table 1 The design of factors and levels in the response surface

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Response surface design and results

表3 回歸模型系數(shù)方差分析Table 3 Results of ANOVA of regression model coefficient

（續(xù)表3）

在上述模型的基礎(chǔ)上，以某個因素為零水平，考察另外兩個因素對乳液粒徑的影響，得到的三維響應(yīng)面圖如圖2所示。利用Expert 8.0 軟件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的結(jié)果為：超聲功率400 W，乳化劑含量3%，油含量6%。預(yù)測該條件下得到的平均粒徑為82 nm。進(jìn)行驗證試驗，得到的平均粒徑為85 nm±1.43 nm。

圖2 超聲功率、油含量與乳化劑含量對乳液粒徑的影響Fig.2 Effects of ultrasonic power，oil content and emulsifier content on the average size in nano-emulsions

2.3 穩(wěn)定性考察

2.3.1 pH 穩(wěn)定性 pH 值對納米乳液平均粒徑和電位的影響分別如圖3a、圖3b所示。當(dāng)pH 在3～9范圍內(nèi)，吐溫作為乳化劑制備的中長鏈酯納米乳液的平均粒徑基本保持不變，電位變化不顯著（P＞0.05），因為吐溫80 作為非離子型乳化劑的一種，受pH 的影響很小。這與Hsu 等[21]的研究一致，表明制備的乳液具有良好的pH 穩(wěn)定性，可用于酸性或堿性食品的開發(fā)。

圖3 pH 值對納米乳液平均粒徑和Zata 電位的影響Fig.3 Effects of pH on the paticle size and Zata potential of nano-emulsion

圖4 不同儲藏時間對納米乳液平均粒徑和Zata 電位的影響Fig.4 Effects of different storage times on the paticle size and Zata potential of nano-emulsion

2.3.2 儲藏穩(wěn)定性 將制備的中長鏈酯納米乳液于常溫下放至7，14，21，28 d。測定平均粒徑及電位的變化如圖4a、圖4b所示。隨著儲藏時間的延長，乳液的粒徑有略微增加，但變化不顯著（P＞0.05）。由于時間越長，粒子間相互碰撞的幾率增大，導(dǎo)致粒子的聚合，平均粒徑有所增加[18]。而電位隨著儲藏時間的延長，變化不顯著（P＞0.05）。電位是表明乳液穩(wěn)定性的一個常見指標(biāo)，電位絕對值越大，表明兩個相同電荷的粒子間相互作用越強，排斥力越大，粒子更不容易聚合，則穩(wěn)定性越好[22]。粒徑電位變化不顯著說明乳液具有良好的儲藏穩(wěn)定性，有利于運用到以后的應(yīng)用中。

2.4 體外消化

2.4.1 乳液經(jīng)體外消化后的穩(wěn)定性及微觀結(jié)構(gòu)乳液經(jīng)過模擬胃腸消化后的微觀結(jié)構(gòu)及平均粒徑、電位的變化如圖5和圖6所示。納米乳液經(jīng)過模擬胃液消化后粒徑并沒有明顯的變化。乳液之所以可以在胃液作用后穩(wěn)定存在，可能是因為吐溫分子的聚氧基頭部基團(tuán)提供的強靜電作用。吐溫80 是一種非離子型的乳化劑，分子中含有親水頭部，具有高的表面活性。Nik 等[23]的研究也表明非離子型的乳化劑制備的乳液可以在胃酸作用的條件下穩(wěn)定存在。經(jīng)過腸液消化之后粒徑明顯增加，由于脂肪酸，膽鹽等大量的表面活性物質(zhì)的存在，取代了體系中最初吸附于液滴表面的吐溫80。導(dǎo)致整個體系的穩(wěn)定性遭到了破壞，使得乳液的粒徑相應(yīng)增加。而茶油制備的乳液與中長鏈結(jié)構(gòu)酯納米乳液相比具有更大的粒徑，更小的電位絕對值，無論是在消化前還是消化后。這與徐俊杰等人[24]的研究結(jié)果一致。不同鏈長的油脂具有不同的物理化學(xué)性質(zhì)，從而影響其體內(nèi)的消化[25]。對影響脂質(zhì)消化吸收因素的不斷研究，使食品工業(yè)能夠設(shè)計生產(chǎn)出控制脂肪消化吸收的食物，對人體健康及疾病控制有重要意義。

圖5 模擬胃腸消化后平均粒徑和電位的變化Fig.5 Changes of particle size and Zata potential after simulated digestion

圖6 模擬胃腸消化后乳液的微觀結(jié)構(gòu)Fig.6 The microstructure of emulsion after simulated digestion

2.4.2 消化過程中脂肪酸釋放率變化 圖7為模擬小腸消化的2 h 內(nèi)，游離脂肪酸的釋放率隨時間的變化情況。在前15 min，脂肪酸的釋放率快速上升，15 min 后上升的幅度變緩。最后趨于穩(wěn)定。Yan Li 等[26]的研究有類似的趨勢。中長鏈結(jié)構(gòu)酯納米乳液與茶油納米乳液相比有更快的消化速率，且最終釋放率為70.58%。結(jié)構(gòu)酯消化水解是一種界面反應(yīng)，不同粒徑大小的乳液與脂酶有不同的接觸表面積[27]。由于中長鏈結(jié)構(gòu)酯納米乳液具有更小的初始粒徑，結(jié)構(gòu)酯與脂酶的接觸表面積更大，則消化速率更快。

圖7 脂肪酸釋放曲線Fig.7 Free fatty acids released curve

3 結(jié)論

超聲制備中長鏈結(jié)構(gòu)酯納米乳液，通過響應(yīng)面試驗得到制備的最優(yōu)條件為超聲功率400 W，乳化劑的含量3%，中長鏈甘油酯的含量6%，所得納米乳液的平均粒徑為85 nm±1.43 nm。制備的乳液具有良好的pH 穩(wěn)定性和儲藏穩(wěn)定性。與茶油乳液相比具有更快的消化速率。是一種極具潛力的功能油脂納米乳液。下一步研究工作將對中長鏈酯納米乳液的功能特性進(jìn)行研究。通過體內(nèi)試驗，研究其與茶油相比對于心血管以及脂代謝相關(guān)疾病預(yù)防的優(yōu)勢。