水果酵素體外抗氧化及抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的研究

李云姣 李 琪 杜佳峰 陳楊揚(yáng) 劉坤娜 桑亞新

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定071000）

酵素按發(fā)酵原料種類可分為植物酵素、 菌類酵素和動(dòng)物酵素。水果酵素即以一種或多種水果為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵而產(chǎn)生的酵素食品[1]。水果是水溶性維生素、植物甾醇、膳食纖維、維生素和生物活性物質(zhì)的良好來源。水果經(jīng)發(fā)酵后，不僅可以最大限度保留水果的營(yíng)養(yǎng)成分，而且在發(fā)酵過程中產(chǎn)生其它的生物活性，可以增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)，延長(zhǎng)水果的保質(zhì)期[2]。

酵素食品在韓國、日本及東南亞地區(qū)甚為流行，近些年在國內(nèi)市場(chǎng)也開始流行，而國內(nèi)關(guān)于水果酵素的研究尚處于起步階段。雖然酵素宣稱具有各種功效，但研究主要集中在抗氧化，消炎抗菌和解酒護(hù)肝等方面，如葡萄酵素、火龍果酵素、桂圓酵素、核桃青皮果蔬酵素等[3-7]，對(duì)其功能性的研究還不夠全面和明確，關(guān)于降血糖活性方面的研究更少，對(duì)水果酵素降血糖的作用及其機(jī)理的研究也鮮有報(bào)道。而高血糖是目前已知的并發(fā)癥最多的一種疾病，可引發(fā)高血壓、心血管疾病、糖尿病神經(jīng)病變等100 多種疾病[8]?？刂铺悄虿〉姆椒ㄖ皇强刂撇秃蟾哐?，這可以通過抑制存在于胃腸道的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性來實(shí)現(xiàn)[9]。且在其它發(fā)酵果蔬汁中已發(fā)現(xiàn)有抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的潛力，如發(fā)酵蔬菜汁、發(fā)酵梨汁[10-11]等。

本試驗(yàn)中以多種新鮮水果為原料進(jìn)行自然發(fā)酵，測(cè)定水果酵素的抗氧化活性，并對(duì)其體外降血糖活性做初步探究，旨在探索水果酵素更多的功效，為進(jìn)一步明確水果酵素的功能提供了參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

蘋果、香蕉、梨、山楂、火龍果、香橙、檸檬、柚子、葡萄、獼猴桃、紅糖（一級(jí)品）市購。

α-淀粉酶（豬胰腺）、α-葡萄糖苷酶（來自黑曲霉）、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）、沒食子酸（分析標(biāo)準(zhǔn)品），上海源葉生物科技有限公司；阿卡波糖，拜耳醫(yī)藥保健有限公司；其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)。

K5600 型超微量分光光度計(jì)，北京凱奧科技發(fā)展有限公司（KAIAO）；酶標(biāo)儀，美國Thermo 公司；高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理[3]選取蘋果、香蕉、梨、山楂、火龍果、香橙、檸檬、柚子、葡萄、獼猴桃10 種新鮮水果，用無菌水洗凈，切成大小均勻的小塊，混合。將水果與紅糖以質(zhì)量比1∶1 加入到已滅菌的發(fā)酵罐中，封口，常溫條件下自然發(fā)酵。分別在發(fā)酵0，30，60，90，120 d 時(shí)取出一定量的樣品，10 000 r/min 離心10 min 棄去沉淀，取上清液保存在-20℃，用于分析。不同發(fā)酵時(shí)期的水果酵素即為水果酵素原液，由于原液濃度較高，試驗(yàn)時(shí)將其稀釋至不同濃度。

1.2.2 理化指標(biāo)的測(cè)定

1） pH 和總酸的測(cè)定：參照GB/T12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》[12]。

2） 還原糖的測(cè)定：DNS 比色法[13]。

3） 蛋白質(zhì)的測(cè)定：考馬斯亮藍(lán)法[14]。

4） 可溶性固形物含量的測(cè)定：手持折光儀。

1.2.3 總酚含量的測(cè)定[15]參照GB/T 31740.2-2015 茶多酚含量的測(cè)定。

1.2.4 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定[16]以無水乙醇溶解DPPH·制得20 mmol/L 的DPPH·溶液。分別將酵素稀釋至原液濃度的0.67%，0.8%，1.00%，1.33%和2.00%，取2 mL 稀釋后的樣品加入到2 mL DPPH-乙醇溶液中混勻，室溫下反應(yīng)30 min，測(cè)定波長(zhǎng)517 nm 處的吸光度，0.01 mg/mL的抗壞血酸作為陽性對(duì)照。

式中，A0——空白對(duì)照液的吸光度；A1——樣品測(cè)定管的吸光度；A2——樣品對(duì)照管的吸光度。

1.2.5 ABTS 自由基清除能力的測(cè)定[17]將7 mmol/L ABTS 和4.9 mmol/L K2S2O8等體積混合，在室溫下黑暗反應(yīng)12～16 h。使用前將ABTS 自由基反應(yīng)液用5 mmol/L 的PBS 稀釋40～50 倍，使其在734 nm 處的吸光度為0.7±0.02。取200 μL 稀釋至原液濃度的0.67%，0.8%，1.00%，1.33%和2.00%的樣品，與800 μL 上述稀釋液混合，30℃下反應(yīng)6 min，在734 nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。計(jì)算公式同（1）。

1.2.6 α-淀粉酶活性抑制試驗(yàn) α-淀粉酶的活性測(cè)定根據(jù)McCue 等[18]的方法略作改動(dòng)。取500 μL 體積分?jǐn)?shù)為2%，4%，6%，8%和10%的樣品，與500 μL 0.5 mg/mL α-淀粉酶溶液 （6.5 U/mL）在37 ℃下預(yù)混合10 min 后，加入500 μL 1%可溶性淀粉溶液起始反應(yīng)，反應(yīng)所用緩沖液為0.02 mol/L、pH 6.9（含0.006 mol/L NaCl）的磷酸鹽緩沖液。反應(yīng)混合液于37 ℃反應(yīng)10 min 后，加入1 mL DNS 試劑終止反應(yīng)，反應(yīng)液置沸水浴中5 min 后于冰水浴中迅速冷卻，加蒸餾水補(bǔ)足體積至15 mL 后測(cè)定540 nm 波長(zhǎng)處吸收值，同時(shí)做樣品對(duì)照。0.5 mg/mL 的阿卡波糖液作為陽性對(duì)照。

式中，As——樣品組吸光值；Asc——樣品對(duì)照組吸光值；Ac——陰性對(duì)照組吸光值；Abc——陰性空白對(duì)照組吸光值。

1.2.7 α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗(yàn) α-葡萄糖苷酶的活性測(cè)定根據(jù)McCue 等[18]的方法略作改動(dòng)。以PNPG 為底物測(cè)定樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用。取50 μL 體積分?jǐn)?shù)為10%，20%，30%和40%的樣品，與100 μL α-葡萄糖苷酶 （20 U/mL） 在40 ℃預(yù)混合10 min 后，加入20 mmol/L PNPG 50 μL 起始反應(yīng)，反應(yīng)所用緩沖液為0.1 mol/L、pH 5.5 的磷酸鹽緩沖溶液。反應(yīng)混合液于40 ℃反應(yīng)60 min 后，加入50 μL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定400 nm 波長(zhǎng)處的吸收值，同時(shí)做樣品對(duì)照。0.5 mg/mL 的阿卡波糖液作為陽性對(duì)照。對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率按照公式（2）計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

發(fā)酵120 d 的酵素理化指標(biāo)結(jié)果如表1所示。

由表1可知，水果酵素的pH 值為3.51，有較高的酸度。蛋白質(zhì)為0.34 mg/mL，含量均低于核桃青皮果蔬酵素，總糖含量和可溶性固形物分別為259.32 mg/mL 和40.2%，均高于核桃青皮果蔬酵素[7]。

表1 酵素的理化指標(biāo)Table1 Chemical composition in fermented fruit juice

2.2 總酚含量的測(cè)定

大量研究表明，多酚類化合物具有良好的體外抗氧化活性和抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性[19-21]。水果酵素中總酚含量如圖1所示。

圖1 發(fā)酵過程中總酚含量的變化Fig.1 Changes in total phenolic compounds during fermentation

由圖1可知，在發(fā)酵過程中，酵素中總酚含量呈逐漸下降的趨勢(shì)，與發(fā)酵前相比，發(fā)酵120 d后，多酚含量由2.97 mg/mL 降至2.23 mg/mL，差異顯著（P＜0.05）。一方面，可能是由于酵素在發(fā)酵過程中激活了多酚氧化酶，促進(jìn)多酚發(fā)生氧化聚合反應(yīng)生成大的酚類聚合物[22-23]；另一方面，小的酚類物質(zhì)在細(xì)菌和酵母的作用下發(fā)生了降解[24]。

2.3 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定

DPPH 自由基是脂溶性自由基，是體外檢測(cè)物質(zhì)抗氧化效果最常用的一種方法。酵素在發(fā)酵過程中的DPPH 自由基清除率如圖2所示。

從圖2可以看出，酵素與發(fā)酵前相比，發(fā)酵30 d 后DPPH 自由基清除率下降，且差異極顯著（P＜0.01）。發(fā)酵90 d 的酵素DPPH 自由基清除率較發(fā)酵60 d 時(shí)顯著下降（P＜0.01），在發(fā)酵120 d時(shí)無明顯下降。DPPH 自由基清除率發(fā)酵120 d 與發(fā)酵前相比，顯著下降，當(dāng)樣品濃度為2.00%時(shí)，DPPH 自由基清除率由95.96%下降至87.19%，低于陽性對(duì)照93.82%。改變反應(yīng)體系中樣品濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著樣品濃度的增加，樣品的DPPH 自由基清除率也隨之增加，呈明顯的劑量依賴性。DPPH 自由基清除率的變化與總酚含量變化相一致，酵素中總酚與DPPH 自由基清除率有較大的相關(guān)性（r=0.856），因此，酵素中DPPH 自由基清除能力的變化可能與總酚含量變化有關(guān)。

2.4 ABTS 自由基清除能力的測(cè)定

ABTS 法也是測(cè)定抗氧化活性較為常用的一種方法，其優(yōu)點(diǎn)是可溶于極性溶劑和非極性溶劑[18]。圖3為酵素在發(fā)酵過程中ABTS 自由基清除能力的變化。

由圖3可知，酵素在發(fā)酵30 d 時(shí)ABTS 自由基清除能力下降，在樣品濃度為0.67%～1.00%時(shí)差異顯著（P＜0.01）；在發(fā)酵60 d 時(shí)ABTS 自由基清除能力顯著增加（P＜0.01），只有樣品濃度為2.00%時(shí)增加不顯著；在發(fā)酵90 d 和120 d 時(shí)，ABTS 自由基清除能力基本保持不變，當(dāng)樣品濃度為1.00%～2.00%時(shí)，清除率可達(dá)到95.49%～100.00%。與陽性對(duì)照0.125 mg/mL VC 相比，酵素的ABTS 自由基清除率顯著高于相同體積的VC溶液（P＜0.01）。改變反應(yīng)體系中樣品濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酵素對(duì)ABTS 自由基的清除率隨著樣品濃度的增加而增大，表明酵素對(duì)ABTS 自由基的清除能力呈一定的劑量效應(yīng)。經(jīng)試驗(yàn)測(cè)得，酵素中總酚含量與ABTS 自由基清除能力的相關(guān)度較低，因此推斷酵素中存在多酚類以外的物質(zhì)在起作用或是多酚同多種生物活性物質(zhì)共同作用的結(jié)果。

2.5 α-淀粉酶活性抑制試驗(yàn)

水果酵素在自然發(fā)酵過程中對(duì)α-淀粉酶的抑制作用如圖4所示。在發(fā)酵過程中，酵素對(duì)α-淀粉酶的抑制作用增加，在發(fā)酵30 d 時(shí)，對(duì)α-淀粉酶的抑制率增加極顯著（P＜0.01）。樣品濃度為4%時(shí)，抑制率從23.80%增加至99.57%，即發(fā)酵120 d 的水果酵素對(duì)α-淀粉酶的抑制作用增加了318.34%。而0.5 mg/mL 的阿卡波糖液對(duì)α-淀粉酶的抑制率為35.76%，因此，水果酵素的α-淀粉酶抑制活性高于0.5 mg/mL 的阿卡波糖液，大約相當(dāng)于同體積的濃度為1.39 mg/mL 的阿卡波糖液。樣品的α-淀粉酶抑制率在發(fā)酵0 d 時(shí)，隨著反應(yīng)體系中樣品濃度的增加而增加，在發(fā)酵30 d 及以后，劑量效應(yīng)并不明顯。研究表明，除了植物多酚，如蘋果多酚等具有α-淀粉酶抑制活性以外[21]，大量的天然多糖也具有較好的抗糖尿病功能，如苦瓜多糖就顯示出顯著的α-淀粉酶抑制活性[25-26]。水果酵素的α-淀粉酶抑制率與多酚含量呈高度的負(fù)相關(guān)性（r=-0.968），這說明雖然多酚可以調(diào)節(jié)對(duì)α-淀粉酶的抑制效果，但在水果酵素中還存在除多酚類以外的生物活性物質(zhì)，也具有抑制α-淀粉酶活性的作用。

2.6 α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗(yàn)

樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果如圖5所示。酵素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用在發(fā)酵過程中呈緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)，在發(fā)酵90 d 時(shí)下降，隨后又有所增加。從發(fā)酵初始至發(fā)酵結(jié)束，樣品的α-葡萄糖苷酶抑制率由73.98%增加至81.67%，增加了10.39%。陽性對(duì)照0.5 mg/mL 的阿卡波糖液對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率達(dá)到84.54%，略高于酵素，酵素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果大約相當(dāng)于0.48 mg/mL 的阿卡波糖液。不同濃度樣品的α-葡萄糖苷酶抑制率呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)，隨著樣品濃度的增加而增大。水果酵素的α-葡萄糖苷酶的抑制率與多酚呈較低的負(fù)相關(guān)，這可能是因?yàn)槎喾?、有機(jī)酸、多糖、蛋白質(zhì)等對(duì)α-葡萄糖苷酶均具有抑制作用，且抑制作用可能有協(xié)同作用[20]。

圖2 發(fā)酵過程中DPPH 自由基清除率的變化Fig.2 Changes of DPPH free radical scavenging activity during fermentation

圖3 發(fā)酵過程中ABTS 自由基清除率的變化Fig.3 Changes of ABTS free radical scavenging activity during fermentation

圖4 水果酵素對(duì)α-淀粉酶的抑制作用的變化Fig.4 Changes in inhibitory effect of sample against α-amylase

圖5 水果酵素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的變化Fig.5 Changes in inhibitory effect of sample against α-glucosidase

3 結(jié)論

本文研究了水果酵素在發(fā)酵過程中抗氧化活性和對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用。結(jié)果表明，水果酵素具有良好的抗氧化活性和較好的抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性。其中，DPPH 自由基清除率隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，在發(fā)酵120 d 時(shí)可達(dá)到87.19%；ABTS 自由基清除率增加，在發(fā)酵120 d 時(shí)達(dá)到100.00%。對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性在發(fā)酵過程中增加，分別達(dá)到100%和81.67%。水果酵素表現(xiàn)出較高的抗氧化活性和α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性，具有很大的降血糖潛力，為進(jìn)一步研究水果酵素的其它功能奠定基礎(chǔ)。