刺囊酸及其衍生物的體外化療增敏作用及機制研究

譚 敏，曹 旭，徐 僑，張 夢，張 駒，韓 旭，賴 朋*

(1.西華大學西華學院， 四川 成都 610039； 2.西華大學食品與生物工程學院， 四川 成都 610039)

目前，化療是惡性腫瘤的主要臨床治療手段，腫瘤細胞的多藥耐藥(MDR，multiple drug resistance)是導致化療失敗的重要原因。MDR是指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物產生耐藥性的同時，對結構和作用機制不同的其他抗腫瘤藥物也產生交叉耐藥性[1-2]。產生MDR最主要的原因是P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)對抗腫瘤藥物的外排作用。P-gp是MDR1基因表達產物，為ABC(ATP-binding cassette)家族成員，含2個跨膜結構域，2個ATP結合結構域。P-gp的底物與結合位點結合，消耗兩分子ATP泵出一分子藥物[3-4]。其他原因還有多藥耐藥相關蛋白(MRP)、肺耐藥蛋白(LRP)、谷胱甘肽及谷胱甘肽-S-轉移酶、PKC和TopoII等[5-6]。

P-gp抑制劑是逆轉MDR的常用藥物[7-8]，包括：鈣通道阻滯劑(維拉帕米)[9]、環(huán)孢菌素A[10]、抗激素類化合物(他莫昔芬)[11]等。這些逆轉劑的作用機制并不相同，有些作用于MDR1基因，降低 P-gp的表達[12]；有些與底物競爭結合P-gp[13]；有些與P-gp ATP結合部位結合抑制其作用[14]。近年來發(fā)現許多天然產物也有類似作用，如異喹啉類生物堿、粉防已堿等可通過抑制P-gp活性增強阿霉素或長春新堿等藥物的抗癌效果，這些化合物被稱為化療增敏劑[15-16]。

本研究從豆科植物皂莢(GleditsiaSinensisLam.)的棘刺中提取分離純化得到刺囊酸作為先導化合物，經相應的化學反應制備了一系列衍生物(受試衍生物化學結構及編號分別見圖1和表1)[17]。本實驗選取刺囊酸及其衍生物作為實驗對象，探索刺囊酸及其衍生物對腫瘤多藥耐藥的影響，并對其逆轉多藥耐藥機制進行相關研究。

圖 1 刺囊酸(EA)及其衍生物的化學結構

表1 刺囊酸及其衍生物的編號

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人乳腺癌細胞敏感株MCF-7、人肝癌敏感株HepG-2、105IU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基、阿霉素購自Sigma Aldrich公司；10%小牛血清購自浙江天航生物科技股份有限公司；ELISA試劑盒購自R&D Systems公司。

1.2 儀器與設備

酶標儀購自北京普天新橋技術有限公司，ELISA試劑盒購自上?？祈樕锟萍加邢薰?。

1.3 實驗方法

1.3.1 腫瘤細胞的耐藥實驗

腫瘤細胞敏感株MCF-7和HepG-2用含10%小牛血清+105IU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基在恒溫培養(yǎng)箱37 ℃、飽和濕度、5%CO2條件下培養(yǎng)。相應阿霉素耐藥株MCF-7/DOX、HepG-2/DOX連續(xù)培養(yǎng)在含1.0 mg/L的阿霉素的上述培養(yǎng)基，在恒溫培養(yǎng)箱37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)。

取對數生長期的敏感細胞和耐藥細胞接種于96孔板，每孔內180 μL，約5×103個細胞，培養(yǎng)過夜。敏感株和耐藥株分別以10倍稀釋的方法由高到低加入20 μL不同濃度的阿霉素(10-3、10-4、10-5、10-6、10-7mol/L)作為實驗組，對照組只加等體積的培養(yǎng)基不加藥物。

采用常規(guī)MTT實驗方法，于全自動酶標儀上測定各孔在490 nm處吸光度(A)值，取3孔平均值計算細胞生長率和抑制率：生長率(%)=實驗組A值/對照組A值×100%；抑制率(%)=100%-生長率。使用SPSS19.0統(tǒng)計得出IC50。耐藥倍數=耐藥株IC50/ 敏感株IC50計算出耐藥細胞株耐藥倍數。

1.3.2 刺囊酸及其衍生物細胞毒測定

各平行3次取對數生長期的敏感細胞和耐藥細胞接種于96孔板，每孔內180 μL，約5×103個細胞，培養(yǎng)過夜。敏感株和耐藥株分別以10倍比稀釋的方法由高到低加入20 μL不同濃度的刺囊酸及其衍生物(10-3、10-4、10-5、10-6、10-7mol/L)，對照組只加等體積的培養(yǎng)基不加藥物。

采用常規(guī)MTT實驗方法，于全自動酶標儀上測定各孔490 nm處吸光度(A)值，取3孔平均值計算細胞生長率和抑制率：生長率(%)=實驗組A值/對照組A值×100%；抑制率(%)=100%-生長率。使用SPSS19.0統(tǒng)計得出IC50。

1.3.3 MDR逆轉實驗

各平行3次取對數生長期耐藥株HepG-2/DOX和MCF-7/DOX接種于96孔板，每孔內180 μL，約5×103個細胞，培養(yǎng)過夜。再分別加入10 μL不同濃度的阿霉素(2×10-3、2×10-4、2×10-5、2×10-6、2×10-7mol/L)，最后按高、中、低3種劑量加入10 μL不同濃度的刺囊酸及衍生物(設3個濃度，最高濃度為相應受試物IC50的1/10，細胞活力基本不受影響，此實驗設為2、0.5、0.1 μmol/L)，對照組只加等體積的培養(yǎng)基不加藥物。

采用常規(guī)MTT實驗方法，于全自動酶標儀上測定各孔490 nm處吸光度(A)值，取3孔平均值計算細胞生長率和抑制率：生長率(%)=實驗組A值/對照組A值×100%；抑制率(%)=100%-生長率。使用SPSS19.0統(tǒng)計得出IC50。MDR逆轉倍數=耐藥株IC50/ 加入逆轉劑后IC50計算受試化合物對MDR的逆轉倍數。

1.3.4 測定P-gp的表達

采用ELISA法測定P-gp的水平。96孔板中的HepG-2/DOX細胞與濃度為2 μmol/L的受試物或空白培養(yǎng)基共培養(yǎng)24 h后，倒去培養(yǎng)基，加入0.1%Tween-20/PBS洗滌(50 μL/孔)30 s，敞開置于37 ℃環(huán)境中30 min，加入固定液(100 μL/孔)，5 min后加入0.1%Tween-20/PBS洗滌(200 μL/孔)20 min，PBS洗滌2次，加入1%的BSA-PBS(100 μL/孔)4 ℃靜置1 h，加入ddH2O稀釋的一抗(100 μL/孔)，4 ℃過夜，PBS連洗3次，加入用1%的BSA-PBS稀釋的二抗(100 μL/孔)，室溫3 h，PBS連洗5次，加入底物液(100 μL/孔)，10 min后1 mol/L H2SO4終止反應，490 nm處讀數。采用相同方法，不加受試化合物，測定HepG-2細胞中P-gp的表達。

1.3.5 統(tǒng)計方法

2 實驗結果

2.1 腫瘤細胞耐藥倍數

單獨使用阿霉素(DOX)作用于敏感株和耐藥株的IC50有顯著差異(見表2),經過計算得到耐藥細胞株耐藥倍數MCF-7/DOX為32.8，HepG-2/DOX為32.7。

表2 敏感株及耐藥株對阿霉素的耐藥測試結果

2.2 受試化合物的細胞毒作用

受試化合物對腫瘤細胞敏感株和耐藥株的細胞毒作用測試結果(見表3)。

表3 受試化合物對腫瘤細胞敏感株及耐藥株的

注：數據由SPSS19.0統(tǒng)計。

2.3 受試化合物的MDR逆轉倍數

受試化合物對MCF-7/DOX和HepG-2/DOX 2種耐藥株細胞均有劑量依賴性的增敏作用(見圖2)，其中TRSZ-5在2 μmol/L劑量下最大逆轉倍數對MCF-7/DOX達7.3，HepG-2/DOX為6.5。

A-F分別表示受試化合物EA、TRSZ-2、TRSZ-3、TRSZ-4、TRSZ-5、TRSZ-6逆轉MCF-7/DOX和HepG-2/DOX細胞對阿霉素(DOX)耐藥的結果。*表示與單用阿霉素相比P<0.05)。

2.4 P-gp的表達

ELISA法測定敏感株HepG-2、耐藥株HepG-2/DOX與受試化合物共培養(yǎng)后P-gp的表達，見圖3。結果表明，2 μmol/L劑量的EA及其衍生物顯著的降低了P-gp在HepG-2/DOX細胞中的表達(實驗指標為490 nm處吸光度顯著降低)，其中化合物TRSZ-5的作用最明顯，這與逆轉耐藥實驗的結果是一致的。

圖 2 刺囊酸及刺囊酸衍生物逆轉MCF-7/DOX和HepG-2/DOX細胞對阿霉素(DOX)耐藥的結果

圖 3 EA及其衍生物對腫瘤細胞P-gp表達的影響

測定HepG-2敏感株中P-gp的表達使用HepG-2敏感株，其余采用HepG-2/DOX耐藥株進行。

3 討論

阿霉素對腫瘤細胞MCF-7和HepG-2具有殺傷作用，由表2可知，與腫瘤細胞敏感株相比，耐藥株的IC50顯著增加，說明耐藥株細胞對阿霉素的殺傷有明顯抵抗作用，可以作為研究對象來研究刺囊酸及其衍生物的化療增敏作用。

由表3可知，受試化合物是有一定細胞毒性的，為了避免由于受試化合物的細胞毒作用對實驗結果造成干擾，實驗選用了高、中、低3種濃度的受試化合物，分別為2、0.5、0.1 μmol/L。由圖2可知，相比于低濃度，在高濃度和中濃度時，耐藥株的IC50明顯降低，即刺囊酸及其衍生物對耐藥株的化療增敏作用顯著增強。但是由于刺囊酸及其衍生物是有細胞毒性的，所以濃度較高時，受試化合物對耐藥株的細胞殺傷作用是不可忽略的；因此,在高濃度時阿霉素對腫瘤細胞的殺傷作用及其機制還有待進一步研究。

受試化合物對MCF-7/DOX和HepG-2/DOX 2種耐藥株細胞均有劑量依賴性的增敏作用，其中化合物TRSZ-5效果尤其突出。分析其化學結構發(fā)現，該化合物酯化了EA的羧基，且3-OH被羰基取代，這樣的結構衍生明顯增加了化合物親脂性。親脂性強的化合物容易通過細胞膜，所以和其他受試化合物相比，親脂性強的TRSZ-5更易于跨膜轉運進入細胞發(fā)揮化療增敏作用。通過增加刺囊酸衍生物的親脂性來增強化療增敏作用可能是此后結構修改的一個方向。

ELISA實驗結果表明，耐藥株的P-gp表達明顯升高，這說明細胞內的化療藥物大量排出，產生耐藥。刺囊酸及刺囊酸衍生物能逆轉阿霉素耐藥從而產生化療增敏作用，同時此作用具有劑量依賴性。雖然ELISA實驗的數據提供了EA及其衍生物作為化療增敏劑的一種可能作用機制，即EA衍生物下調了耐藥細胞P-gp的表達，減少化療藥物外排，但引起耐藥的原因是多種多樣的，相關研究表明多藥耐藥相關蛋白(MRP)[18]、肺耐藥蛋白(LRP)[19]、谷胱甘肽及谷胱甘肽-S-轉移酶[20]、PKC和TopoII[21]等均與多藥耐藥有關[22]；因此探討EA及其衍生物與這些靶點的相互作用也是十分必要的，這也是以后研究的一個方向。

4 結論

本研究采用體外細胞研究的方法，考察了刺囊酸及其衍生物對MCF-7/DOX和HepG-2/DOX的影響。研究結果表明，受試化合物可通過降低耐藥細胞P-糖蛋白表達而使阿霉素效果提升，起到逆轉多藥耐藥、增加化療藥物敏感性的作用。