蜜炙款冬花質(zhì)量標準研究

顏 爽，何宇新，毛正睿，付 帥

(西華大學食品與生物工程學院， 四川 成都 610039)

款冬花為菊科植物款冬的干燥花蕾。蜜炙是中國傳統(tǒng)炮制方法之一，蜂蜜[1]本身作為一種中藥，據(jù)《本草綱目》記載：“其入藥之功有五：“清熱也，補中也，解毒也，潤燥也，止痛也。生則性涼，故能清熱；熟則性溫，故能補中。甘而和平，故能解毒；柔而濡澤，故能潤燥。緩可以去急，故能止心腹、肌肉、瘡瘍之痛；和可以致中，故能調(diào)和百藥，而與甘草同功”。但在炮制過程中，蜂蜜常以輔料的形式與藥物共制，用蜂蜜炮制款冬花，能夠增強款冬花止咳化痰、潤肺下氣的療效，起到協(xié)同作用[2]。越來越多的中藥材以其炮制品的形式入藥，中藥炮制品的使用越來越普及化，但《中國藥典》對蜜炙款冬花的質(zhì)量標準并未詳細規(guī)定，在臨床使用中沒有專門針對炮制品制定的質(zhì)量標準可以參考，使得炮制品的使用沒有具體的規(guī)定；因此，本研究參考2015年版《中國藥典》款冬花項下的質(zhì)量標準，建立蜜炙款冬花質(zhì)量標準，為中藥炮制品質(zhì)量規(guī)范化研究奠定基礎，同時為蜜炙款冬花的使用提供參考標準。

1 儀器與材料

1.1 儀器

普通光學顯微鏡(上海尼康儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(湖北省黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司)；BT423s電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；BT25s十萬分之一天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱(湖北省黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司)；數(shù)控超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)；暗箱式紫外分析儀(上海寶山顧村有限公司)；Waters e2695-2424高效液相色譜(上海沃特世科技有限公司)。

1.2 材料

蜜炙款冬花(批號：171201、171202、171203、171204、171205、171206)，購自四川省中藥材飲片廠；款冬酮對照品，購自上海源葉生物科技有限公司，供含量測定用，HPLC≥98%，批號104012-37-5；甲醇：色譜純，TEDIA；乙醇、乙酸乙酯、石油醚(60～90 ℃)、丙酮等為分析純，成都市科龍化工試劑廠。

2 實驗方法及結果與分析

2.1 薄層色譜法鑒別

2.1.1 樣品液制備

取蜜炙款冬花粉末1 g，加入乙醇20 mL，超聲處理1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL溶解，作為供試品溶液。另取款冬花對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。另取款冬酮對照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.2 薄層色譜定性鑒別實驗方法

照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)試驗，吸取供試品溶液和對照藥材溶液各2～5 μL、對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-丙酮(6 ∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，再以同一展開劑展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。

2.1.3 薄層色譜法定性鑒別結果

實驗結果如圖1所示，在薄層板色譜上，供試品薄層色譜在對照藥材薄層色譜與對照品薄層色譜相應的位置顯示相同顏色的斑點。

注：1～6為蜜炙款冬花；7為款冬酮對照品。

2.2 蜜炙款冬花的水分測定

照2015版《中國藥典》四部通則0832第二法(烘干法)進行蜜炙款冬花的水分測定。將扁形稱量瓶洗凈，干燥至恒重，然后精密稱定各批次的蜜炙款冬花約10 g，平鋪于扁形稱量瓶中，厚度在5 mm左右，共計6份。記錄裝有蜜炙款冬花的稱量瓶的總重量后，打開扁形稱量瓶蓋，置于電熱恒溫鼓風干燥箱中，溫度設置為105 ℃，干燥5 h后拿出。將扁形稱量瓶瓶蓋蓋好后置于普通干燥器中冷卻30 min后，精密稱定并記錄此時裝有蜜炙款冬花的扁形稱量瓶的重量。再將裝有蜜炙款冬花的扁形稱量瓶放入設置為105 ℃的電熱恒溫鼓風干燥箱中干燥1 h，在普通干燥箱中冷卻后再稱重，直到連續(xù)兩次稱重的差異不超過5 mg為止。根據(jù)減失的重量計算供試品中的含水量。

6批蜜炙款冬花水分測定結果如表1所示。

結果顯示，6批蜜炙款冬花含水量為10.290%～12.778%，平均含水量為11.633%，取其120%為13.960%，結合實際情況，暫將蜜炙款冬花含水量要求定為：不得超過14%。

表1 蜜炙款冬花水分測定結果

2.3 蜜炙款冬花的總灰分測定

2.3.1 灰分測定方法

照2015版《中國藥典》四部通則2302總灰分測定法對蜜炙款冬花總灰分進行測定，結果如表2所示。將6個坩堝洗凈后灼熱至恒重，取各批次的蜜炙款冬花粉末約3g，置于坩堝中，共計6份。記錄好裝有蜜炙款冬花的坩堝的總重量后，將6個坩堝緩緩熾熱，加熱期間要避免燃燒，等到完全炭化時，逐漸升高溫度至500～600 ℃，使其完全灰化并至恒重。根據(jù)殘渣重量，計算供試品中總灰分的含量(%)。

2.3.2 灰分測定結果

6批蜜炙款冬花總灰分測定結果如表2所示。

表2 蜜炙款冬花總灰分測定結果

測定結果表明，6批蜜炙款冬花總灰分平均值為12.086%，取其120%為14.503%，結合實際情況，暫定蜜炙款冬花總灰分不得超過14%。

2.4 蜜炙款冬花的醇溶性浸出物測定

2.4.1 醇溶性浸出物實驗方法

照醇溶性浸出物測定法(通則2201)項下的熱浸法測定。分別精密稱定各批次的蜜炙款冬花約10 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，共6份。分別精密加入100 mL的95%乙醇，蓋上瓶塞，記錄裝有蜜炙款冬花和乙醇的錐形瓶總重量。靜置1 h后，連接冷凝回流管并置于水浴鍋中保持微沸，1 h后，放冷，取下錐形瓶，蓋好瓶塞后稱定重量，并用95%的乙醇補足減失的重量。搖勻后過濾，收取濾液，精密量取25 mL濾液置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，并在水浴鍋上蒸干。將蒸干后的蒸發(fā)皿放入105 ℃的烘箱中干燥3 h后，放入干燥箱中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，并以干燥品計算供試品中醇溶性浸出物的含量(%)。

2.4.2 醇溶性浸出物實驗結果

6批蜜炙款冬花樣品按上述方法測定醇溶性浸出物，結果如表3所示。

表3 蜜炙款冬花浸出物測定結果

熱浸法測定結果顯示，6批蜜炙款冬花醇溶性浸出物含量在22.001%～23.998%范圍內(nèi)，平均值為22.991%，取其80%為18.393%，根據(jù)實際測定情況，暫將蜜炙款冬花醇溶性浸出物要求定為：不得低于19%。

2.5 款冬酮含量測定

2.5.1 供試品溶液的制備

對照品溶液的制備：精密稱取款冬酮對照品1 mg，置于10 mL容量瓶，加流動相定容至10 mL。制成每lmL含100 μg款冬酮的溶液，即得。

供試品溶液的制備：取蜜炙款冬花粉末(過四號篩)各1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理1 h，放冷，用95%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

陰性對照溶液的配制：取乙醇適量，加水配制成95%乙醇溶液，即得。

2.5.2 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇 ∶水(85 ∶15)為流動相；檢測波長為220 nm。理論板數(shù)按款冬酮峰計算應不低于5 000。

2.5.3 陰性對照試驗

取陰性對照溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果如圖2所示。結果表明在該色譜條件下，陰性對照溶液對樣品測定無干擾。

2.5.4 方法學考察

2.5.4.1 標準曲線的建立

精密吸取款冬酮對照品溶液2、4、6、8、10 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結果見表4所示。

圖2 陰性對照溶液HPLC色譜圖

進樣體積/μL進樣量/μg峰面積/(μv·s)20.101 4261 37640.202 8524 38160.304 2805 26780.405 61 084 287100.507 01 351 575

以峰面積積分值為縱坐標，進樣量為橫坐標，得回歸方程y=3×106x-16714，r2=0.999 9。

圖3 款冬酮含量測定標準曲線

結果表明，款冬酮的進樣量在 0.1014～0.5070 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.5.4.2 精密度試驗

精密吸取款冬酮標準品溶液10 μL，連續(xù)進樣 6次，記錄峰面積，結果如表5所示，并計算RSD值。

表5 精密度試驗結果

平均峰面積約為1 346 854，RSD值為0.32%，表明儀器精密度良好。

2.5.4.3 穩(wěn)定性試驗

取同一份蜜炙款冬花供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進樣10 μL，記錄峰面積，結果如表6所示，并計算RSD值。

表6 穩(wěn)定性試驗結果

款冬酮平均峰面積為2 892 294，RSD值為0.43%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，可滿足測定需要。

2.5.4.4 重復性試驗

取同一批蜜炙款冬花供試品溶液各6份，分別按照“2.5.1”項下供試品溶液的配制方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，計算款冬酮含量及RSD值，結果如表7所示。

表7 重復性試驗結果

平均含量約為0.2143%，RSD值為1.68%。表明方法的重復性良好。

2.5.4.5 加樣回收率試驗

精密取已知含量的同一批蜜炙款冬花供試品溶液(含量為0.147%)6 份各約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入對照品溶液(款冬酮0.050 7 mg/mL)1 mL，精密加入95%乙醇19 mL，稱定重量，超1 h，放冷，用95%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄數(shù)據(jù)，計算平均加樣回收率和RSD值，結果如表8所示。

回收率在98.48%～101.82%之間，平均回收率約為99.92%，RSD為1.23%。表明該方法準確度良好。

2.5.5 供試品測定

按照“2.5.1”項下配制對照品溶液及供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液、6批蜜炙款冬花供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，測定，積分，記錄峰面積，對照品溶液色譜圖如圖4所示，供試品溶液色譜圖如圖5所示，含量計算結果如表9所示。

含量測定結果表明，6批蜜炙款冬花中款冬酮含量測定的平均值為0.1500%，取其80%為0.1200%，根據(jù)實際測定結果，暫定蜜炙款冬花中，按干燥品計算，含款冬酮(C23H34O5)不得少于0.12%。

表8 加樣回收試驗結果

圖4 款冬酮對照品溶液HPLC色譜圖

圖5 蜜炙款冬花供試品溶液HPLC色譜圖

批號樣品取樣量/g款冬酮含量/%平均含量/%1712011712021712031712041712051712061.0231.0061.0111.0321.0541.0040.154 40.151 10.145 60.149 10.155 30.144 50.150 0

2.5.6 蜜炙前后款冬酮含量對比

將6批生品款冬花在蜜炙前后分別進行款冬酮含量測定，測定結果如表10所示。

表10 款冬花蜜炙前后款冬酮含量對比

經(jīng)過本研究驗證發(fā)現(xiàn),蜜炙后的款冬花中特有成分款冬酮的含量確實高于蜜炙前，款冬酮作為款冬花發(fā)揮潤肺止咳功效的重要成分，蜜炙后款冬酮含量的增大則進一步驗證了蜜炙對中藥材更好地發(fā)揮藥效起到不容忽視的作用，從而體現(xiàn)了本研究的必要性和可行性。

3 討論

通過本研究實驗結果分析，現(xiàn)擬定蜜炙款冬花的質(zhì)量標準如下：在薄層板色譜上，供試品薄層色譜在對照藥材薄層色譜與對照品薄層色譜相應的位置顯示相同顏色的斑點；水分不得超過14%，總灰分不得超過14%，醇溶性浸出物不得少于19%；含量測定中供試品按干燥品計算，款冬酮(C23H34O5)含量不得低于0.12%。

款冬酮作為款冬花中特有的物質(zhì)，對款冬花以及款冬花相關炮制品質(zhì)量控制具有重要意義。相關研究[3]發(fā)現(xiàn)蜜炙后的款冬花中款冬酮的含量明顯高于蜜炙前[4]。藥理研究表明，蜜炙后的款冬花其潤肺止咳的功效增強，而款冬酮[5]則對血小板活化因子[6]引起的血小板聚集有明顯的抑制作用。血小板活化因子作為炎癥、氣喘相關的脂類介質(zhì)，款冬酮對其的抑制作用體現(xiàn)了這一特有物質(zhì)在款冬花潤肺止咳功效中的重要地位。蜜炙后的款冬花中款冬酮含量的增加與蜜炙款冬花在潤肺止咳藥效上的增強之間的藥理聯(lián)系，還有待進一步的研究。