奶牛乳腺炎無乳鏈球菌的分離鑒定與耐藥性分析

薛嬌，劉康軍，李建基，崔璐瑩，孟霞，朱國強，王亨

(1.揚州大學獸醫(yī)學院，揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009 )

奶牛乳腺炎是奶牛四大疾病之一，不僅危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，而且直接影響牛乳制品的品質(zhì)，關系著人類的健康。據(jù)報道，我國奶牛乳腺炎的發(fā)病率大約為20%～70%，臨床型乳腺炎的發(fā)病率為19.7%～55.6%，而隱性乳腺炎的發(fā)病率則高達61.03%～79.62%，給我國的奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失[1]。病原微生物感染是該病最主要的病因之一。引起乳腺炎的病原一共有80多種，其中比較常見的有葡萄球菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌、分枝桿菌等[2]。無乳鏈球菌不僅是常見的乳腺炎病原體，而且還是一種重要的人類病原體，可誘發(fā)新生兒、老年人和孕婦的侵襲性感染[3]。本研究旨在調(diào)查江蘇地區(qū)和河北地區(qū)規(guī)?；膛鰞?nèi)無乳鏈球菌對一些常用抗生素的耐藥情況，為奶牛場臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 奶樣采集

在江蘇地區(qū)和河北地區(qū)的奶牛養(yǎng)殖場中分別采集到55份和12份乳腺炎奶樣。采樣前先用溫水洗凈乳頭并對其進行消毒處理，廢棄前三把乳汁，嚴格按照無菌操作的要求采樣，每個乳區(qū)采5～10mL，做好標記。奶樣收集完成后置于冰盒中，立即送往實驗室進行檢測。

1.2 試劑用品

酵母提取物和胰蛋白胨，購自OXOID公司；氯化鈉，購自國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂粉，購自SOLARBIO公司；質(zhì)控標準品、甲酸和基質(zhì)溶液，購自德國布魯克公司；綿羊血由實驗室采集，現(xiàn)采現(xiàn)用；革蘭氏染液由實驗室制備。

本試驗中共使用12種標準藥敏紙片，均購于杭州天和微生物試劑有限公司。具體藥物名稱以及含量等參照表1。

表1 藥敏紙片含量及判定標準

1.3 試驗方法

1.3.1 無乳鏈球菌的分離純化

將奶樣充分混勻，用滅菌接種環(huán)蘸取奶樣在5%綿羊血瓊脂平板上劃線，37℃恒溫培養(yǎng)24h。觀察菌落形態(tài)以及溶血特性，挑取可疑菌落進行純培養(yǎng)和革蘭氏染色鏡檢。

1.3.2 無乳鏈球菌的MALDI Biotyper系統(tǒng)鑒定

每種微生物都有其自身獨特的蛋白質(zhì)組成，因而擁有獨特的蛋白質(zhì)指紋圖譜。MALDI Biotyper系統(tǒng)就是通過檢測微生物的蛋白質(zhì)指紋譜圖來鑒定微生物[4]。具體方法是：挑取單個菌落涂抹于MALDI靶板上，并加入1μL質(zhì)控標準品用于質(zhì)量校準和儀器參數(shù)優(yōu)化。在單菌落涂層上加入1μL 70%的甲酸水溶液。最后在靶板上加入1μL基質(zhì)溶液，自然干燥后放入質(zhì)譜儀內(nèi)，篩選出特異性的指紋圖譜，與數(shù)據(jù)庫進行比對鑒定細菌。

1.3.3 藥物敏感性試驗

用無菌接種環(huán)挑取單個菌落，在血瓊脂平板上均勻劃線，并放置藥敏紙片，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)，24h后測定抑菌圈直徑，根據(jù)相關標準判斷細菌對藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 無乳鏈球菌的分離鑒定

2.1.1 在血瓊脂平板上的生長情況

無乳鏈球菌在5%綿羊血瓊脂上生長成圓形、光滑凸起、濕潤、邊緣整齊的灰白色針尖大小的菌落（圖1）。

圖1 無乳鏈球菌在血瓊脂平板上的生長情況

2.1.2 染色結(jié)果

挑取單個菌落進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下可見其被染成紫色，呈鏈狀排列（圖2）。

圖2 無乳鏈球菌的染色結(jié)果（革蘭氏染色、10×100）

2.1.3 鑒定結(jié)果

使用MALDI Biotyper系統(tǒng)對奶樣中分離出的菌株進行鑒定，共檢出33株無乳鏈球菌，其分離率為49.3%。圖3為其質(zhì)譜峰圖。

圖3 無乳鏈球菌質(zhì)譜峰圖

2.2 藥物敏感性試驗結(jié)果

對從河北以及江蘇地區(qū)某奶牛場分離出的33株無乳鏈球菌進行藥敏試驗，結(jié)果顯示：河北地區(qū)某奶牛場分離株對阿莫西林、青霉素、多西環(huán)素、頭孢氨芐以及恩諾沙星高度敏感，敏感率均超過80%，對四環(huán)素和克林霉素比較敏感，敏感率分別為50.0%和66.7%，對鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素以及丁胺卡那產(chǎn)生了嚴重的耐藥性。江蘇地區(qū)分離株對阿莫西林、頭孢氨芐和恩諾沙星具有較高的敏感性，其中對頭孢氨芐和恩諾沙星的敏感率均高達96.3%，對青霉素和環(huán)丙沙星比較敏感，但對四環(huán)素、鏈霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、卡那霉素和丁胺卡那耐藥，這幾種藥物的耐藥率分別為：74.1%、100.0%、85.2%、74.1%、81.5%和100.0%。無乳鏈球菌對藥物的敏感與耐藥情況見表2。

表2 藥敏試驗結(jié)果

3 討論

無乳鏈球菌是奶牛乳腺炎最主要的病原體之一。無乳鏈球菌感染乳腺主要有兩種方式：一種是進入乳頭感染乳腺組織，另一種是從傷口進入機體后在血液中大量繁殖，隨血流到達乳腺。細菌感染乳腺后可在細胞中迅速生長繁殖，損傷乳腺導管以及上皮細胞，并造成乳腺導管的堵塞，使小葉和腺泡發(fā)生病理改變，最終導致奶牛喪失泌乳功能[5]。無乳鏈球菌屬于接觸性感染菌，主要通過擠奶設備和操作傳播擴散[6]。本試驗中，江蘇地區(qū)無乳鏈球菌分離率為49.1%，河北地區(qū)的分離率為50.0%。該結(jié)果顯著高于劉春杰等人報道的長春地區(qū)8.2%的無乳鏈球菌分離率[7]，表明乳腺炎的病原菌具有地區(qū)差異性，并且與每個養(yǎng)殖場的環(huán)境衛(wèi)生情況有著直接的關系。本次試驗中所涉及的河北地區(qū)和江蘇地區(qū)的奶牛場在擠奶設備以及操作上可能存在一定的安全隱患。

目前對于乳腺炎的治療主要以抗生素為主，但抗生素的長期使用易導致細菌產(chǎn)生耐藥性。本試驗對分離到的33株無乳鏈球菌進行了藥物敏感性試驗，發(fā)現(xiàn)河北地區(qū)和江蘇地區(qū)奶牛場分離出的無乳鏈球菌的耐藥情況有一些相似之處。比如：兩地的無乳鏈球菌對β-內(nèi)酰胺類藥物中的阿莫西林、頭孢氨芐以及喹諾酮類藥物如恩諾沙星等藥物高度敏感，這與杜琳、周雪等人報道的華北地區(qū)無乳鏈球菌的敏感情況相一致[8]，并且與保加利亞學者Decheva的研究結(jié)果相同[9]。說明β-內(nèi)酰胺類以及喹諾酮類藥物可以作為這兩個地區(qū)的奶牛場治療乳腺炎的主要藥物。河北以及江蘇地區(qū)分離的無乳鏈球菌對克林霉素比較敏感，敏感率分別為66.7%和37.0%，低于易明梅等人報道的上海地區(qū)的無乳鏈球菌對克林霉素的敏感率[10]。兩個地區(qū)的分離株對鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素以及丁胺卡那這四種氨基糖苷類藥物均表現(xiàn)出較高的耐藥性，這一結(jié)果與芮萍等人對河北地區(qū)耐藥性的報道有較大出入[11]，可能是不同養(yǎng)殖場飼養(yǎng)管理情況不同引起。另外，兩個地區(qū)奶牛場無乳鏈球菌分離株的耐藥情況也存在著一定差異。河北地區(qū)分離株對四環(huán)素、多西環(huán)素比較敏感，但在江蘇地區(qū)表現(xiàn)出了較強的耐藥性（均高達74.1%）。這可能是因為這兩個地區(qū)用藥種類和方法不同，在江蘇地區(qū)四環(huán)素類藥物使用的比較多，因此產(chǎn)生了較強的耐藥性。藥敏試驗結(jié)果提示：氨基糖苷類藥物耐藥情況較嚴重，已不能作為這兩個地區(qū)奶牛場治療乳腺炎的主要藥物，而環(huán)丙沙星和恩諾沙星等新型喹諾酮類藥物以及β-內(nèi)酰胺類藥物抑菌效果較好，對乳腺炎的治療有一定效果。

臨床上在治療乳腺炎時應定期進行藥敏試驗，根據(jù)藥敏試驗結(jié)果科學合理地使用抗菌藥物，避免長期過量使用同一種抗生素。使用抗生素時，應嚴格掌握適應癥和用藥指征，劑量要夠，療程要恰當，不濫用抗生素。發(fā)現(xiàn)耐藥菌株時，應改用對病原菌敏感的藥物或采取聯(lián)合用藥。奶牛乳腺炎主要以預防為主，防重于治。創(chuàng)建完善的奶牛飼養(yǎng)管理制度，改善牛舍環(huán)境衛(wèi)生、訓練擠奶員按規(guī)范程序操作和提高擠奶熟練度是降低乳腺炎發(fā)生率的重要措施[12]。目前越來越多的人開始研究更有效的防治方法，如通過營養(yǎng)調(diào)控改善機體的防御機能，應用中草藥作為佐劑增強抗生素或者抗菌素的效果、降低耐藥性等。