正交試驗和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型優(yōu)化通痹凝膠貼劑提取工藝

馬建春，李勇

(1.廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院藥學部，廣東 廣州 510080；2.廣東藥科大學臨床藥學系，廣東 廣州 510006；3.廣東藥科大學藥物研究所，廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東 廣州 510006)

中藥新藥通痹凝膠貼劑由秦艽、 制草烏等中藥組成，具有祛風、 除濕、 散寒的功效，主治風、濕夾雜之寒痹癥。秦艽中所含的環(huán)烯醚萜苷類化合物龍膽苦苷具有明顯的鎮(zhèn)痛抗炎作用[1]。制草烏所含的烏頭類生物堿具有鎮(zhèn)痛、抗炎等藥理作用[2]。由于中藥復方為多成分復雜體系，單一指標變化趨勢難以體現(xiàn)復方整體質(zhì)量，因此本實驗以龍膽苦苷含量、烏頭總生物堿含量、總固體得率等為評價指標。為體現(xiàn)各指標在提取結(jié)果分析中的作用，分析3個指標的權(quán)重系數(shù)，利用反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(BP-ANN)模型對正交試驗得到的提取工藝進行仿真優(yōu)化，最終確定最佳提取工藝。本研究將層次分析(AHP)法、CRITIC法、正交試驗、BP-ANN等方法聯(lián)合應(yīng)用，為中藥復方提取工藝優(yōu)化提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；UV-2450紫外-可見分光光度儀(日本島津公司)；CPA225D型電子分析天平(北京Sartorius公司)。

1.2 藥物及試劑 秦艽、制草烏等藥材購自廣州致信藥業(yè)有限公司，符合《中國藥典》2015年版有關(guān)規(guī)定；對照品龍膽苦苷(批號：110770-201013)、烏頭堿(批號：110720-201111)均購自中國食品藥品檢定研究院(供含量測定用)；液相用甲醇、乙腈為色譜純(德國Merck公司)；液相用水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品溶液制備 按通痹貼劑處方藥物組成及比例，稱取秦艽、制草烏等藥材，按照正交試驗各條件進行提取，濾液濾過，定容至500 mL，作為樣品溶液。

2.2 總固體測定 精密量取“2.1”項下樣品溶液，置干燥至恒重蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，置烘箱中105 ℃干燥5 h，后移至干燥器中，冷卻30 min，再于105 ℃干燥1 h，冷卻，稱重，直至恒重，計算總固體得率。

總固體得率(%)=干燥后固體重量/藥材重量×100%。

2.3 總生物堿含量測定[3]對照品溶液的制備:精密稱取烏頭堿對照品10.03 mg至量瓶中，加0.01 mol·L-1鹽酸溶解并定容至10 mL，得烏頭堿對照品溶液。

測定:取對照品溶液及樣品溶液各1.0 mL，分別置于分液漏斗中，加乙酸鈉緩沖液5.0 mL與溴甲酚綠指示劑2.0 mL，后加超純水至10.0 mL，混合均勻。再精密加入三氯甲烷10.0 mL，充分振搖3 min，靜置10 min后，取下層三氯甲烷液，濾過，棄去初濾液，收集續(xù)濾液至已放入0.5 g無水硫酸鈉的試管中，密塞，靜置30 min，于紫外-可見分光光度計415 nm波長處測定吸光度，計算烏頭總生物堿含量。

2.4 龍膽苦苷含量測定[4]對照品溶液的制備:精密稱取龍膽苦苷對照品14.02 mg至量瓶中，加甲醇溶解并定容至20 mL，得龍膽苦苷對照品溶液。

供試品溶液制備:精密吸取“2.1”項下樣品溶液1 mL，加甲醇稀釋并定容至20 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，得供試品溶液。

陰性供試品溶液制備:按處方藥物比例，按照“2.1”項下制備方法，制備不含秦艽藥材的陰性樣品溶液。精密吸取陰性樣品溶液，加甲醇稀釋并定容至20 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，得陰性供試品溶液。

色譜條件:色譜柱：Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%醋酸溶液(9∶91，V/V)；檢測波長：254 nm；柱溫：35 ℃；流速：1 mL·min-1；進樣量：10 μL；理論塔板數(shù)以龍膽苦苷峰計算應(yīng)不低于3 000。結(jié)果顯示供試品色譜中，在與對照品色譜相同保留時間處，具有相應(yīng)的色譜峰，且陰性無干擾，色譜圖見圖1。

A.龍膽苦苷對照品；B.供試品；C.陰性供試品圖1 龍膽苦苷HPLC色譜圖

2.5 各指標權(quán)重分析 參考文獻[5-6]，采用AHP法結(jié)合CRITIC法對龍膽苦苷、烏頭總生物堿、總固體得率等3個指標建立綜合權(quán)重。

AHP權(quán)重系數(shù)的確定：根據(jù)通痹凝膠貼劑中藥物君臣佐使配伍規(guī)律，烏頭總生物堿、龍膽苦苷及藥效作用強弱，將烏頭總生物堿、龍膽苦苷、總固體得率這3個指標分成3個層次進行量化，按照烏頭總生物堿>龍膽苦苷>出膏率的順序進行排序，構(gòu)建不同指標組合的比較優(yōu)先矩陣，并計算各項指標的相對評分。經(jīng)過計算，烏頭總生物堿、龍膽苦苷、總固體得率的AHP法權(quán)重系數(shù)分別為0.389、0.354、0.257。一致性比較因子CI=0.04，一致性比率CR=0.06，均<0.1，表明指標優(yōu)先比較判斷矩陣具有一致性。

CRITIC法權(quán)重系數(shù)的確定：將正交試驗各指標9組數(shù)據(jù)經(jīng)線性插值處理[指標成分=(該實驗指標成分含量-最低含量)/(最高含量-最低含量)×100]，消除單位量綱后，計算烏頭總生物堿、龍膽苦苷、總固體得率各指標對比強度(si)、沖突性(δi)、綜合權(quán)重(ci)與權(quán)重(ωi)。經(jīng)CRITIC法后得到烏頭總生物堿、龍膽苦苷、總固體得率的權(quán)重系數(shù)分別為0.425、0.335、0.240。

AHP-CRITIC混合加權(quán)法確定權(quán)重：AHP法得到了以主觀信息為基礎(chǔ)的權(quán)重系數(shù)，CRITIC法求得相應(yīng)指標的客觀權(quán)重系數(shù)，將兩種系數(shù)綜合，得到3個指標成分的綜合權(quán)重。綜合權(quán)重公式為ω綜ij=ωAHP-ijωCRITIC-ij/∑ωAHP-ijωCRITIC- ij。經(jīng)過計算，烏頭總生物堿、龍膽苦苷、總固體得率的綜合權(quán)重分別為0.526、0.344、0.130，即綜合評分=(烏頭總生物堿測得含量/烏頭總生物堿最高含量)×0.526×100+(龍膽苦苷含量/龍膽苦苷最高含量)×0.344×100+(總固體得率/總固體最高得率)×0.130×100。

2.6 正交試驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)文獻報道[4，7]及預實驗結(jié)果，本研究采用L9(34)正交試驗設(shè)計通痹凝膠貼劑提取工藝，以烏頭總生物堿含量、龍膽苦苷含量、總固體得率為指標，對影響提取效率的4個因素乙醇濃度(A)、乙醇用量(B)、提取次數(shù)(C)及提取時間(D)等進行正交試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。

表1 通痹凝膠貼劑正交試驗結(jié)果

表2 正交試驗方差分析

注：*F0.05(2,2)=19.00

由表1正交試驗結(jié)果可知，影響通痹凝膠貼劑提取工藝的因素由大到小依次為：C>B>A>D，表2方差分析結(jié)果表明提取次數(shù)在各水平間具有顯著性差異，是影響通痹凝膠貼劑提取的主要因素。最佳工藝組合為A1B3C2D3，即藥材加12倍量60%乙醇提取2次，每次2 h。

2.7 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模與應(yīng)用[8-10]

2.7.1 BP-ANN模型構(gòu)建 采用Matlab R2014a數(shù)學軟件(美國MathWorks公司)構(gòu)建 N為隱含層的4-N-1型BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，以乙醇濃度、乙醇用量、提取次數(shù)、提取時間這4個影響因素數(shù)據(jù)為輸入層，以綜合評分為輸出層，構(gòu)建提取工藝仿真優(yōu)化模型，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖見圖2。

圖2 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)運行模型

2.7.2 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的運行

2.7.2.1 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型測試 將表1的9組數(shù)據(jù)導入BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，其中隨機抽取7組數(shù)據(jù)用于模型訓練，剩余2組數(shù)據(jù)用于模型測試。通過對不同神經(jīng)元數(shù)進行訓練，得知當隱含層節(jié)點數(shù)為10時，其中訓練函數(shù)為trainlm，最大訓練迭代次數(shù)為500，隱含層神經(jīng)元的傳遞函數(shù)為tansig，輸出層神經(jīng)元的傳遞函數(shù)為 purelin，其他各項參數(shù)為默認值時，2組預測數(shù)據(jù)的輸出值與實際值相對誤差小于1.5%，表示該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型訓練與預測精度較好，滿足試驗要求。

2.7.2.2 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型最佳工藝的仿真優(yōu)化 對正交試驗中乙醇濃度、乙醇用量、提取次數(shù)、提取時間4個因素的3個水平進行任意組合，可得到64種不同組合。將這64種組合作為輸入值，用“2.7.2.1”項下構(gòu)建的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進行仿真優(yōu)化。通過對輸出層的綜合評分結(jié)果進行篩選，最終確定通痹凝膠貼劑的最優(yōu)提取工藝為：藥材加10.8倍量67%提取2次，每次1.7 h。

2.8 驗證試驗 分別按照正交試驗及BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化得到的提取工藝進行提取工藝驗證，平行3次。應(yīng)用正交試驗得到提取工藝的綜合評分平均值為94.74，按照BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化得到的提取工藝條件的綜合評分平均值為95.03，兩種提取工藝綜合評分接近，但BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化的提取工藝具有乙醇用量少、提取時間短、能耗低的優(yōu)點。

3 討論

3.1 目前中藥制劑一般采用多指標優(yōu)選提取工藝，但多數(shù)研究對各指標的權(quán)重賦值采用主觀法，不能真實反映各指標對提取效率的貢獻。AHP法結(jié)合CRITIC法確定指標權(quán)重系數(shù)是比較可靠的方法。其中AHP法將不同指標之中任意兩個指標間的優(yōu)先信息進行了量化，在遵循中藥配伍原則的基礎(chǔ)上得到了偏向于主觀評價的權(quán)重系數(shù)，初步揭示了各指標的權(quán)重系數(shù)。CRITIC法以評價指標間的對比強度和沖突性為基礎(chǔ)，能夠反映各指標的客觀權(quán)重[5-6]。為保證各指標的權(quán)重準確性，將主觀指標與客觀指標相結(jié)合，計算綜合權(quán)重，工藝評價結(jié)果會更加客觀、真實，優(yōu)選的工藝更適于工業(yè)化生產(chǎn)。

3.2 正交試驗作為中藥提取優(yōu)選最常用的方法，是用部分試驗代替全面試驗，不能對各因素變化情況進行全面分析，當試驗因素和水平較多的情況下，試驗次數(shù)會成倍增加。利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的預測與推斷能力，通過建立某種簡單模型，運用自組織和實時學習的優(yōu)點，模擬中藥提取、純化、成型等工藝中各種因素的變化趨勢，分析數(shù)據(jù)間效應(yīng)、交互作用，獲得不同因素的最優(yōu)組合，節(jié)約研究時間與成本。本研究將正交試驗與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)結(jié)合，仿真優(yōu)化提取工藝條件，得到的工藝條件具有提取效率高、能耗低的優(yōu)點。