pH/酶雙重敏感腫瘤靶向遞藥體系的合成及應(yīng)用

王丁丁，南 軍，孫中洋，郭松巖，徐若男

(1.中國(guó)人民解放軍第73852部隊(duì)藥品器材供應(yīng)站，南京 210003；2.江蘇省軍區(qū)保障局，南京 210024；3.中國(guó)人民解放軍第四五四醫(yī)院骨科，南京 210002；4.中國(guó)人民解放軍第九二零醫(yī)院藥劑科，昆明 650000；5.南京軍區(qū)總醫(yī)院保健辦公室，南京 210000)

化療是目前臨床上治療癌癥的重要手段之一，但由于靶向性差、半衰期短、系統(tǒng)毒性大和靶部位累積差等問(wèn)題而受到制約[1-5]。聚合物納米藥物是穩(wěn)定的“載體-藥物”結(jié)構(gòu)，可通過(guò)腫瘤區(qū)域特有的高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect，EPR)被動(dòng)靶向至腫瘤組織或細(xì)胞，提高藥物在靶部位的累積，降低不良反應(yīng)[6-10]。但藥物與聚合物載體結(jié)合后，在靶部位釋放藥物緩慢、釋放率不穩(wěn)定等問(wèn)題丞待解決。

研究者通過(guò)設(shè)計(jì)出具有“刺激-響應(yīng)”功能的聚合物藥物用于克服上述缺點(diǎn)[11-12]。刺激響應(yīng)型聚合物藥物是指藥物通過(guò)可斷裂化學(xué)鍵與聚合物相連，利用內(nèi)源性[13-15]或外源性[16-19]刺激使藥物在靶部位可控釋放，實(shí)現(xiàn)提高藥物釋放率、迅速釋藥等目的。順式烏頭酸酐與伯胺反應(yīng)后形成順式烏頭酸鍵[20]。順式烏頭酸鍵中C-4位置上的羧基pH值在5.0～5.5可催化臨近位置上C-1羧基形成的酰胺鍵發(fā)生水解，因此被用于藥物胞內(nèi)晚期內(nèi)涵體和溶酶體釋放的研究。

本研究利用順式烏頭酸酐(CAA)修飾阿霉素(DOX)后得到具有酸敏功能的CA-DOX (CAD)，與親水性較強(qiáng)的4-arm PEG-COOH相連得到4-arm PEG-CAD并進(jìn)一步制得具有酸敏感功能的納米粒。文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞穿膜肽(transcriptional activator protein，TAT)中第4個(gè)賴(lài)氨酸在TAT發(fā)揮穿膜作用過(guò)程中發(fā)揮重要作用[21]，利用基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)敏感多肽GPLGIAGQ[15,22]修飾第4個(gè)賴(lài)氨酸可有效降低TAT的穿膜效率，使其獲得特異性。因此，本研究利用GPLGIAGQ修飾后的TAT連接至納米粒上，在正常環(huán)境中TAT不發(fā)揮穿膜作用；到達(dá)腫瘤區(qū)域后，在腫瘤微環(huán)境MMP2酶作用下使多肽斷裂，裸露TAT發(fā)揮穿膜作用。此外，研究順式烏頭酸鍵的斷裂效率，并對(duì)其理化性質(zhì)和體外抗腫瘤效率進(jìn)行研究。

1 儀器與試藥

1.1儀器 真空干燥箱(大連第四儀器廠)；JIKA磁力攪拌器(德國(guó)IKA公司)；EM-2000EX型透射電鏡(日本Hitachi公司)；激光粒度分析儀(英國(guó)Malven公司)；AVance DMX500核磁共振(Bruker公司)；ZYJ-L超凈細(xì)胞工作臺(tái)(張家口空氣凈化工程公司)；二氧化碳培養(yǎng)孵箱(美國(guó)Heareus公司)；激光共聚焦顯微鏡(美國(guó)奧林巴斯公司)；紫外分光光度計(jì)、高效液相色譜儀[安捷倫科技(中國(guó))有限公司]。

1.2試藥 阿霉素(DOX)、順式烏頭酸酐(CAA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和氘代二甲基亞砜(d-DMSO)，均購(gòu)自阿拉丁公司；MMP2敏感多肽連接TAT(GPLGIAGQ-TAT)購(gòu)自上海昶晰生物有限公司；4-arm PEG購(gòu)自西安瑞禧生物有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)液、96孔板、激光共聚焦培養(yǎng)皿、血清、胰蛋白酶、青鏈霉素、MTT試劑、細(xì)胞核染料DAPI等均購(gòu)自西安科昊生物有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、1-4-二氧六環(huán)、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸、十二烷基硫酸鈉、乙腈、甲醇等均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法

2.1CAD的合成 取一定量的CAA溶于1,4-二氧六環(huán)中，同時(shí)稱(chēng)取DOX·HCl溶于碳酸氫鈉溶液(0.4 mol·L-1)，混合，將pH值調(diào)節(jié)至8.5，冰浴反應(yīng)2 h，室溫反應(yīng)2 h。將pH值調(diào)節(jié)至4.5后出現(xiàn)大量沉淀，以12 000 r·min-1離心，棄去上清液，收集產(chǎn)物后真空干燥12 h后得到CAD。見(jiàn)圖1。

圖1 CAD的合成

Fig.1 Synthesis of CAD

2.2GPLGIAGQ-TAT-PEG-CAD的合成及納米粒GTPC的制備 合成過(guò)程見(jiàn)圖2。取CAD溶于DMSO中，加入EDC和NHS室溫反應(yīng)12 h活化羧基后加入4-arm PEG(nCAD∶nPEG=3∶1)，得到PEG-CAD，稱(chēng)取與PEG等摩爾比的GPLGIAGQ-TAT，加入反應(yīng)液，室溫反應(yīng)12 h后凍干得到GPLGIAGQ-TAT-PEG-CAD。將GPLGIAGQ-TAT-PEG-CAD溶于DMSO配制成質(zhì)量濃度為1.5 mg·mL-1的溶液，攪拌15 min后將溶液加入截留相對(duì)分子質(zhì)量為3.4 kDa的透析袋中，在去離子水中室溫透析48 h。透析結(jié)束后冷凍干燥得到淺紅色固體，即為納米粒GTPC。

2.3納米粒的粒徑測(cè)定 利用馬爾文粒度分析儀對(duì)納米粒的粒徑進(jìn)行測(cè)定；通過(guò)透射電鏡觀察納米粒的形貌。將納米粒溶于DMSO中配制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的溶液，超聲分散2次，每次15 s，取20 μL滴于銅網(wǎng)上，室溫風(fēng)干后置于透射電鏡下觀察其形態(tài)。

2.4納米粒的載藥率測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：將DOX溶于蒸餾水中，配制成一定質(zhì)量濃度的溶液，取6組DOX溶液并稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.5，0.8和1.0 μg·mL-1的溶液，于λ=488 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

精密稱(chēng)取10 mg GPLGIAGQ-TAT-PEG-CAD，溶于2 mol·L-1的鹽酸溶液中，加熱攪拌1 h使DOX充分?jǐn)嗔押笳{(diào)節(jié)pH值至中性，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DOX的含量，并利用公式測(cè)定載藥率。

聚合物中DOX的載藥率=聚合物中DOX的質(zhì)量÷聚合物的質(zhì)量×100%

圖2 GPLGIAGQ-TAT-PEG-CAD的合成及納米粒GTPC的制備

Fig.2 Synthesis of GPLGIAGQ-TAT-PEG-CAD and the self-assembly of the nanoparticles GTPC

2.5CAD酸敏特性測(cè)定 通過(guò)HPLC法測(cè)定CAD中順式烏頭酸鍵的斷裂效率來(lái)測(cè)定CAD的酸敏特性。稱(chēng)取5 mg CAD固體，溶于pH值為 5.0和7.4的PBS-檸檬酸緩沖液中，以120 r·min-1在37 ℃恒溫振蕩器中避光孵育，分別于0，4和8 h取樣，按照以下色譜條件進(jìn)行HPLC分析：色譜柱：Agilent 1260高效液相色譜儀；Diamonsil C18柱；流動(dòng)相：十二烷基硫酸鈉溶液-乙腈-甲醇(比例為47∶47∶6)；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。

2.6納米粒的模擬釋藥實(shí)驗(yàn) 納米粒的釋藥研究是利用動(dòng)態(tài)透析法進(jìn)行測(cè)定。模擬胞內(nèi)溶酶體環(huán)境(pH 5.5)、腫瘤細(xì)胞外微環(huán)境(pH 6.5)和正常組織環(huán)境(pH 7.4)測(cè)定納米粒的藥物釋放含量。稱(chēng)取6 mg 納米粒溶于3 mL對(duì)應(yīng)pH值的PBS緩沖液中，以100 mL對(duì)應(yīng)pH值的緩沖液為外液，置于恒溫?fù)u床中(120 r·min-1)模擬體內(nèi)溫度(37 ℃)，于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取出透析外液1 mL，并加入等量相同pH值的PBS緩沖液。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)量所取溶液中DOX的含量，得到藥物釋放曲線(xiàn)。

2.7GTPC的體外細(xì)胞毒性研究 膠束的體外毒性研究利用MTT試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。MDA-MB-231細(xì)胞作為受試細(xì)胞，區(qū)分有酶(質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1)和無(wú)酶情況，合成GTPD(不具備酸敏特異性釋藥的納米粒)作為對(duì)照組。

消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞至15 mL離心管中，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×104個(gè)·mL-1，向96孔板中每孔加入150 μL，培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁。移除培養(yǎng)液并加入不同質(zhì)量濃度的納米粒，每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔并設(shè)空白對(duì)照組，培養(yǎng)48 h后，向復(fù)孔中加入MTT溶液，用搖床低速振蕩10 min，置于孵箱中孵育4 h后加入DMSO溶解，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定復(fù)孔的吸光度值A(chǔ)。利用空白對(duì)照組的吸光度值比對(duì)計(jì)算細(xì)胞存活率。

利用細(xì)胞毒研究評(píng)價(jià)不含藥物載體的細(xì)胞毒性。消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞至離心管中，離心后加入新鮮培養(yǎng)液并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×104個(gè)·mL-1，向96孔板中每孔加入150 μL，培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁。移除培養(yǎng)液并加入質(zhì)量濃度分別為200，400，600，800和1 000 μg·mL-1的GPLGIAGQ-TAT-PEG，每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔并設(shè)空白對(duì)照組，培養(yǎng)48 h后，向復(fù)孔中加入MTT溶液，通過(guò)搖床低速振蕩10 min，置于孵箱中孵育4 h后加入DMSO溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定復(fù)孔的吸光度值。利用空白對(duì)照組的吸光度值比對(duì)計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.8GTPC的細(xì)胞內(nèi)攝研究 消化培養(yǎng)瓶中的MDA-MB-231細(xì)胞，加入新培養(yǎng)液后配制成濃度為1.0×105·mL-1的細(xì)胞懸液，并向每個(gè)激光共聚焦培養(yǎng)皿中加入700 μL，待細(xì)胞爬滿(mǎn)40%后移除培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)含有MMP2的GTPC、TPC的培養(yǎng)液質(zhì)量濃度和不含MMP2的GTPC、TPC培養(yǎng)液質(zhì)量濃度并加至培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)4 h，移除培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗2次，用質(zhì)量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛固定8 min，向培養(yǎng)皿中加入質(zhì)量濃度為5 μg·mL-1的DAPI染色液避光染色5 min，用PBS緩沖液沖洗2次，4 ℃避光保存。利用CLSM觀察DOX的入胞情況。DOX顯紅色，DAPI鏡下顯藍(lán)色熒光，HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染的GFP蛋白顯示為綠光。

3 結(jié)果

3.1納米粒的制備 納米粒的載藥率為22.6%，核磁共振氫譜表征GPLGIAGQ-TAT-PEG-CAD，表明其成功制備，其中1.0,1.2,2.9和3.9 ppm為T(mén)AT的特征峰，3.5 ppm為PEG的特征峰，7.0～8.0 ppm為DOX的特征峰，由于順式烏頭酸鍵含量相對(duì)其他組分較低，因此在核磁圖譜上未出現(xiàn)明顯特征峰。見(jiàn)圖3。

圖3 GPLGIAGQ-TAT-PEG-CAD的核磁共振氫譜(溶劑：DMSO)

注：a.PEG;b.TAT;c.GPLGIAGQ;d.DOX。

Fig.31H-NMR spectra of GPLGIAGQ-TAT-PEG-CAD (solvent:DMSO)

Note：a.PEG;b.TAT;c.GPLGIAGQ;d.DOX.

3.2納米粒的粒徑形貌表征 通過(guò)粒度分析儀測(cè)得納米粒水合粒徑為132.1 nm；透射電鏡可以看出GTPC的粒徑約為 90 nm。見(jiàn)圖4。

3.3CAD的酸敏特性 為了驗(yàn)證CAD的釋放產(chǎn)物，選用pH值為5.5和pH值為7.4來(lái)模擬腫瘤細(xì)胞內(nèi)晚期內(nèi)涵體及溶酶體酸環(huán)境和正常組織pH環(huán)境，通過(guò)HPLC法測(cè)定CAD斷裂后DOX的質(zhì)量濃度。游離DOX的特征峰在pH值為5.5時(shí)逐漸變高，說(shuō)明CAD在酸性pH值條件下水解速度明顯提高，1 h內(nèi)就有35.3%被水解從而釋放出DOX，6 h時(shí)釋放出85.2%，作為對(duì)比，在pH值為7.4時(shí)，24 h釋放的DOX低于15%，表明CAD能夠迅速響應(yīng)內(nèi)涵體/溶酶體酸性環(huán)境，使膠束中的DOX在進(jìn)入細(xì)胞之前保證相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，降低了DOX在體循環(huán)過(guò)程中泄露的風(fēng)險(xiǎn)，從而降低了DOX的不良反應(yīng)，提高了藥物的利用率及使用效率。見(jiàn)圖5。

圖4 納米粒GTPC的粒徑(A)及形態(tài)(B)

Fig.4 Particle size (A) and morphology (B) of nanoparticles GTPC

圖5 CAD在不同pH值情況下水解的HPLC圖譜

A.pH 7.4；B.pH 5.5。

Fig.5 The HPLC chromatograms of CAD hydrolysis in different pH

A.pH 7.4；B.pH 5.5.

3.4納米粒的藥物釋放研究 選用胞內(nèi)溶酶體環(huán)境(pH 5.5)、腫瘤細(xì)胞外微環(huán)境(pH 6.5)和正常組織環(huán)境(pH 7.4)對(duì)藥物的體外模擬釋放進(jìn)行測(cè)定。模擬釋藥曲線(xiàn)見(jiàn)圖6。隨著pH值的降低，GTPC的藥物釋放有明顯差異。pH值為6.5和7.4時(shí)藥物累積釋放量低于20%，pH值為5.5時(shí)累積釋放率明顯提高，達(dá)到88%。這是由于順式烏頭酸鍵pH值在5.0～5.5時(shí)可快速斷裂，釋放DOX。結(jié)合CAD斷裂研究，說(shuō)明在GTPC體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)過(guò)程中保持穩(wěn)定，入胞后在腫瘤微環(huán)境MMP2作用下脫去特異性多肽，裸露TAT并實(shí)現(xiàn)納米粒高效入胞，在溶酶體/內(nèi)涵體酸性環(huán)境下特異性釋放藥物，提高藥物利用率。

圖6 GPTC在不同pH值條件下的藥物釋放情況

Fig.6 Drug release of GTPC at different pH conditions

3.5細(xì)胞毒性研究 體外細(xì)胞毒研究選用MDA-MB-231細(xì)胞作為受試細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為有酶和無(wú)酶組，給藥GTPC和TPC后共培養(yǎng)48 h后測(cè)得結(jié)果見(jiàn)圖7，GTPC的IC50為1.77 μg·mL-1。這是由于GTPC到達(dá)腫瘤區(qū)域后，在MMP2作用下使TAT實(shí)現(xiàn)去屏蔽性能，發(fā)揮高效穿膜作用攜帶納米粒入胞，入胞后，隨著pH值的降低，酸敏順烏頭酸鍵實(shí)現(xiàn)特異性斷裂，促進(jìn)DOX的釋放進(jìn)而發(fā)揮藥效，IC50值與游離DOX的IC50值(1.52 μg·mL-1)無(wú)顯著性差異，說(shuō)明該體系可有效遞送DOX入胞并發(fā)揮作用。作為對(duì)比，未加MMP2的GTPC組的IC50值較高，由于多肽無(wú)法被裂解，TAT的穿膜能力被抑制，藥物從載體斷裂的效率較低，發(fā)揮抗腫瘤作用較差。

圖7 納米粒GTPC與MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)48 h的細(xì)胞存活率

A.有酶；B.無(wú)酶。

Fig.7 Cell viability of GTPC and MDA-MB-231 cells cultured for 48 h

A.with enzymes;B.without enzymes.

3.6細(xì)胞內(nèi)攝研究 通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察4組納米粒在MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，觀察給藥4 h后細(xì)胞對(duì)4組納米粒的內(nèi)攝情況，結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可知，在含有MMP2酶的培養(yǎng)液中，GTPC和TPC在給藥4 h后可在MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)觀察到明顯的DOX的熒光，這是由于短時(shí)間內(nèi)GTPC進(jìn)入到細(xì)胞后在酸性條件下順烏頭酸鍵斷裂釋放DOX入核。作為對(duì)比，在未加入MMP2的實(shí)驗(yàn)組中，DOX熒光較弱，這是由于連接在TAT第4個(gè)賴(lài)氨酸上的多肽并未被解離，TAT穿膜效率被大大降低，未能提高GTPC的入胞效率，DOX無(wú)法發(fā)揮作用。此外，TPC在無(wú)MMP2的情況下，MDA-MB-231細(xì)胞中也可觀察到DOX熒光，這是由于TAT未被屏蔽，可有效攜帶DOX入胞。

通過(guò)本研究表明，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中GTPC的細(xì)胞毒性最強(qiáng)，這是由于納米粒入胞后充分地發(fā)揮了連接DOX的酸敏鍵的特性，使DOX實(shí)現(xiàn)高效的胞內(nèi)釋藥，有效提高化療藥物的生物利用率，此外，在酶敏多肽的保護(hù)下，TAT在正常組織和體循環(huán)過(guò)程中的穿膜效率被有效降低，到達(dá)靶部位后，在腫瘤微環(huán)境特異性酶MMP2作用下迅速切斷多肽鏈，實(shí)現(xiàn)TAT的屏蔽/去屏蔽功能，提高了該遞藥體系的安全性。

圖8 MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)納米粒的細(xì)胞內(nèi)攝情況(DAPI為細(xì)胞核染料)

Fig.8 Confocal microscopic images of cellular internalization of the nanoparticles by MDA-MB-231 cells(DAPI was used to stain the cell nucleus)

4 結(jié)論

聚合物納米藥物載體通過(guò)負(fù)載抗腫瘤藥物后形成200 nm以下的納米粒，進(jìn)而通過(guò)體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)被動(dòng)靶向至腫瘤區(qū)域，利用腫瘤區(qū)域或胞內(nèi)與正常組織pH值、酶差異或外源性刺激特異性釋藥，可實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)藥效、降低毒性和不良反應(yīng)等目的，成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

本文通過(guò)化學(xué)合成的方法利用順式烏頭酸酐修飾DOX制備出具有酸敏感順式烏頭酸鍵的CA-DOX，與4-arm PEG相連后自組裝形成pH敏感納米粒，TAT作為提高穿膜效率的功能基團(tuán)引入納米粒，提高納米粒GTPC的入胞能力，通過(guò)MMP2敏感多肽修飾TAT發(fā)揮功能的氨基酸，實(shí)現(xiàn)TAT的選擇特異性。粒度分析儀測(cè)定水合粒徑為132.1 nm，TEM觀察到粒徑為90 nm；對(duì)pH敏感順式烏頭酸鍵的斷裂效率展開(kāi)重點(diǎn)研究，首先利用HPLC法測(cè)定CAD中DOX的斷裂效率，通過(guò)結(jié)論可知，pH值在5.5時(shí)4 h內(nèi)斷裂90%以上，進(jìn)一步通過(guò)釋藥研究可知，納米粒中DOX在pH值為5.5時(shí)釋藥超過(guò)85%，而pH值為7.4時(shí)釋藥不足20%。由體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)可知，具有酶敏特性的GTPC在有MMP2的情況下細(xì)胞毒接近未屏蔽TAT功能位點(diǎn)的TPC，而在無(wú)MMP2的情況下細(xì)胞毒性較弱，說(shuō)明MMP2敏感多肽可有效抑制TAT在正常環(huán)境下的穿膜效率；與不具備酸敏特性的納米粒GTPD比較，GTPC的細(xì)胞毒明顯提高，這是由于在胞內(nèi)溶酶體酸性條件下可以提高藥物釋放效率，使藥物更高效地作用于細(xì)胞核，進(jìn)而殺死細(xì)胞。此外，載體4-arm PEG可有效解決普通PEG可修飾端基少的缺點(diǎn)，提高載藥率，有利于腫瘤的治療。

本研究通過(guò)使用pH敏感順式烏頭酸鍵將藥物和聚合物載體連接制備納米粒，引入具有酶敏感功能的TAT提高納米粒的穿膜效率，構(gòu)建pH/酶雙重敏感納米釋藥體系，提高納米粒在體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)穩(wěn)定性和安全性，實(shí)現(xiàn)DOX靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的功能，并通過(guò)化學(xué)鍵連接藥物防止其在正常環(huán)境下泄漏，有利于提升抗腫瘤藥物的安全性，為治療腫瘤提供新的思路。