新型川芎嗪-香豆酸衍生物對擬腦缺血模型的形態(tài)保護作用

張欣鈺，郭文博，王 輝，吳高榮，薛南南，陳 萌，房 康，李國梁，王鵬龍，雷海民

(北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102)

腦缺血是由于大腦供血供氧不足所致的腦部缺血性壞死類疾病[1-3]。川芎-丹參作為臨床治療缺血性腦損傷的常用配伍單元，療效確切[4-6]。本課題組前期基于“中藥配伍-化藥拼合”原理[7]，以川芎-丹參藥對功效成分為拼合前體，設計、合成了系列結(jié)構(gòu)新穎的川芎嗪-酚酸類衍生物，均顯示一定的神經(jīng)保護活性，其中先導化合物T-CA (3，5，6-trimethylpyrazin-2-yl)methyl(E)-3-(4-((3，5，6-trimethylpyrazin-2-l)methoxy)phenyl)acrylate)對CoCl2誘導損傷的PC12細胞模型具有良好的保護作用(EC50=3.68 μmol·L-1，顯著優(yōu)于川芎嗪EC50=64.46 μmol·L-1)，并可有效抑制細胞凋亡[8-15]。本研究通過Giemsa染色、DAPI熒光染色、AO及AO/EB染色等方法[16]進一步觀察并確認T-CA對PC12細胞損傷模型的神經(jīng)細胞形態(tài)改善作用。

1 儀器與材料

1.1儀器 SPECTRO star nano酶標儀(德國BMG公司)；EC LIPSE Ti熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)。

1.2試藥 化合物T-CA(本課題組前期合成)，溶解于二甲基亞砜(DMSO)；RPMI-1640培養(yǎng)基、質(zhì)量濃度為2.5 g·L-1的胰蛋白酶-EDTA溶液、青鏈霉素雙抗溶液、磷酸鹽緩沖液(PBS)(北京拜爾迪生物科技有限公司)；胎牛血清、馬血清、神經(jīng)生長因子(NGF)(美國Thermo Fisher公司)；無水氯化鈷、二甲基亞砜、Giemsa染料、DAPI染料、AO試劑盒、AO/EB試劑盒、HE染料(北京百諾威生物科技有限公司)。

1.3動物 健康SD雄性大鼠(體質(zhì)量為280～300 g)(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)。

1.4細胞株 PC12細胞，購于北京協(xié)和細胞資源中心，使用含有體積分數(shù)為5%的胎牛血清及體積分數(shù)為10%馬血清的RPMI-1640培養(yǎng)基置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 實驗方法

2.1細胞培養(yǎng)及處理 將細胞分為4組：分化組、未分化組、損傷組和給藥組。取PC12細胞用RPMI-1640培養(yǎng)基(體積分數(shù)為1%雙抗+體積分數(shù)為5%胎牛血清+體積分數(shù)為10%馬血清)，培養(yǎng)于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱中。當細胞生長至對數(shù)期(狀態(tài)良好)時，應用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基饑餓12 h，收集細胞。分化組、損傷組及給藥組用RPMI-1640培養(yǎng)基(體積分數(shù)為1%雙抗+體積分數(shù)為10%胎牛血清)制得混懸細胞液，置于多聚賴氨酸包被的12孔板內(nèi)(每孔1 200 μL)，加入NGF誘導分化。未分化組使用含馬血清的培養(yǎng)基，且不加入NGF以抑制其分化。4組均培養(yǎng)48 h后，給藥組加入T-CA (60 μmol·L-1)預保護，其余3組加入等體積的培養(yǎng)液培養(yǎng)36 h，損傷組及給藥組加入CoCl2(300 μmol·L-1)損傷PC12細胞。造模12 h后，進行染色實驗。

2.2Giemsa染色觀察細胞形態(tài)變化 吸去12孔板中的上層細胞液，用PBS緩沖液清洗2～3次，加入冷乙醇固定細胞10 min。待細胞固定完全后，吸去多余固定液，使用PBS緩沖液清洗2～3次并加入適量Giemsa染液，染色5～10 min。吸去Giemsa染液，用PBS緩沖液清洗2～3次，置于100倍熒光倒置顯微鏡下觀察。

2.3DAPI染色觀察細胞形態(tài)變化 吸去上層細胞液，用PBS緩沖液清洗，加入低溫質(zhì)量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛溶液固定細胞10 min。待細胞固定完全后，吸去多余固定液，使用PBS緩沖液清洗2～3次并加入適量DAPI染液，避光染色5～10 min。吸去DAPI染液，用PBS緩沖液清洗2～3次，置于100倍熒光倒置顯微鏡下觀察，激發(fā)光為藍光。

2.4AO染色觀察細胞形態(tài)變化 吸去上層細胞液，用PBS緩沖液沖洗，加入PBS緩沖液1 mL后立刻加入質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的AO染液，避光染色1 min。置于100倍熒光倒置顯微鏡下觀察，激發(fā)光為綠光。

2.5AO/EB染色觀察細胞形態(tài)變化 吸去上層細胞液，用PBS緩沖液清洗，加入PBS緩沖液1 mL，依次加入質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的AO染液及EB染液。避光染色1 min，置于100倍熒光倒置顯微鏡下觀察，激發(fā)光為藍光。

2.6制備MCAO模型 參考文獻方法[17-18]：用體積分數(shù)為10%的水合氯醛腹腔注射麻醉健康SD大鼠，用體積分數(shù)為75%的酒精消毒后于頸部正中切口分離頸部動脈，結(jié)扎頸總動脈及頸外動脈。于頸內(nèi)處用動脈夾夾閉，頸外動脈近心端及遠心端結(jié)扎。作一切口于頸總動脈分叉處并松開動脈夾，于切口處插入光滑尼龍線。插入深度為18±0.5 mm時停止，留1 cm固定。假手術(shù)組僅暴露及分離，不進行結(jié)扎。參考Zea Longa評分法，于術(shù)后3 d進行評分：0分為無明顯神經(jīng)癥狀表現(xiàn)；1分為左側(cè)前爪不能完全伸展；2分為大鼠出現(xiàn)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)癥狀；3分為大鼠行走時出現(xiàn)向左側(cè)傾倒現(xiàn)象；4分為癲癇及昏迷不能自行行走。評分1～3分的大鼠入選實驗。

2.7分組與給藥 實驗包括假手術(shù)組、模型組及給藥組。將評分為1～3分的大鼠隨機分組至模型組及給藥組，分組結(jié)果為假手術(shù)組3只，模型組5只，給藥組4只。給藥組灌胃給藥T-CA (10 mL·kg-1) 10 d，其余2組給予等量羧甲基纖維素鈉溶液。

2.8取材 用體積分數(shù)為10%的水合氯醛麻醉后心臟取血，生理鹽水灌注，肝臟逐漸呈白色后改用質(zhì)量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛溶液灌注。大鼠僵硬后取大鼠腦組織并存于質(zhì)量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛溶液中。腦組織海馬區(qū)切片后進行HE染色。

3 結(jié)果

3.1Giemsa染色觀察T-CA對細胞形態(tài)的影響 鏡下觀察可見，未分化組PC12細胞狀態(tài)正常，細胞核形態(tài)完整、著色均勻、細胞有聚團現(xiàn)象，見圖1。NGF誘導分化組細胞邊緣出現(xiàn)神經(jīng)細胞突觸，突觸連接處有類似神經(jīng)節(jié)的節(jié)點。損傷組細胞神經(jīng)突觸出現(xiàn)變短或消失的情況，細胞核染色不均勻且細胞數(shù)量顯著減少。給藥組進行預保護后，細胞核染色較均勻，神經(jīng)突觸部分保留較好且細胞數(shù)量無明顯減少，見圖1。

3.2DAPI染色觀察T-CA對細胞形態(tài)的影響 鏡下觀察可見，未分化組與分化組細胞核呈均勻藍色狀態(tài)。損傷組細胞數(shù)量顯著減少，核著色高度凝聚。給藥組進行預保護后，細胞核染色較為均勻且細胞數(shù)量無明顯減少，見圖1。

3.3AO染色觀察T-CA對細胞形態(tài)的影響 鏡下觀察可見，丫啶橙染色綠色光激發(fā)后未分化組與分化組細胞核顯均勻黃綠色熒光。損傷組因細胞凋亡，黃綠色熒光聚集于核膜的內(nèi)側(cè)，細胞膜泡狀膨出。給藥組進行預保護后，細胞膜泡狀膨出情況明顯改善，見圖1。

圖1 T-CA對CoCl2損傷PC12細胞形態(tài)的影響

Ⅰ.Giemsa染色；Ⅱ.DAPI染色；Ⅲ.AO染色；Ⅳ.AO/EB染色；A.未分化PC12細胞；B.分化PC12細胞；C.CoCl2損傷PC12細胞；D.T-CA保護CoCl2損傷PC12細胞。

Fig.1 Effect of T-CA on PC12 cells insulted by CoCl2on morphology determined by Giemsa, DAPI, AO and AO/EB staining

Ⅰ.Giemsa staining；Ⅱ.DAPI staining；Ⅲ.AO staining；Ⅳ.AO/EB staining；A.undifferentiated PC12 cells；B.differentiated PC12 cells；C.CoCl2-insulted PC12 cells；D.CoCl2-insulted PC12 cells with T-CA.

3.4AO/EB染色觀察T-CA對細胞形態(tài)的影響 鏡下觀察可見，丫啶橙(AO)染料可進入未分化組及分化組正常細胞膜中呈黃綠色熒光。溴乙錠(EB)染料則進入受損細胞膜顯橘紅色熒光。損傷組細胞凋亡，細胞數(shù)量顯著減少，呈橘紅色染色狀態(tài)。給藥組進行預保護后，因改善細胞凋亡情況，多見黃綠色染色，見圖1。

3.5T-CA給藥對MCAO大鼠存活情況的影響 通過比較3組大鼠的存活情況，發(fā)現(xiàn)T-CA給藥組及假手術(shù)組大鼠無死亡情況，模型組2只大鼠死亡?？沙醪阶C明化合物T-CA可有效延長MCAO模型大鼠的生存時間，見表1。

3.6T-CA給藥對MCAO大鼠腦皮層神經(jīng)細胞的影響 鏡下觀察MCAO大鼠腦組織海馬區(qū)HE染色切片，分析T-CA對模型大鼠皮層神經(jīng)細胞的影響。假手術(shù)組(Sham)大腦皮層未見明顯的病理變化，其神經(jīng)細胞形態(tài)完整，細胞核仁清晰，細胞質(zhì)呈均勻染色；模型組(Model)海馬區(qū)神經(jīng)細胞大量壞死，細胞核輪廓模糊，胞漿溶解，部分微血管有栓塞情況；給藥組(T-CA)與模型組對比，組織壞死面積相對減少且程度較輕，細胞空泡范圍減少，形態(tài)較為完整，見圖2。

表1 給藥10 d后MCAO大鼠的存活情況

Tab.1 The survival rate of MCAO rats after T-CA administration for 10 d

組別總數(shù)/只存活數(shù)/只存活率/%假手術(shù)組44100模型組5360給藥組44100

圖2 MCAO大鼠腦組織海馬區(qū)HE染色

A.假手術(shù)組(×100);B.假手術(shù)組(×200);C.模型組(×100);D.模型組(×200);E.給藥組(×100);F.給藥組(×200)。

Fig.2 HE staining in the hippocampus of MCAO mice brain sections

A.sham group(×100)；B.sham group(×200);C.model group(×100);D.model group(×200);E.T-CA group(×100);F.T-CA group(×200).

4 討論

缺血性腦卒中是一類常見的心腦血管類疾病，中醫(yī)認為其屬于中風范疇，其發(fā)病機制是血脈瘀阻腦絡所致，臨床一般采用活血化瘀理氣藥治療[19-20]。川芎具有良好的活血行氣和祛風止痛的功能，常與丹參配伍使用治療此類疾病，其主要化學成分川芎嗪也被證明能夠有效減少腦缺血再灌注所造成的腦部神經(jīng)損傷[21-22]?；谥兴幣湮榕c化學藥物拼合原理，選取川芎嗪與香豆酸進行結(jié)構(gòu)拼合得到新型川芎嗪-香豆酸衍生物T-CA，并探討其對腦缺血損傷模型的保護作用。

PC12細胞模型是一種常用的神經(jīng)細胞株，經(jīng)NGF誘導后分化呈神經(jīng)元樣，有顯著的細胞突觸，可廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。本實驗使用CoCl2造模PC12細胞使形成擬腦缺血損傷的細胞模型，并評價化合物T-CA對其形態(tài)的保護作用。MCAO大鼠模型是常用的大腦中動脈缺血評價模型。本實驗采取Zea Longa法制備MCAO模型并評價化合物T-CA對大鼠存活率的改善情況。

實驗通過Giemsa、DAPI、AO和AO/EB 4種細胞染色方法，驗證了T-CA對CoCl2造模損傷的PC12細胞具有顯著的保護作用，能夠有效緩解損傷細胞的形態(tài)變化。同時，根據(jù)AO/EB染色結(jié)果可推斷新型川芎嗪-香豆酸衍生物T-CA可能是通過抑制PC12細胞凋亡而發(fā)揮作用，這也為后續(xù)的研究機制提供了方向。在MCAO模型實驗中，T-CA給藥組大鼠的存活率顯著高于模型組，并通過大鼠腦組織海馬區(qū)HE染色檢測缺血缺氧腦組織的神經(jīng)細胞形態(tài)特征。與模型組相比，給藥組神經(jīng)細胞壞死區(qū)域顯著減少，正常形態(tài)神經(jīng)元較多，胞漿溶解較少，能有效緩解腦缺血造成的神經(jīng)細胞凋亡。但大鼠樣本量較少，在后續(xù)的研究中需擴大樣本量進行深入研究。

實驗結(jié)果表明，新型川芎嗪-香豆酸衍生物T-CA能顯著改善CoCl2損傷PC12細胞所導致的形態(tài)改變，保持神經(jīng)細胞的形態(tài)完整性。同時，可提高MCAO模型大鼠的存活率并有效緩解大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)細胞的凋亡及壞死，保護了損傷神經(jīng)細胞的功能，為此類化合物的后續(xù)研究提供了參考依據(jù)。