淫羊藿和甘草配伍對(duì)淫羊藿主要化學(xué)成分的影響

聶 靜，陳素娟，高 歌，楊芊芊，韓晶晶，王艷娟，李 強(qiáng)*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；2.吉林紫鑫藥業(yè)股份有限公司，吉林 130022)

淫羊霍為多年生草本植物淫羊霍的地上部分，作為滋補(bǔ)類中藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，已有2 000多年的歷史。淫羊藿味辛、甘，性溫，歸肝、腎二經(jīng)，為補(bǔ)命門、益精氣、強(qiáng)筋骨、補(bǔ)腎壯陽之要藥[1]。淫羊藿的主要活性成分是以淫羊藿苷等為代表的異戊烯基取代黃酮苷類，但其水煎液提取率較低[2]。甘草為源自豆科的補(bǔ)益中草藥，能補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、緩急止痛、調(diào)和諸藥[3]，在藥物配伍中發(fā)揮著重要作用。甘草皂苷是甘草的主要活性成分，其具有表面活性劑的性質(zhì)，能在水溶液中形成膠束，具有增溶作用[4-6]。我國(guó)很多民間經(jīng)驗(yàn)方如補(bǔ)腎安神口服液和健陽片等均含有淫羊藿和甘草，但二藥配伍對(duì)淫羊藿苷等成分溶出量的影響目前研究較少。本文探討了淫羊藿和甘草以不同比例配伍煎煮時(shí)對(duì)淫羊藿所含淫羊藿苷等主要成分的影響[7-9]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀，包括四元泵、DAD檢測(cè)器、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱(美國(guó)Waters公司)；Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，廣州艾欣科學(xué)儀器有限公司；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；BT25S型電子分析天平(上海荊和分析儀器有限公司)；0.45 μm 微孔濾膜(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2試藥 淫羊藿苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院)；淫羊藿及甘草藥材(北京同仁堂藥店)，均符合《中國(guó)藥典》2015年版中藥用淫羊藿及甘草的規(guī)定[10]；乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher公司)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 應(yīng)用Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) 型色譜柱；水為流動(dòng)相 A，乙腈為流動(dòng)相B；流動(dòng)相:乙腈-水(30∶70)；在流速1.0 mL·min-1下進(jìn)行洗脫[11-14]；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：25 ℃。

2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品3.78 mg，置于 25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3供試品溶液的制備 分別稱取淫羊藿和甘草飲片，按照1∶0，6∶1，5∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，0∶1，1∶2，1∶3和1∶4的比例混合，每份均含淫羊藿10 g，置于燒瓶中，加10倍量純水浸泡 30 min 后，回流提取3次，每次1 h，合并提取液，濃縮并用水定容至100 mL量瓶中，分別得到11個(gè)樣品液。分別精密量取各樣品液 1 mL，置于11個(gè)10 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，用乙酸乙酯萃取3次，每次15 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜? mL，即得供試品溶液1～11[15]。

2.4淫羊藿苷的定性分析 分別取2.2項(xiàng)下制備的淫羊藿苷對(duì)照品溶液和2.3項(xiàng)下制備的供試品溶液1，注入液相色譜儀，測(cè)定并繪制其色譜圖，見圖1。由圖1可知，特征峰的保留時(shí)間一致(tR1=11.376 min，tR2=11.341 min)，且兩峰的形態(tài)相同，說明兩峰是同一物質(zhì)。

圖1 HPLC圖

A.淫羊藿苷對(duì)照品溶液;B.供試品溶液1；1.淫羊藿苷。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.icariin reference substance；B.sample solution 1；1.icariin.

2.5方法學(xué)考察

2.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密吸取2.2項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為4.03，12.09，24.18，48.36，96.72和193.44 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，各吸取10 μL，進(jìn)樣，依法測(cè)定,以峰面積值(y)對(duì)進(jìn)樣量(x)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=3 777.6x+25.991(r=0.999 9)，線性范圍為0.040 3～1.934 4 μg。

2.5.2精密度實(shí)驗(yàn) 取2.3項(xiàng)下制備的供試品溶液1，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次5 μL，計(jì)算淫羊藿苷峰面積的RSD值為0.72%，結(jié)果表明，該儀器精密度良好。

2.5.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.3項(xiàng)下制備的供試品溶液1，分別于制備后0，1，2，4，8，12和24 h進(jìn)樣分析，測(cè)定淫羊藿苷峰面積RSD值為1.27%，表明淫羊藿苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的淫羊藿0.1 g，6份，加入2.2項(xiàng)下制備的淫羊藿苷對(duì)照品溶液，按照2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果淫羊藿苷的平均回收率為98.04%，RSD值為2.49%。見表1。

表1 淫羊藿苷的加樣回收率測(cè)定結(jié)果

Tab.1 Results of icariin recovery test (n=6)

取樣量/g原有量/mg加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%0.103 00.618 00.154 50.770 698.7798.042.490.120 60.723 60.180 90.898 696.740.106 70.640 20.320 10.956 898.910.102 10.612 60.306 30.921 7100.910.110 30.661 80.496 41.139 496.210.104 90.629 40.472 11.091 597.82

2.6淫羊藿及其配伍甘草后淫羊藿苷的含量變化 分別精密吸取2.3項(xiàng)下制備的供試品溶液(1～11) 5 μL，注入高效液相色譜儀，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，所得圖譜共有10個(gè)共有峰，通過保留時(shí)間定性可知，7～10號(hào)峰組分來自淫羊藿(10號(hào)峰為淫羊藿苷)，3～6號(hào)峰組分來自甘草，1～2 號(hào)峰為淫羊藿與甘草的共有峰，色譜圖見圖2。

圖2 淫羊藿與甘草不同比例配伍的HPLC圖

1～10.特征峰；10.淫羊藿苷。

Fig.2 HPLC chromatogram ofEpimediumbrevicornuMaxim andGlycyrrhizaof different proportion compatibility

1-10.characteristic peaks;10.icariin.

由圖2可知，淫羊藿與甘草的配伍水煎液中各峰分離度較高、峰形較好、保留時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定，沒有新峰產(chǎn)生。其中相對(duì)峰面積為各水煎液中成分的峰面積除以淫羊藿單煎液中相對(duì)應(yīng)成分的峰面積。淫羊藿苷等成分相對(duì)峰面積與不同配伍比例間的關(guān)系見表2。由表2可知，與甘草配伍后，淫羊藿中8和10號(hào)峰組分含量總體增加較為明顯，7和9號(hào)峰組分含量變化較小。結(jié)果表明，淫羊藿與甘草配伍比例為5∶1時(shí)，淫羊藿中淫羊藿苷等成分含量增加最明顯，且此時(shí)淫羊藿苷的含量達(dá)到最大值，為6.701 mg·g-1。

表2 淫羊藿苷等成分相對(duì)峰面積與不同配伍比例間的關(guān)系

Tab.2 The relationship between the relative peak area of icariin and other components and different proportions

峰號(hào)成分tR/min不同配伍比例(淫羊藿∶甘草)中淫羊藿苷的相對(duì)峰面積1∶06∶15∶14∶13∶12∶11∶11∶21∶31∶47未知4.51.0001.0131.0201.0151.1171.0121.0091.0111.0071.0058未知8.41.0001.1061.1401.0961.0871.0721.0231.0331.0291.0189未知9.31.0001.0321.0261.0201.0161.0121.0100.9941.0071.00310淫羊藿苷11.31.0001.0941.1051.0971.0381.0241.0120.9981.0020.999

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究淫羊藿與甘草不同比例配伍對(duì)淫羊藿中主要化學(xué)成分含量變化的影響，實(shí)驗(yàn)采用HPLC法進(jìn)行測(cè)定，研究表明，淫羊藿與甘草配伍后并無新的化學(xué)物質(zhì)生成，僅化學(xué)成分的含量發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究了乙腈-1 mL·L-1磷酸、乙腈-水溶液、乙腈-2 mL·L-1冰醋酸，流速0.8和1.0 mL·min-1，柱溫20，25，30和35 ℃ 條件下的分離結(jié)果。結(jié)果顯示，乙腈-水溶液(70∶30)，流速為1.0 mL·min- 1，柱溫為25 ℃條件下分離效果最好。本次實(shí)驗(yàn)對(duì)方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性以及線性范圍和回收率均作了考察，結(jié)果符合方法學(xué)要求。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，淫羊藿苷具有促進(jìn)神經(jīng)突觸生長(zhǎng)、抵抗神經(jīng)元損傷、改善骨代謝、抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗抑郁和抗腫瘤等作用[16-17]。通過對(duì)比淫羊藿與甘草不同比例配伍前后的水煎液，結(jié)果表明，淫羊藿與甘草配伍后淫羊藿中所含淫羊藿苷等4種成分含量總體比單味淫羊藿中4種成分含量高，推斷可能是二藥配伍后甘草皂苷的增溶作用[18-19]增加了水煎液中淫羊藿苷等成分的溶解度。當(dāng)淫羊藿與甘草配伍比例為5∶1時(shí)更有利于淫羊藿苷成分的溶出，這一比例是淫羊藿和甘草藥材飲片的最佳配伍比例，對(duì)提高其生物利用度和療效等方面有重要作用。由于中藥配伍的復(fù)雜性,為了全面研究二藥的配伍關(guān)系,需深入考察。