HPLC法同時(shí)測(cè)定毛菊苣根和種子中7種化學(xué)成分的含量

駱旭東，楊建華，，張海波，，胡君萍*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830011)

菊苣來(lái)源于菊科植物菊苣屬的毛菊苣CichoriumglandulosumBoiss et Huet或菊苣CichoriumintybusL.的干燥地上部分及根?！吨袊?guó)藥典》記載菊苣具有清肝利膽、健胃消食和利尿消腫的功效，主治濕熱黃疸、胃痛食少和水腫尿少[1]。

毛菊苣主要分布在我國(guó)新疆維吾爾自治區(qū)南疆地區(qū)[2]，化學(xué)成分研究表明，毛菊苣中含有倍半萜、香豆素、黃酮、多糖及微量元素[3]。藥理研究表明，毛菊苣對(duì)非酒精性脂肪肝(NAFLD)有顯著療效[4]，對(duì)硫代乙酰基導(dǎo)致的大鼠肝纖維化具有保護(hù)作用[5]，能降低實(shí)驗(yàn)性1型糖尿病[6]的發(fā)病率，對(duì)傷寒沙門菌也具有一定的抗菌活性[7]。此外，毛菊苣還具有鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用[8]。不同于《中國(guó)藥典》記載，毛菊苣根和種子是維吾爾醫(yī)學(xué)的習(xí)用藥材[9]，不同比例毛菊苣根和種子的配伍常作為維吾爾傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的經(jīng)典保肝處方，如復(fù)方木尼孜其顆粒、護(hù)肝布祖熱顆粒和炎消迪娜爾糖漿等[10]。目前，有關(guān)新疆毛菊苣根和種子化學(xué)成分研究的文獻(xiàn)較少，本文擬建立同時(shí)測(cè)定毛菊苣根和種子中7種化學(xué)成分的HPLC含量測(cè)定方法，對(duì)不同來(lái)源的毛菊苣根和種子的含量進(jìn)行對(duì)比。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters Alliance 2695高效液相色譜儀，Waters 2487紫外檢測(cè)器，Empower色譜工作站(美國(guó)Waters公司)；Sartorius BP211D電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；UV2550紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；KQ-200VDB型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪BUCHI公司)；FJY1002-UVF基因研究型超純水機(jī)(青島富勒姆科技有限公司)；HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2試藥 菊苣酸對(duì)照品(批號(hào) MUST-17031720)和咖啡酸對(duì)照品(批號(hào) MUST-16060613)，均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所；綠原酸對(duì)照品(批號(hào) LH40M57)和秦皮甲素對(duì)照品(批號(hào) 287421)，均購(gòu)于百靈威科技有限公司；槲皮苷對(duì)照品(批號(hào)P01M8F30364)，購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；蘆丁對(duì)照品(批號(hào)100080-200707)，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；秦皮乙素對(duì)照品(批號(hào) 10128697)，購(gòu)于阿法埃莎(中國(guó))化學(xué)有限公司；乙腈為色譜純(SIGMA公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純。

藥材經(jīng)胡君萍教授鑒定為毛菊苣CichoriumglandulosumBoiss et Huet的干燥根及種子。具體信息見表1。

表1 藥材信息

Tab.1 Information of samples

序號(hào)收集地藥用部位批號(hào)S1新疆買提牙孜公司根20161112S2和田縣維吾爾醫(yī)院根20160704S3新疆買提牙孜公司種子20161112S4洛浦縣維吾爾醫(yī)院根20151202S5醫(yī)學(xué)故鄉(xiāng)藥店根20171219S6醫(yī)學(xué)故鄉(xiāng)藥店種子20171219S7埃塔爾藥店根20171219S8和田地區(qū)維吾爾醫(yī)院種子20151207S9洛浦縣維吾爾醫(yī)院種子20151202S10埃塔爾藥店種子20171219S11娜克蘭穆藥店種子20171219S12特比薩瓦普藥店根20171219S13麥迪森維藥公司種子20160417S14墨玉縣維吾爾醫(yī)院根20151201S15和田維吾爾藥材市場(chǎng)根20161228S16墨玉縣維吾爾醫(yī)院種子20151201S17和田縣維吾爾醫(yī)院種子20160704S18芒萊鄉(xiāng)大汗村根20161228S19芒萊鄉(xiāng)大汗村種子20161228S20和田維吾爾藥材市場(chǎng)種子20161228S21特比薩瓦普藥店種子20171219S22和田地區(qū)維吾爾醫(yī)院根20160706

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 Supersil ODS-B色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相：乙腈(A)-2 mL·L-1甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～16 min，10%A；16～17 min，10%A～17%A；17～36 min，17%A；36～37 min，17%A～10%A；37～42 min，10%A)。流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 mL。HPLC圖見圖1。

圖1 HPLC圖

A.混合對(duì)照品；B.毛菊苣根；C.毛菊苣種子；1.秦皮甲素；2.綠原酸；3.秦皮乙素；4.咖啡酸；5.蘆??；6.菊苣酸；7.槲皮苷。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.mixed reference substance;B.roots ofCichoriumglandulosum；C.seeds ofCichoriumglandulosum;1.aesculin；2.chlorogenic acid；3.aesculetin；4.caffeic acid；5.rutin；6.cichoric acid；7.quercetin.

2.2混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取秦皮甲素、綠原酸、秦皮乙素、咖啡酸、蘆丁、菊苣酸和槲皮苷對(duì)照品適量，置于同一10 mL量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，將上述7種化合物配制成質(zhì)量濃度分別為0.20，0.40，0.30，0.08，0.35，1.00和1.50 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3供試品溶液的制備 根據(jù)表1取毛菊苣根及種子(根S22批號(hào)20160706，種子S11批號(hào)20171219)粉碎，過40目篩。精密稱取粉末各10.0 g，置于具塞錐形瓶中，料液比為1∶25，加體積分?jǐn)?shù)為85%的甲醇溶液，于40 ℃超聲提取2次，每次20 min，過濾，濾液合并減壓濃縮，用體積分?jǐn)?shù)為85%的甲醇溶液定容至10 mL量瓶中，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，以綠原酸峰面積計(jì)算理論塔板數(shù)大于5 000，各色譜峰與相鄰峰的分離度均大于1.5。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1線性關(guān)系考察 精密量取2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和5.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到包括儲(chǔ)備液在內(nèi)的7個(gè)混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量為10 μL。按照2.1項(xiàng)下色譜條件操作，以峰面積值(y)對(duì)質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線性回歸，分別得到秦皮甲素、綠原酸、秦皮乙素、咖啡酸、蘆丁、菊苣酸和槲皮苷的線性回歸方程，結(jié)果見表2。

2.5.2定量限和檢測(cè)限 按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定稀釋后的混合對(duì)照品溶液，檢測(cè)限信噪比為3∶1，定量限信噪比為10∶1，分別測(cè)定檢測(cè)限和定量限。結(jié)果見表2。

表2 7種化學(xué)成分的回歸方程、線性范圍、檢測(cè)限和定量限

Tab.2 Regression equations，linear ranges,detection limits and quantitative limits of the 7 compounds

成分回歸方程r線性范圍/mg·mL-1檢測(cè)限/μg定量限/μg秦皮甲素y1=2×107x1-3 5820.999 60.010 0～0.200 03.2513.5綠原酸y2=3×107x2+93 8180.999 80.020 0～0.400 00.852.5秦皮乙素y3=1×107x3-5 195.90.999 60.015 0～0.300 01.203.5咖啡酸y4=8×107x4-21 4020.999 60.004 0～0.080 00.652.1蘆丁y5=7×106x5+49 7930.999 90.017 5～0.350 00.902.5菊苣酸y6=4×107x6-100 4750.999 80.050 0～1.000 01.103.8槲皮苷y7=2×107x7-420 1880.999 60.075 0～1.500 00.561.6

2.5.3精密度實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液10 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算各峰面積的RSD值分別為1.9%，1.6%，2.0%，1.4%，1.0%，1.9%和1.4%。結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.5.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取6份同批次的毛菊苣根(S22,批號(hào)20160706)，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別記錄秦皮甲素、綠原酸、秦皮乙素、咖啡酸、蘆丁、菊苣酸和槲皮苷的峰面積，計(jì)算各峰面積的RSD值分別為1.5%，1.5%，0.8%，1.1%，0.8%，1.5%和1.6%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.5.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，在室溫下放置0，2，4，8，12和24 h后，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算峰面積RSD值分別為1.8%，1.0%，1.8%，1.5%，1.1%，2.0%和0.9%。結(jié)果表明，樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.6加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取9份同批次已知含量的毛菊苣根(S22,批號(hào)20160706)，分別加入低、中和高質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定各供試品溶液中7種化學(xué)成分的峰面積，分別代入相應(yīng)的回歸方程，計(jì)算各供試品溶液中秦皮甲素、秦皮乙素、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、菊苣酸和槲皮苷的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.3 Results of recovery test (n=3)

成分取樣量/g樣品中量/mg加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%RSD/%秦皮甲素10.010.015 800.013 000.028 698.51.210.010.015 800.016 000.031 698.81.610.000.015 600.019 000.034 599.52.1秦皮乙素10.010.021 200.017 000.038 199.42.110.010.021 200.021 000.042 3100.51.010.000.021 000.025 000.046 4101.63.5綠原酸10.010.418 000.340 000.765 0102.10.310.010.418 000.410 000.829 0100.21.010.000.417 000.500 000.919 0100.41.4咖啡酸10.010.007 600.006 000.013 395.01.310.010.007 590.007 500.014 896.10.910.000.007 520.009 000.016 498.72.3蘆丁10.010.284 000.230 000.508 097.41.510.010.284 000.280 000.554 096.40.810.000.282 000.340 000.625 0100.92.2菊苣酸10.010.900 000.750 001.630 097.31.410.010.899 000.900 001.801 0100.22.310.000.893 001.100 001.989 0 99.61.6槲皮苷10.011.404 001.300 002.719 0101.20.410.011.404 001.400 002.768 097.41.710.001.400 001.500 002.928 0101.90.6

3 提取工藝優(yōu)化

3.1單因素分析

3.1.1料液比的考察 精密稱取毛菊苣根粉末5份(S22，批號(hào)20160706)，每份2.0 g，甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%，提取溫度為50 ℃，提取時(shí)間為20 min，超聲1次，料液比分別為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30，制備樣品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件平行測(cè)定7種化合物含量之和，測(cè)定3次，取平均值，結(jié)果表明，最優(yōu)的料液比為1∶25。

3.1.2甲醇體積分?jǐn)?shù)的考察 精密稱取毛菊苣根粉末5份(S22,批號(hào)20160706)，每份2.0 g，固定料液比為1∶25，提取溫度為50 ℃，超聲1次，提取時(shí)間為20 min，分別加入體積分?jǐn)?shù)為60%，70%，80%，90%和100%的甲醇，制備樣品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定7種化合物的含量之和，測(cè)定3次，取平均值，結(jié)果表明，最優(yōu)的甲醇體積分?jǐn)?shù)為90%。

3.1.3提取溫度的考察 精密稱取毛菊苣根粉末5份(S22，批號(hào)20160706)，每份2.0 g，固定料液比為1∶25，甲醇體積分?jǐn)?shù)為90%，提取時(shí)間為20 min，超聲1次，提取溫度分別為40，50，60，70和80 ℃，制備樣品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定7種化合物的含量之和，測(cè)定3次，取平均值，結(jié)果表明，最優(yōu)的提取溫度為40 ℃。

3.1.4提取時(shí)間的考察 精密稱取毛菊苣根粉末5份(S22，批號(hào)20160706)，每份2.0 g，固定料液比為1∶25，甲醇體積分?jǐn)?shù)為90%，超聲1次，提取溫度為40 ℃，提取時(shí)間分別為20，30，40，50和60 min，制備樣品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定7種化合物的含量之和，測(cè)定3次，取平均值，結(jié)果表明，最優(yōu)的提取時(shí)間為 20 min。

3.2正交實(shí)驗(yàn) 綜合以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取甲醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)和提取次數(shù)(D)作為考察對(duì)象，以7種化合物的含量之和作為考察指標(biāo)進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，直觀分析及方差分析。因素與水平見表4。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

表4 正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

Tab.4 The factors and levels of the orthogonal experiment (n=3)

水平因素A,甲醇體積分?jǐn)?shù)/%B,提取時(shí)間/minC,提取溫度/℃D,提取次數(shù)185153512902040239525453

表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.5 The results of the orthogonal experiment

實(shí)驗(yàn)編號(hào)因素A,甲醇體積分?jǐn)?shù)/%B,提取時(shí)間/minC,提取溫度/℃D,提取次數(shù)含量/mg·g-1111110.553 1212220.911 0313330.665 7421230.611 0522310.554 2623120.737 3731320.629 2832130.591 8933210.377 9K12.129 81.793 31.882 21.485 2K21.902 52.057 01.899 02.277 5K31.598 91.780 91.849 11.868 5R0.530 90.276 10.050 80.792 3SS0.047 30.016 20.000 40.104 7

由表5可知，RD>RA>RB>RC，故提取次數(shù)對(duì)7種化合物得率的影響最大，其次為甲醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取溫度。綜合直觀分析得出，最優(yōu)提取工藝為A1B2C2D2，即體積分?jǐn)?shù)為85%的甲醇，溫度為40 ℃，超聲提取2次，每次20 min。以提取溫度為誤差行列進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。

表6 方差分析結(jié)果

Tab.6 Results of variance analysis

因素SSfSFPA,甲醇體積分?jǐn)?shù)/%0.047 32.000 00.023 6106.702 3<0.01B,提取時(shí)間/min0.016 22.000 00.008 136.576 3<0.05C,提取溫度/℃0.000 42.000 00.000 21.000 0>0.05D,提取次數(shù)0.104 72.000 00.052 3236.102 2<0.01

由表6可知，提取次數(shù)、甲醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)7種化合物的總提取率影響顯著。

4 樣品含量的測(cè)定

分別取毛菊苣種子及根，按照3.2項(xiàng)下優(yōu)化出的提取工藝制備供試品溶液，進(jìn)樣量為10 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC色譜系統(tǒng)測(cè)定。分別記錄7種化合物的峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法計(jì)算各化合物的含量，測(cè)定結(jié)果見表7。

表7 含量測(cè)定結(jié)果

Tab.7 Results of content determination (mg·g-1，n=3)

序號(hào)秦皮甲素綠原酸秦皮乙素咖啡酸蘆丁菊苣酸槲皮苷總計(jì)S30.122 001.243 000.135 000.009 090.012 100.120 08.86910.51S60.031 301.250 000.076 000.017 100.027 000.128 010.81712.35S80.017 101.437 000.033 900.006 210.010 300.138 09.64011.28S90.016 401.125 000.076 300.009 310.022 600.148 09.83011.23S10-0.958 000.018 400.004 660.012 400.206 08.5309.73S110.251 000.700 000.520 000.017 800.092 800.337 05.2997.22S130.002 850.920 000.023 600.005 08-0.156 05.3305.49S160.008 781.390 000.061 600.010 100.020 800.101 012.20013.79S170.020 701.070 000.057 400.008 74-0.091 87.8407.93S190.015 901.190 000.047 500.009 910.024 100.050 411.35012.69S200.011 201.300 000.031 200.011 90-0.148 011.01011.16S210.019 801.110 000.088 300.008 520.027 100.160 09.90011.31S10.003 020.078 40-0.001 320.006 470.178 00.5910.78S20.003 290.099 800.002 250.001 960.009 080.196 00.7241.04S5-0.004 080.003 030.006 300.070 000.072 00.3220.48S70.001 380.028 60--0.007 160.165 00.1890.36S120.001 500.016 200.004 84-0.005 520.076 10.1750.26S140.028 100.032 800.090 400.012 700.034 600.641 01.2802.12S150.011 700.013 400.034 400.005 370.058 800.268 00.7871.18S180.001 700.041 10-0.001 360.012 300.053 70.4080.48S4-0.016 700.003 240.008 050.074 300.106 00.1480.36S220.001 580.041 200.002 200.000 800.028 900.090 00.1400.30

注：-表示未檢測(cè)到。

5 討論

本課題組前期采用HPLC法同時(shí)測(cè)定了毛菊苣中秦皮甲素、秦皮乙素、菊苣酸、山萵苣素和山萵苣苦素5種化合物的含量[11]。綠原酸具有顯著的抗氧化[12-13]、消炎、抗菌[14-15]和保肝[16]等作用;槲皮苷具有抗腫瘤[17]、抗氧化[18]和鎮(zhèn)靜催眠[19]等作用；蘆丁具有抗病毒[20]、抗氧化[21]和拮抗血小板活化因子[22]等作用；咖啡酸具有抗炎[23]、抗血小板聚集[24]和抗腫瘤[25-26]等作用。鑒于上述化合物豐富的藥理作用，本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定毛菊苣中秦皮甲素、綠原酸、秦皮乙素、咖啡酸、蘆丁、菊苣酸和槲皮苷7種化合物的HPLC法，該方法保留時(shí)間短(40 min內(nèi))，快速簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，適合于毛菊苣藥材的質(zhì)量控制。

采用單因素實(shí)驗(yàn)和L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了毛菊苣藥材中7種化合物的提取方法，分別對(duì)10批毛菊苣根和12批毛菊苣種子進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果顯示，毛菊苣根和毛菊苣種子中7種化合物含量差異較大，種子中化合物總含量是根中的13.4倍。毛菊苣種子中含量最大的為槲皮苷，占7種化合物總含量的86.3%，其次依次為綠原酸、菊苣酸、秦皮乙素、秦皮甲素、蘆丁和咖啡酸，含量分別為10.7%，1.4%，0.9%，0.4%，0.2%和0.1%。在毛菊苣根中槲皮苷含量最大，占7種化合物總含量的65.3%，其次依次為菊苣酸、綠原酸、蘆丁、秦皮乙素、秦皮甲素和咖啡酸，含量分別為24.8%，4.7%，2.1%，2.1%，0.8%和0.3%。毛菊苣種子中秦皮甲素、綠原酸、秦皮乙素、咖啡酸和槲皮苷的含量分別是根中的8.2，30.7，7.0，2.4和19.4倍。

《中國(guó)藥典》2015年版收載的菊苣及毛菊苣的藥用部位為根及全草，未收載種子入藥，而維吾爾醫(yī)學(xué)中常采用毛菊苣的根和種子及其藥對(duì)，如護(hù)肝布祖熱顆粒、炎消迪娜爾糖漿和復(fù)方木尼孜其顆粒等，前期研究顯示，毛菊苣根中的主要成分為山萵苣素和山萵苣苦素[11]，結(jié)合本文研究結(jié)果，毛菊苣種子中7種有效成分總含量明顯高于根中的總含量，說(shuō)明維吾爾醫(yī)使用毛菊苣種子及種子-根藥對(duì)具有一定的科學(xué)性，但還需結(jié)合藥效實(shí)驗(yàn)深入分析。本實(shí)驗(yàn)可為毛菊苣藥用部位的開發(fā)和維吾爾復(fù)方研究提供理論依據(jù)。