高級別生物安全實驗室的化學淋浴系統(tǒng)運行參數(shù)及消毒效果研究

佟海龍，王 棟，孫百明，邢國華，吳新洲，關云濤，卜云婷，趙春暉，曹國慶，周 琦*

（1.中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，哈爾濱 150001；2.中國建筑科學研究院有限公司，北京 100013）

0 引言

化學淋浴系統(tǒng)是防止高致病性微生物逃逸，保障實驗人員安全進出高級別生物安全實驗室必備的設施。目前，我國現(xiàn)有的高級別生物安全實驗室的化學淋浴設備均由德國和法國引進，但我國高等級生物安全實驗室中進口化學淋浴系統(tǒng)的運行參數(shù)一直沒有統(tǒng)一的標準。若實驗人員進出化學淋浴系統(tǒng)時，無法防止高致病性微生物被帶出實驗室，則可能對環(huán)境和實驗人員造成嚴重的二次污染，后果將不堪設想。因此，化學淋浴系統(tǒng)的運行參數(shù)和消毒效果十分重要。我國現(xiàn)有的高級別生物安全實驗室基本處于試運行狀態(tài)，在高級別生物安全實驗室正式運行前，確定化學淋浴系統(tǒng)的沖洗水壓、沖洗時間及消毒液濃度和種類等運行參數(shù)至關重要。本文通過對化學淋浴系統(tǒng)消毒效果的驗證，確定化學淋浴系統(tǒng)的最佳運行參數(shù)，確保其安全可靠地運行。

1 化學淋浴系統(tǒng)介紹

1.1 化學淋浴系統(tǒng)的組成

（1）淋浴系統(tǒng)：箱體，兩樘充氣式密閉門，22個噴淋頭，4個生命支持系統(tǒng)的配氣接頭，送、排風接口（含高效過濾器），控制開關和電子壓差傳感器，緊急淋浴系統(tǒng)，2個消毒口，照明系統(tǒng)及2個控制面板。

（2）加藥系統(tǒng)：2個化學加藥罐（1 000 L），一個原液罐（200 L），每個罐體配超聲波傳感器2套；氣動泵和阻尼器各2臺；壓縮空氣管道、噴消毒液管道、軟化水的補水和噴水管道均設置止回閥，各管道的閉合均由電磁閥進行控制。

1.2 化學淋浴系統(tǒng)的結構要求

化學淋浴系統(tǒng)箱體的空間和構成應滿足2名實驗人員同時進行淋浴操作，噴淋頭的布局應全方位無死角覆蓋整個箱體表面，生命支持系統(tǒng)管道的配送接頭不少于2個，箱體的氣密性應滿足在-500 Pa壓力下20 min內衰減壓力小于-250 Pa[1-2]；充氣式密閉門應帶可視窗口，并配有2條伸縮性及耐腐蝕性能較好的密封膠條；箱體內應設電子壓差傳感器和控制開關，當實驗室核心區(qū)和箱體內壓差異常時，應具備報警功能；應配有緊急淋浴系統(tǒng)，并配備控制緊急噴淋的手動閥門；箱體的送排風管道均設高效過濾器，高效過濾器需經打壓合格、檢漏合格后方可使用；箱體最低位置設置氣密性地漏，地漏上端布置格柵板，應至少高出氣密性地漏上表面5 cm。

化學加藥罐和原液罐的容量應滿足噴淋的使用要求，液位過高或過低應設置報警系統(tǒng)。

1.3 化學淋浴系統(tǒng)的材質

化學淋浴系統(tǒng)的關鍵部件（電磁閥、管道、箱體、噴淋頭等）應耐化學腐蝕、耐高溫、氣密性好，宜采用316L不銹鋼材質；所有邊角應整齊，金屬配件和連接件都氣密焊接到不銹鋼內殼上，所有安裝應保證箱體的氣密性。承載消毒液的原液罐和加藥罐的耐化學腐蝕性能應滿足要求；不銹鋼管道的管壁厚度應符合要求，箱體內部的管道連接方式應為焊接，并經打壓測試后方可使用。

1.4 化學淋浴系統(tǒng)的消毒流程

（1）化學淋浴系統(tǒng)人員消毒流程：實驗人員進出化學淋浴系統(tǒng)需對正壓防護服進行消毒，理論上沖洗時間越長消毒越徹底，但實驗人員長時間停留在密閉空間會導致身體不適及心理恐慌。因此，應當確定適當?shù)南玖鞒虝r間來解決上述問題。整個流程包括噴消毒液、反應暴露、水沖洗、地漏開啟和充氣吹干。

（2）化學淋浴系統(tǒng)箱體消毒流程：人員較多時，應分批次進入化學淋浴系統(tǒng)。當?shù)谝慌藛T通過化學淋浴系統(tǒng)進入實驗室后，由于化學淋浴系統(tǒng)與實驗室短暫相通易造成污染，所以應對化學淋浴系統(tǒng)箱體進行消毒，合格后第二批人員方可進入。整個流程包括噴消毒液、反應暴露和地漏開啟。

2 化學淋浴系統(tǒng)的消毒效果驗證

化學淋浴系統(tǒng)主要用于對安全防護服進行清洗消毒，消毒效果直接關系到實驗室工作人員的人身安全、整個生物安全實驗室的運行安全以及對周圍環(huán)境的影響。以下采用目檢法和生物檢測法進行驗證。

2.1 目檢法

通過目檢法可以初步判斷正壓防護服表面的清洗效果，觀察化學淋浴系統(tǒng)內噴淋頭的噴射范圍和噴射壓力是否滿足要求，具體參照下述流程[3]：

（1）配制維生素B2標準溶液（10.0 mg/ml）并將其保存在棕色瓶中，置于陰涼處備用。

（2）正壓防護服的外表面采用配制好的維生素B2標準溶液噴灑，應全面均勻，噴灑后可采用430～440 nm波長的藍光照射，此時整個防護服表面應均有綠色熒光。

（3）實驗人員穿著正壓防護服進入化學淋浴系統(tǒng)進行噴水實驗測試，用以確定合適的噴水水壓和沖洗時間。

（4）噴水程序結束后，采用430～440 nm波長的藍光照射，此時正壓防護服表面不應出現(xiàn)熒光反應，如仍然發(fā)現(xiàn)黃綠色光斑，說明清洗效果不佳，需增加壓力或沖洗時間。若正壓防護服表面沒有發(fā)現(xiàn)熒光反應，則說明化學淋浴系統(tǒng)的壓力以及沖洗時間基本符合需求。以此來確定此階段化學淋浴的最佳沖洗水壓和沖洗時間。

正常情況下，實驗室軟化水供水管的供水壓力為0.4 MPa，單向閥和電磁閥及管道的水頭損失在0.2 MPa，剩余壓力為沖洗水壓即0.2 MPa。由于損失較大，化學淋浴系統(tǒng)噴射范圍和噴射壓力較小，所以需要增大沖洗水壓，額外增加的壓力通過供水電磁閥和增壓水泵聯(lián)動控制來實現(xiàn)。

經目檢法試驗后，可知沖洗水壓為0.2 MPa時，沖洗時間為20min；沖洗水壓為0.3MPa時，沖洗時間為18min；沖洗水壓為0.4MPa時，沖洗時間為14 min；沖洗水壓為0.5 MPa時，沖洗時間為9 min；沖洗水壓為0.6MPa時，沖洗時間為3 min；沖洗水壓為0.7 MPa時，沖洗時間為2.5 min。由此可以得出化學淋浴系統(tǒng)隨著沖洗水壓的升高，沖掉維生素B2所需要的沖洗時間越短，當壓力增加至0.7 MPa時，沖洗干凈所需要的時間為2.5 min，與沖洗水壓為0.6 MPa的沖洗水壓相比，時間上并沒有明顯優(yōu)勢，且增加了管道的壓力負荷。故本文選用0.6 MPa的沖洗水壓，將正壓防護服表面沖洗干凈所需要的沖洗時間為3 min。

2.2 生物檢測法

2.2.1 試驗材料的選用和制備

培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基。

試驗菌株：采用枯草桿菌黑色變種芽孢作為陽性對照組，檢測菌量為5×106cfu/ml，將枯草桿菌黑色變種芽孢（ATCC 9372）按照細菌芽孢制備程序，培養(yǎng)制備成芽孢懸液。分別取各菌懸液1 ml，滴染于無菌不銹鋼載體片（5.00 cm×5.00 cm）上，干燥后制成菌片備用[4]。以含1 g/L甘氨酸+0.3 g/L卵磷脂+3 g/L吐溫80的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）作為中和劑。

消毒液：濃度分別為3、9、18 g/L的醫(yī)院級戊二醛消毒液。

2.2.2 中和劑鑒定試驗

經中和劑鑒定試驗，觀察中和劑對測試消毒劑是否有良好的中和作用，對試驗菌及其恢復期培養(yǎng)是否有害或有不良影響[5]。具體試驗分組如下：

第1組：消毒劑+菌懸液培養(yǎng)，觀察消毒劑對試驗菌有無殺滅或抑制能力。

第2組：（消毒劑+菌懸液）+中和劑培養(yǎng)，觀察殘留消毒劑中和后試驗菌能否恢復生長。

第3組：中和劑+菌懸液培養(yǎng)，觀察中和劑是否抑菌。

第4組：（消毒劑+中和劑）+菌懸液培養(yǎng)，觀察中和產物或未被完全中和的殘留消毒劑對試驗菌生長有無抑制作用。

第5組：PBS+菌懸液培養(yǎng)，作為菌數(shù)對照。

第6組：PBS+中和劑+培養(yǎng)基培養(yǎng)，作為陰性對照。取1 ml分別置入2個平皿，然后倒入相應的培養(yǎng)基培養(yǎng)，不得有菌生長。

試驗表明，以含1 g/L甘氨酸+0.3 g/L卵磷脂+3 g/L吐溫80的PBS作為中和劑，可有效中和3 g/L醫(yī)院級戊二醛消毒液對枯草桿菌黑色變種芽孢的殘留毒性。上述中和劑及其產物對試驗菌和培養(yǎng)基均無不良影響，符合中和劑鑒定試驗要求[6]。

2.2.3 淋浴沖洗試驗

在正壓防護服的頭頂、后腦、額頭、胸前（左、右）、背（上、下）、腋下（左、右）、褲襠下以及腳下（左、右）布菌，并進行取樣、接種、培養(yǎng)、計數(shù)等。具體按照《消毒技術規(guī)范》2.2.10進行試驗[7]。

設置化學淋浴系統(tǒng)實驗人員消毒流程：噴消毒液時間2 min，反應暴露時間1 min，沖洗水壓0.6 MPa，水沖洗時間3 min，地漏開啟時間30 s，充氣吹干時間2 min，整個流程8 min。使用濃度為3 g/L醫(yī)院級戊二醛消毒液對正壓防護服表面進行消毒[8]。以上操作獲得數(shù)據(jù)作為陰性對照。將本次試驗未用完的同批次中和劑溶液、稀釋液、棉拭、培養(yǎng)基等分別用于陽性對照。結果見表1。

表1 淋浴沖洗試驗結果

從表1中可以看出，正壓防護服表面的12個布菌位置經過完整的化學淋浴流程后，滅菌對數(shù)值均≥3.00，符合CNAS-CL53：2016《實驗室生物安全認可準則對關鍵防護設備評價的應用說明》的要求，說明化學淋浴消毒效果滿足要求。由于化學淋浴流程既包括噴消毒液2 min及反應暴露時間1 min，又包括水沖洗3 min，因此，經過化學淋浴流程后測定的滅菌對數(shù)值是消毒液和水沖洗共同作用下的結果，無法確定到底是哪一流程起主導作用，故需要進行定性殺菌試驗，來進一步確定化學淋浴去除病原微生物的主要機理。

2.2.4 定性殺菌試驗

設置化學淋浴系統(tǒng)箱體消毒流程：噴消毒液時間 2 min，反應暴露時間調整為 3、8、28、58 min，地漏開啟時間30 s，采用濃度分別為3、9、18 g/L醫(yī)院級戊二醛消毒液對枯草桿菌黑色變種芽孢的滅殺效果進行正交試驗，取樣、接種、培養(yǎng)、計數(shù)方法均參照淋浴沖洗試驗。定性殺菌試驗結果見表2。

表2 定性殺菌試驗結果

由表2可以看出，以3 g/L的醫(yī)院級戊二醛消毒液為例，隨著作用時間的增加，滅殺對數(shù)值逐漸增加，在作用時間為60 min時，滅殺對數(shù)值＞3.00。而采用18 g/L醫(yī)院級戊二醛消毒液對枯草桿菌黑色變種芽孢進行滅殺，僅需要5 min即可使滅殺對數(shù)值＞3.00。結果表明，醫(yī)院級戊二醛消毒液濃度越高，滅菌合格所需時間越短。而采用濃度為3 g/L醫(yī)院級戊二醛消毒液作用5 min，滅殺對數(shù)值＜3.00，滅菌不合格。

3 化學淋浴系統(tǒng)的運行參數(shù)

在保證消毒效果合格的前提下，確定最佳的運行參數(shù)不僅能縮短淋浴時間、減少人員的不適，還能節(jié)約能源。化學淋浴系統(tǒng)的運行參數(shù)主要包括噴消毒液時間、反應暴露時間、水沖洗時間、沖洗水壓和消毒液種類及濃度等。通過目檢法，確定沖洗水壓為0.6 MPa，沖洗時間為3 min。通過生物檢測法中的淋浴沖洗試驗和定性殺菌試驗，可以得出實驗人員消毒主要依靠水沖洗作用使正壓防護服表面滅菌合格，箱體消毒主要依靠消毒液的作用使化學淋浴系統(tǒng)箱體滅菌合格。由此，化學淋浴系統(tǒng)運行參數(shù)可參照以下數(shù)值進行設置：

（1）實驗人員消毒流程：參數(shù)設置為沖洗水壓0.6 MPa，沖洗時間3 min，噴消毒液時間2 min，反應暴露時間1 min，地漏開啟時間30 s，充氣吹干時間2 min，消毒液為醫(yī)院級戊二醛，濃度為3 g/L。

（2）箱體消毒流程：參數(shù)設置為噴消毒液時間2 min，反應暴露時間58min，消毒液為醫(yī)院級戊二醛，濃度為3 g/L；或噴消毒液時間2 min，反應暴露時間3 min，消毒液為醫(yī)院級戊二醛，濃度為18 g/L。

本試驗采用醫(yī)院級戊二醛作為化學淋浴系統(tǒng)的消毒液，雖然滅菌效果較好，但由于戊二醛消毒液帶有刺激性氣味，在加藥過程中對眼睛、皮膚有強烈的刺激作用[9]，建議選用過氧化氫、復合生物消毒劑等[10-11]對皮膚刺激性較小且滅菌效果較好的消毒液。另外，建議選用不同菌種及相應的消毒液（如過氧化氫、復合生物消毒劑等[10-11]）進行多次試驗，確定不同消毒液的濃度、作用時間等參數(shù)對不同病原微生物的滅菌效果，以確?；瘜W淋浴系統(tǒng)在運行過程中充分保證滅菌效果，避免造成高致病性病原微生物的泄漏。

4 結論

本文在保證化學淋浴系統(tǒng)消毒效果合格的前提下，確定了化學淋浴系統(tǒng)的最佳運行參數(shù)。通過確定化學淋浴系統(tǒng)軟化水的沖洗水壓使化學淋浴系統(tǒng)充分發(fā)揮其功能；在確定化學淋浴系統(tǒng)沖洗水壓和沖洗時間的基礎上，進一步選用枯草桿菌黑色變種芽孢作為生物指示劑，選用戊二醛作為化學淋浴系統(tǒng)的消毒液進行化學淋浴系統(tǒng)消毒效果驗證。得出的結論為：實驗人員消毒流程主要是依靠化學淋浴系統(tǒng)的水沖洗作用完成，而箱體消毒流程主要是依靠消毒液的滅殺作用完成。但是本文僅針對單一的生物指示劑和特定的消毒液對化學淋浴系統(tǒng)進行驗證，而高級別生物安全實驗室內往往操作不同的病原微生物，應對不同類型的病原微生物進行有針對性的消毒效果驗證；且應盡可能選用一種通用的消毒液，能夠針對不同病原微生物均達到滅菌效果，這樣不但可以避免經常更換消毒液，而且能夠保證化學淋浴系統(tǒng)在運行過程中的安全性。