麻痹性貝類毒素GTX1&4和GTX2&3標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備技術(shù)

郭萌萌，彭吉星，吳海燕，鄭關(guān)超，姚琳，翟毓秀，譚志軍

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點實驗室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071)

麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish poisons，PSPs)是一類以石房蛤毒素為基本骨架，具有不同取代基的衍生化合物(分子結(jié)構(gòu)見圖1)[1]，其被認(rèn)為是危害最嚴(yán)重、分布最廣的海洋生物毒素之一。根據(jù)PSPs 的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，主要可分為4類化合物：氨基甲酸酯類毒素、N-磺酰胺甲?；惗舅?、脫氨甲?；惗舅睾兔撗趺摪奔柞；惗舅豙2]，根據(jù)R基團(tuán)的不同，部分PSP的分類情況見表1。因PSPs屬于高毒性的神經(jīng)毒素，具不可預(yù)見性且在全球廣泛分布，多次引發(fā)消費者中毒甚至死亡事件。因此，歐盟、美國、加拿大等多個國家或地區(qū)對其制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)(800 μg STX eq./kg)并加以監(jiān)控，PSPs已成為海產(chǎn)貝類國際貿(mào)易的主要限制對象[3]。毒素檢測技術(shù)作為監(jiān)控的必要手段，近年來得到了迅速發(fā)展，但很多檢測方法因標(biāo)準(zhǔn)樣品的匱乏而限制了應(yīng)用范圍。

貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備是保障貝類質(zhì)量安全的基礎(chǔ)。國際上，以加拿大國家海洋研究所為首的科研機(jī)構(gòu)致力于貝類毒素有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研發(fā)，目前已經(jīng)建立了較為完善的貝類毒素分離純化方法，并研制出20余種貝類毒素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[4]，但由于對商業(yè)機(jī)密的保護(hù)，有關(guān)PSPs分離純化的詳細(xì)方法少有公開。近年來，中國已建立并完善了多種PSPs的檢測方法，如小鼠生物法[5-7]、免疫分析法[8-10]、細(xì)胞毒性檢測法[11-12]及理化分析方法[13-15]等。但這些方法均需要標(biāo)準(zhǔn)樣品來定量和定性，同時需要質(zhì)控樣品對檢測方法進(jìn)行質(zhì)量控制。目前中國市場中尚無自主研發(fā)的PSPs標(biāo)準(zhǔn)樣品，在相關(guān)檢測與科研工作中使用的PSPs標(biāo)準(zhǔn)樣品均購自加拿大國家海洋研究所，不僅存在到貨周期長、受出入境嚴(yán)格限制等問題，且無法保證運輸過程中樣品的穩(wěn)定性，因而給PSPs的分析與檢測工作帶來很多困難。本研究以有毒貽貝為原料，制備了一種PSPs標(biāo)準(zhǔn)樣品，該標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻、穩(wěn)定、易稀釋和儲存，可作為標(biāo)準(zhǔn)溶液用于麻痹性貝類毒素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析及質(zhì)量控制，對確保食品安全及貝類產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有積極意義。

圖1 麻痹性貝類毒素(PSPs)的分子結(jié)構(gòu)[1]Fig.1 Molecular structure of paralytic shellfish poisons[1]

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

1.1.1 實驗儀器

主要包括：AB 5500 QTRAP液相色譜-四極桿/離子阱復(fù)合質(zhì)譜(美國AB SCIEX公司)，配有電噴霧離子源(ESI)；Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)及Dionex UltiMate 3000超高效液相色譜系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司)；Waters e2695高效液相色譜儀，配有光電二極管陣列檢測器；T18 basic均質(zhì)機(jī)(德國IKA公司)；XW-80A旋渦混合器(上海醫(yī)大儀器廠)； Himac CR 22GⅡ高速離心機(jī)(日立Hitachi公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)；固相萃取裝置(美國Supelco公司)；恒溫水浴鍋(上海藍(lán)凱儀器儀表有限公司)；BSZ-100自動餾分收集器(上海滬西分析儀器廠有限公司)；石墨化碳黑固相萃取柱(ENVI-CarbTM，250 mg/3 mL，美國Supelco公司)；Sephadex LH20羥丙基葡聚糖凝膠(美國GE Healthcare公司)。

1.1.2 實驗試劑

PSPs標(biāo)準(zhǔn)溶液購自于加拿大國家海洋研究所，其包括膝溝藻毒素GTX1>X4和GTX2>X3。甲醇、乙腈(HPLC級，美國Merk公司)；甲酸、乙酸銨(HPLC級，瑞士Fluka公司)；超純水(18.2 MΩ. cm)；其他未作特殊說明的試劑均為分析純。

表1 麻痹性貝類毒素的分類Tab.1 The classification of paralyticshellfish poisons (PSPs)

1.1.3 實驗材料

有毒貽貝(Mytilusedulis)樣品于2017年4～7月份采自河北省秦皇島某海域。用清水將貝殼外表洗凈，切斷閉殼肌，用蒸餾水淋洗，小心取出貝肉，勿切破貝體，在篩子上平鋪瀝水5 min，然后將貝肉采用組織均質(zhì)器以12 000 r/min進(jìn)行均質(zhì)、混勻。

1.2 分析方法

參考文獻(xiàn)[5]的方法，麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值分析、均勻性檢驗和穩(wěn)定性檢驗均采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法。

液相色譜條件：TSK Amide-80(3 μm，2.0 mm×150.0 mm)；柱溫40 °C；流速0.35 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。流動相A為水(含2 mmol/L甲酸銨，50 mmol/L甲酸)，B為95%乙腈水溶液(含2 mmol/L甲酸銨，50 mmol/L甲酸)。洗脫梯度為0～3.0 min，20% A，80% B；3.1～5.0 min，20%～60% A，80%～40% B；5.1～10.0 min，60%A，40% B；10.1～11.0 min，60%～20% A，40%～80% B；11.1～13.0 min，20% A，80% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)負(fù)離子掃描模式；噴霧電壓為-4.5 kV；離子源溫度550 ℃；碰撞氣壓力Medium；氣簾氣壓力30 psi；霧化氣壓力GS1為50 psi；輔助加熱氣壓力GS2為50 psi。其他參數(shù)見表2。

表2 麻痹性貝類毒素的質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 The mass spectrometry parameters ofparalytic shellfish poisons (PSPs)

注：定量測定時選擇子離子豐度較高且無干擾的子離子作為定量離子。

所有數(shù)據(jù)處理采用軟件SPSS 19.0(美國IBM公司)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

1.3.1 提取

于每100 g貝肉中加入1%乙酸溶液100 mL，旋渦60 s，再置于100 ℃水浴加熱5 min，超聲提取10 min后于3 500 r/min離心5 min，取上清液至另一試劑瓶中，殘渣繼續(xù)加入100 mL提取劑重復(fù)上述步驟，合并上清液。每200 mL提取液分別用等體積正己烷和乙酸乙酯各萃取一次，取下層溶液于60 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用5 mL 20%甲醇溶液(含0.1%乙酸)溶解殘留物，獲得毒素粗提溶液。

1.3.2 凈化

毒素粗提溶液進(jìn)一步用Sephadex LH20羥丙基葡聚糖凝膠柱進(jìn)行凈化，先取150 g Sephadex LH20用800 mL 20%甲醇溶液(含0.1%乙酸)活化過夜，然后取玻璃層析柱(5 cm×120 cm)用濕法裝柱。將毒素粗提溶液于4 000 r/min離心5 min，取其上清液過凝膠柱進(jìn)行層析凈化。采用20%甲醇溶液(含0.1%甲酸)作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，自動餾分收集器收集餾分，設(shè)置每管收集時間為7 min，共收集100管。將每管收集液取500 μL過0.22 μm濾膜于進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)LC-MS/MS分析。收集含麻痹性貝類毒素組分的餾分，然后將其合并、40 ℃減壓蒸餾濃縮近干，備用。

1.3.3 純化

將1.3.2步驟收集的樣品溶解于20 mL 20%乙腈溶液(含0.1%甲酸)，采用配有光電二極管陣列檢測器的液相色譜進(jìn)行分離、純化。采用TSK-GEL Hillic Amide-80色譜柱(4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm)；流動相A相為95%的乙腈水溶液(含0.1%甲酸)，B相為水(含0.1%甲酸)；柱溫30 ℃；進(jìn)樣50 μL；流速1 mL/min。梯度洗脫：0～1 min，80%A，20%B；1～8 min，80%～40%A，20%～60%B；8～11 min，40%A，60%B；11～12 min，40%～80%A，60%～20%B；12～20 min，80%A，20%B，上述梯度洗脫為體積比。每針制備時間為20 min，根據(jù)目標(biāo)物保留時間收集色譜峰，連續(xù)制備合并餾分，40 ℃減壓蒸餾濃縮近干，用75%乙腈水(含0.25%甲酸)溶解并稀釋至60 mL，備用。

1.4 定性分析

采用液相色譜-四極桿/離子阱復(fù)合質(zhì)譜的提取離子譜圖、二級碎片譜圖與加拿大國家海洋研究所標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的多級質(zhì)譜信息進(jìn)行匹配，采用液相色譜-高分辨質(zhì)譜儀測定精確質(zhì)量數(shù)，通過兩種方式進(jìn)行定性確證。

1.5 定值分析

準(zhǔn)確移取50 μL標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，加入950 μL 75%乙腈水(含0.25%甲酸)，充分混勻后進(jìn)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。參照GB/T 15000.3—2008[16]標(biāo)準(zhǔn)要求，選擇8家具有PSPs檢測能力的實驗室協(xié)同定值，每個實驗室隨機(jī)抽取3瓶標(biāo)準(zhǔn)樣品采用1.2測定方法對樣品進(jìn)行定值分析。對各實驗室的數(shù)據(jù)按大小順序排列，進(jìn)行Grubb’s和Cochran檢驗，如各實驗室測試精度一致，則將總算術(shù)平均值作為毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的結(jié)果。

1.6 均勻性檢驗

標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性是指特性量值在空間分布的均勻程度，它是對標(biāo)準(zhǔn)樣品總體空間分布的評價，是標(biāo)準(zhǔn)樣品的重要質(zhì)量指標(biāo)之一。對同一批制備的麻痹性貝類毒素樣品進(jìn)行分裝，每瓶標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液規(guī)格為0.5 mL，共100瓶。按照GB/T 15000.3—2008[10]規(guī)定，本研究隨機(jī)抽取15瓶標(biāo)準(zhǔn)樣品，每瓶樣品重復(fù)測試3次，分析標(biāo)準(zhǔn)樣品的毒素含量。所有試樣以隨機(jī)次序在重復(fù)性條件下測試，即在同一實驗室中由相同人員使用相同測試方法和儀器在較短時間內(nèi)測試。采用方差分析法進(jìn)行差異性分析，得出均勻性結(jié)果。

1.7 穩(wěn)定性檢驗

為了考察標(biāo)準(zhǔn)樣品的長期穩(wěn)定性，確定其有效期，取本標(biāo)準(zhǔn)樣品模擬上市包裝，在溫度為4 ℃和-18 ℃的條件下進(jìn)行穩(wěn)定性試驗。分別在第0、1、2、3和6個月時隨機(jī)選取3個樣品進(jìn)行毒素測定。采用直線經(jīng)驗?zāi)Ｐ头治鰳悠返姆€(wěn)定性，根據(jù)穩(wěn)定性結(jié)果，確定標(biāo)準(zhǔn)樣品的有效期。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性分析

采用液相色譜-四極桿/離子阱復(fù)合質(zhì)譜測定的制備標(biāo)準(zhǔn)樣品中毒素組分的提取離子色譜圖，見圖2，經(jīng)液相色譜-高分辨質(zhì)譜儀分析后獲得的實驗制備標(biāo)準(zhǔn)樣品中毒素組分的精確質(zhì)量數(shù)見圖3。實驗結(jié)果表明，制得的標(biāo)準(zhǔn)樣品提取離子色譜峰的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液一致且二級碎片譜圖匹配度大于90%，高分辨質(zhì)譜實測精確質(zhì)量數(shù)與理論值高度吻合(表3)，兩種檢測方法均證明所分離的PSPs樣品為膝溝藻毒素GTX 1&4和GTX 2&3，其中GTX1與GTX4，GTX2與GTX3互為同分異構(gòu)體，是貝類體內(nèi)富集較多的麻痹性貝類毒素[17]。

圖2 PSPs制備樣品中GTX1&4和GTX2&3的提取離子色譜圖Fig.2 The extracted ion chromatograms of GTX1&4 and GTX2&3 in PSPs prepared sample

圖3 PSPs制備樣品中GTX1&4和GTX2&3高分辨質(zhì)譜(high resolution mass spectrum, HRMS)圖(1)GTX1的高分辨質(zhì)譜圖；(2)GTX4的高分辨質(zhì)譜圖；(3)GTX2的高分辨質(zhì)譜圖；(4)GTX3的高分辨質(zhì)譜圖。Fig.3 The HRMS spectra of GTX1&4 and GTX2&3 in PSPs prepared sample(1)The HRMS of GTX1; (2)The HRMS of GTX4;(3)The HRMS of GTX2; (4)The HRMS of GTX3.

表3 PSPs制備樣品的理論質(zhì)量數(shù)、測量質(zhì)量數(shù)和質(zhì)量精度Tab.3 The theoretical mass, measured mass and mass accuracy error of prepared paralytic shellfish poisons (PSPs)

2.2 均勻性檢驗

研制的麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性檢驗結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。

F(0.05，14，30)=2.04，由表5可知，各組分的F值均小于F(0.05，14，30)，說明在95%的置信區(qū)間，麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性良好。

表4 研制麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性Tab.4 The homogeneity test results of paralytic shellfish poisons (PSPs) μg·L-1

2.3 穩(wěn)定性檢驗

研制的麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性測定結(jié)果及其直線模型分析結(jié)果分別見表6和表7。

表5 均勻性檢驗方差分析結(jié)果Tab.5 The variances results of homogeneity test

表6 研制麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性Tab.6 The stability test results of paralytic shellfish poisons (PSPs) μg·L-1,n=1

表7 研制麻痹性貝類毒素樣品穩(wěn)定性的直線模型分析Tab.7 The linear model analysis results of paralytic shellfish poisons (PSPs) n=3

注：b1為截距；b0為斜率；s為標(biāo)準(zhǔn)偏差；s(b1)為與斜率相關(guān)的不確定度；95%置信水平下自由度為n-2的t因子t0.95,n-2=3.18。

由表7可知，各組分在4 ℃和-18 ℃條件下，|b1|均小于t0.95, n-2×s(b1)，故擬合的直線斜率不顯著，未監(jiān)測到不穩(wěn)定性，由此說明在4 ℃和-18 ℃條件下儲存6個月，標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性良好。

2.4 定值結(jié)果

參照CNAS-CL04[18]的要求，本研究選擇8家具有麻痹性貝類毒素檢測能力的實驗室進(jìn)行協(xié)同定值。每個實驗室隨機(jī)抽取3瓶樣品，采用上述1.2的統(tǒng)一測定方法對樣品進(jìn)行定值分析(表8)。采用Grubb’s法檢驗平均值，結(jié)果無異常值，計算結(jié)果的平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。對結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行Cochran檢驗，計算Cochran值(C)。

表8 研制麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值結(jié)果Tab.8 The contents of paralytic shellfish poisons (PSPs)

式(1)

式(1)中:Si為各實驗室測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差；Smax為Si中的最大值；n為實驗室數(shù)量。

由表8計算得到：GTX1的Cochran值為0.378，GTX4的Cochran值為0.282，GTX2的Cochran值為0.278，GTX3的Cochran值為0.208。查表得C8,3(0.05)=0.516，各組分測量的Cochran值均小于0.516，表明各實驗室間的測量屬于等精度測量，因此計算總算術(shù)平均值可作為最終的樣品定值結(jié)果?？偲骄禐閄(GTX1)=3 663 μg/L，X(GTX4)=1 147 μg/L，X(GTX2)=1 884 μg/L，X(GTX3)=797 μg/L。

2.5 定值結(jié)果的不確定度評定

標(biāo)準(zhǔn)樣品定值結(jié)果的不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)樣品定值過程引入的不確定度、均勻性檢驗引入的不確定度和穩(wěn)定性檢驗引入的不確定度組成[19-20]。依據(jù)全部測定結(jié)果，計算麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度。

1)標(biāo)準(zhǔn)樣品定值實驗引入的不確定度uX，按照加權(quán)法計算標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的不確定度為：

式(2)

經(jīng)計算得到uX(GTX1)= 0.582，uX(GTX4)= 0.494，uX(GTX2)= 0.672，uX(GTX3)= 0.466。

2)均勻性檢驗引入的不確定度ubb，瓶間方差：

式(3)

式(3)中：MSamong為組間均方差，MSwithin為組內(nèi)均方差，具體數(shù)值表5；n0為3。

均勻性檢驗引入的不確定度ubb=Sbb，經(jīng)計算得到ubb(GTX1)=0.229，ubb(GTX4)=0.213，ubb(GTX2)=0.449，ubb(GTX3)=0.245。

3)穩(wěn)定性檢驗引入的不確定度ults。由2.3穩(wěn)定性檢驗試驗可知，穩(wěn)定性檢驗引入的不確定度：ults=s(b1) ×t，其中ults為不同溫度引入的合成不確定度；t代表穩(wěn)定性檢驗時間(月份)為6。

經(jīng)計算ults(GTX1)=4.884，ults(GTX4)=4.919，ults(GTX2)=5.431，ults(GTX3)=5.911。

4)標(biāo)準(zhǔn)樣品定值結(jié)果的不確定度：

式(4)

則u(GTX1)= 4.924，u(GTX4)=4.948，u(GTX2)=5.491，u(GTX3)=5.934。

k=2時的擴(kuò)展不確定度：urel=u×k。則urel(GTX1)=9.85，urel(GTX4)=9.90，urel(GTX2)= 10.98，urel(GTX3)=11.87。

表9 研制麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品中毒素含量的不確定度分量Tab.9 Uncertainty evaluation for paralytic shellfish poisons (PSPs)

本研究中定值數(shù)據(jù)及均勻性、穩(wěn)定性引入的不確定度分析統(tǒng)計結(jié)果見表9。本標(biāo)準(zhǔn)樣品中GTX1含量的特性值和擴(kuò)展不確定度為(3 663±10)μg/L，k=2；GTX4含量的特性值和擴(kuò)展不確定度為(1 147±10) μg/L，k=2；GTX2含量的特性值和擴(kuò)展不確定度為(1 884±11)μg/L，k=2；GTX4含量的特性值和擴(kuò)展不確定度為(797±12)μg/L，k=2。

3 結(jié)論

本研究以含毒貽貝為原料，經(jīng)提取、濃縮及凝膠柱凈化等步驟獲得PSPs粗品，再采用高效液相色譜進(jìn)行分離、純化后制得麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品，此標(biāo)準(zhǔn)樣品為GTX 1(3 663 μg/L)>X4(1 147 μg/L)和GTX 2(1 884 μg/L)>X3(797 μg/L)的混合溶液，溶劑為75%乙腈水(含0.25%甲酸)。通過對該標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行均勻性檢驗、穩(wěn)定性考察及多家實驗室聯(lián)合定值，結(jié)果表明，該標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性與穩(wěn)定性良好，量值可靠。該標(biāo)準(zhǔn)樣品能滿足麻痹性貝類毒素化學(xué)檢測方法中毒素質(zhì)量分析的要求，可用于麻痹性貝類毒素的定性或定量檢測、測試結(jié)果的質(zhì)量控制及檢測方法驗證等，為中國貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的研發(fā)提供了技術(shù)儲備，對提升中國突破國際技術(shù)壁壘的能力具有積極作用。