食管鱗狀細(xì)胞癌組織中BTG-1的表達(dá)及其對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC9706凋亡的影響

高明 劉麗英 李晟磊

[摘要] 目的 分析食管鱗狀細(xì)胞癌組織中B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因1（BTG-1）的表達(dá)及其對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC9706凋亡的影響。 方法 選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2014年1月～2017年12月存檔的164個(gè)鱗狀細(xì)胞癌存檔手術(shù)或內(nèi)鏡活檢蠟塊、76個(gè)癌旁正常組織手術(shù)蠟塊作為研究對(duì)象，采用免疫組化法、原位雜交檢測(cè)BTG1蛋白表達(dá)并分析其與病理參數(shù)的關(guān)系;建立BTG-1過(guò)量表達(dá)細(xì)胞株，AnncxinV-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC9706的凋亡情況。 結(jié)果 食管鱗狀細(xì)胞癌組織BTG-1蛋白、信使核糖核酸（mRNA）陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁正常組織（χ2=32.718、55.729，均P < 0.001）;且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、組織學(xué)分級(jí)Ⅱ～Ⅲ級(jí)標(biāo)本中BTG-1蛋白、mRNA陽(yáng)性表達(dá)率顯著較低（χ2=29.078、5.970、7.660、31.127、8.624、10.624，均P < 0.001）;且BTG-1組早期細(xì)胞凋亡率顯著高于空白對(duì)照組（t = 15.484，P < 0.001）。 結(jié)論 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中BTG1的表達(dá)顯著低于癌旁正常組織，且其與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系密切，BTG-1高表達(dá)或可促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞] 鱗狀細(xì)胞癌;B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因1;食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC9706;凋亡

[中圖分類號(hào)] R735.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）03（a）-0007-04

[Abstract] Objective To analyze the expression of B-cell translocation gene 1 （BTG-1） in tissue of esophageal squamous cell carcinoma and the effect on apoptosis of esophageal squamous cell carcinoma cell line EC9706. Methods A total of 164 paraffin blocks of squamous cell carcinoma collected through surgery or endoscopic biopsy and 76 adjacent normal tissue surgical blocks were collected from the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University from January 2014 to December 2017. The expression of BTG-1 protein and mRNA in the two groups were detected by immunohistochemistry and in situ hybridization， and their relationships with pathological parameters were analyzed. The BTG-1 overexpressing cell line was established， and the apoptosis of human esophageal squamous cell carcinoma cell line EC9706 was detected by AnnexinV-FITC/PI double labeling flow cytometry. Results The positive expression rates of BTG-1 protein and messenger ribonucleic acid （mRNA） in esophageal squamous cell carcinoma tissues were significantly lower than those in adjacent normal tissues （χ2=32.718， 55.729; all P﹤ 0.001）. The positive expression rates of BTG-1 protein and mRNA in specimens with lymph node metastasis， at TNM stage Ⅲ - Ⅳ and histological grade Ⅱ - Ⅲ were significantly lower than those without lymph node metastasis， at TNM stage Ⅰ - Ⅱ and of histological grade Ⅰ （χ2=29.078， 5.970， 7.660， 31.127， 8.624， 10.624; all P﹤0.001）. The early apoptosis rate in BTG-1 group was significantly higher than that in blank control group （t = 15.484， P < 0.001）. Conclusion The expression of BTG1 in tissues of esophageal squamous cell carcinoma is significantly lower than that in adjacent normal tissues. It is closely related to the presence of lymph node metastasis， TNM stage and histological grade. High expression of BTG-1 may promote the apoptosis of cell of esophageal squamous cell carcinoma.

[Key words] Esophageal carcinoma; B-cell translocation gene 1; Esophageal squamous carcinoma cell line EC9706; Apoptosis

食管癌具高浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移特征，根據(jù)其組織學(xué)分型，主要有鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、未分化癌等，其中以鱗狀細(xì)胞癌比例最高;因食管癌初期臨床癥狀不具特異性，多數(shù)患者就診時(shí)病情已進(jìn)展至中晚期。當(dāng)前針對(duì)食管癌的治療方式雖然較多，如放化療、生物治療、介入治療等，但仍未取得滿意效果，中晚期患者5年生存率仍僅為10%左右，其預(yù)后極差[1-4]。B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因1（B-cell translocation gene 1，BTG-1）是新發(fā)現(xiàn)的抑癌癥基因，屬BTG/Tob抗增殖基因家族一員，研究[5]指出，BTG-1在促進(jìn)細(xì)胞凋亡、弱化腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，BTG-1與前列腺癌、甲狀腺癌、婦科腫瘤等臨床病理參數(shù)的相關(guān)性及其在對(duì)應(yīng)腫瘤疾病中的表達(dá)情況均獲得廣泛探討，但食管癌組織中BTG1的表達(dá)類研究相對(duì)少見(jiàn)[6-8]。鑒于此，現(xiàn)采集食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞標(biāo)本研究探討，具體報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月～2017年12月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）收治的食管癌患者，共計(jì)164例，均為鱗狀細(xì)胞癌存檔手術(shù)或內(nèi)鏡活檢取樣蠟塊，其中76例存檔癌旁正常組織手術(shù)蠟塊。其中男96例，女68例;年齡37～75歲，平均（52.37±8.12）歲;組織學(xué)分型Ⅰ期104例，Ⅱ期34例，Ⅲ期26例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移102例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62例;TNM分期Ⅰ期60例，Ⅱ期48例，Ⅲ期39例，Ⅳ期17例;所存檔蠟塊患者均未經(jīng)任意放化療或生物治療等積極治療。鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本、癌旁正常組織標(biāo)本獲取均經(jīng)由患者知情同意，并獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試藥? 免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;原位雜交預(yù)交液、SA-Bio-AP、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;原位雜交5′端生物標(biāo)記素、全硫代修飾探針均購(gòu)自北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司;光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS技術(shù)公司;離心機(jī)購(gòu)自北京離心機(jī)廠;蘇木素染色液購(gòu)自天津化學(xué)試劑廠;BTG-1基因序列為：GCGATGGCTCTAGTCCAGATGC，獲取自NCBI網(wǎng)站，原位雜交5′端生物素標(biāo)記、探針均購(gòu)自北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2.2 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中BTG-1表達(dá)? ①免疫組化法（SP）：存檔石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，抗原高壓修復(fù)后3%過(guò)氧化氫10 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，10%山羊血清室溫封閉20 min，BTG-1抗體（1∶200）濕盒4℃過(guò)夜，滴加二抗，室溫濕盒內(nèi)孵育20 min，滴加三抗，室溫濕盒內(nèi)孵育20 min，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素染色液復(fù)染后分化、返藍(lán)，再常規(guī)脫水、透明、封片，常溫存檔2～3 d后顯微鏡下讀片;5個(gè)視野/切片，3張切片/標(biāo)本，以磷酸緩沖鹽溶液（PBS）為陰性對(duì)照。②原位雜交：切片重復(fù)脫蠟2次，10 min/次，梯度乙醇預(yù)處理5 min后置于焦碳酸二乙酯（DEPC）水中，0.5%過(guò)氧化氫室溫下滅活，暴露mRNA核酸片段，1%多聚甲醛/0.1 mol PBS（pH值7.2～7.6），1/1000 DEPC室溫固定;預(yù)雜交處理后滴加含標(biāo)記探針的雜交液，劑量1 ng/L，蓋膜并在42℃條件下雜交12 h后檸檬酸鈉緩沖液（SSC，0.1×）洗脫非特異性雜交（15 min，42℃，4次），堿性磷酸酶底物（BCIP/NBT）顯色，顯色滿意后脫水、封固，室溫存放2～3 d后顯微鏡下讀片，以不含探針的標(biāo)本為陰性對(duì)照組。③食管癌組織中BTG-1mRNA、蛋白陽(yáng)性表達(dá)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞百分比<5%記0分、5～25%記1分、>25%～50%記2分、>50%記3分;細(xì)胞無(wú)染色記0分、細(xì)胞染色呈淺黃色記1分、黃褐色記2分、棕黃色記3分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比與細(xì)胞染色程度記分之和≤3分為陰性，>3分為陽(yáng)性。

1.2.3 BTG-1對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC9706凋亡的影響? 人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株培養(yǎng)至細(xì)胞密度70%～80%后分別加入1 mL含BTG-1基因的pLenti6-BTG1質(zhì)粒的病毒液、含pLenti6/V5-DEST對(duì)照質(zhì)粒病毒液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后更換培養(yǎng)基，滴加5 μg/mL Blastidicin，10 d后篩選克隆接種于24孔培養(yǎng)板，細(xì)胞長(zhǎng)滿后繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，篩選pLenti6/H1299細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株為空白對(duì)照組、pLenti6-BTG1/H1299細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株作為BTG-1組;參照AnncxinV-FITC/PI試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，將空白對(duì)照組、BTG-1組細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)6孔，0.2%胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)液并置于離心管，1000 r/min離心5 min，離心半徑13.5 cm，棄上清，細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，選取1×105～5×105個(gè)/mL重懸細(xì)胞，100 r/min離心5 min，離心半徑13.5 cm，棄上清液，500 μL結(jié)合液重懸，依次滴加5 μL AnncxinV-FITC、5 μL碘化丙啶，充分混勻后避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，激發(fā)光波波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射光波波長(zhǎng)530 nm，AnncxinV-FITC、PI分別為紅、綠色熒光，單個(gè)樣本檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞，30 min內(nèi)完成，以AnncxinV-FITC、PI單染OE-33細(xì)胞作為參照，CellQuest軟件計(jì)算細(xì)胞凋亡比，細(xì)胞凋亡情況壞死區(qū)（AnncxinV-FIT-、PI+，位于左上區(qū)）、晚期細(xì)胞凋亡區(qū)（AnncxinV-FIT+、PI+，位于右上區(qū)）、活細(xì)胞區(qū)（AnncxinV-FIT -、PI-，位于左下區(qū)）、早期細(xì)胞凋亡區(qū)（AnncxinV-FIT +、PI-，位于右下區(qū)）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中BTG-1蛋白表達(dá)情況

食管鱗狀細(xì)胞癌組織中BTG-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于癌旁正常組織，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 = 32.718，P < 0.001）。見(jiàn)表1、圖1（封四）。

2.2 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中BTG-1mRNA表達(dá)

食管鱗狀細(xì)胞癌組織中BTG-1mRNA陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于癌旁正常組織，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=55.729，P < 0.001）。見(jiàn)表2、圖2（封四）。

2.3 不同病理特征的食管鱗狀細(xì)胞癌組織中BTG-1表達(dá)比較

鱗狀細(xì)胞癌組織中BTG-1蛋白、BTG-1 mRNA陽(yáng)性表達(dá)在性別、年齡、組織學(xué)病理分型等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;但有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、組織學(xué)分級(jí)Ⅱ～Ⅲ級(jí)鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本中BTG-1蛋白、BTG-1 mRNA陽(yáng)性表達(dá)率顯著較低（均P < 0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 BTG-1對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC9706凋亡的影響

BTG-1組早期細(xì)胞凋亡率[（10.46±0.87）%]顯著高于空白對(duì)照組[（2.27±0.96）%]，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 15.484，P < 0.001）。見(jiàn)圖3～4。

3 討論

食管鱗狀細(xì)胞癌作為預(yù)后較差的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展雖與腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖、分化能力降低有密切關(guān)系[9-12]，但腫瘤細(xì)胞的持續(xù)生長(zhǎng)僅靠增殖抑制只能取得延緩獲益，如何誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡才是腫瘤細(xì)胞縮小、消失的根本途徑[13-16]。然而，細(xì)胞凋亡既可發(fā)生于生理?xiàng)l件、亦可發(fā)生于病理?xiàng)l件。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞死亡過(guò)程具自發(fā)性、程序化特征，而這一過(guò)程又受多種因素影響，并涉及與其相關(guān)的多個(gè)基因變化，通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)促進(jìn)其凋亡對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌的臨床診治有重要意義[17-18]。BTG-1是定位于第8～12號(hào)染色體的BTG/Tob抗增殖基因家族成員之一，分子質(zhì)量1.9×104，含5620個(gè)堿基對(duì)，可編碼171個(gè)氨基酸，作為抗增殖基因家族中的一員，其減緩細(xì)胞增殖的作用已相對(duì)明確[19-20]。隨著研究深入，BTG-1在機(jī)體病理、生理發(fā)展過(guò)程中所發(fā)揮的重要作用被廣泛重視。有報(bào)道[21]指出，BTG-1高表達(dá)可通過(guò)對(duì)促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白間的平衡調(diào)控作用促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

本研究亦顯示，食管鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本中BTG-1蛋白、mRNA陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于癌旁正常組織，且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、組織學(xué)分級(jí)Ⅱ～Ⅲ級(jí)標(biāo)本中BTG-1蛋白、mRNA陽(yáng)性表達(dá)率分別顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移跡象、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)標(biāo)本（P < 0.05），這與馮盼盼等[22]的報(bào)道結(jié)論相似，其研究對(duì)象為胃腺癌組織，較正常癌旁組織黏膜組織，胃腺癌組織中BTG-1蛋白、mRNA明顯低表達(dá)，并與腫瘤細(xì)胞TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示腫瘤組織中BTG-1蛋白表達(dá)量與腫瘤疾病發(fā)展密切相關(guān);且經(jīng)AnncxinV-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)，BTG-1組早期細(xì)胞凋亡率顯著高于空白對(duì)照組，提示BTG-1高表達(dá)或可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡;這與孫國(guó)貴等[23]報(bào)道結(jié)論相符，其報(bào)道BTG-1轉(zhuǎn)染可促進(jìn)肺癌細(xì)胞早期凋亡;但當(dāng)前針對(duì)BTG-1對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC9706細(xì)胞凋亡的相關(guān)研究十分鮮見(jiàn)，且細(xì)胞凋亡過(guò)程極為精密、復(fù)雜，并涉及多種基因、調(diào)控因子，如癌癥基因、抑癌基因、各種調(diào)控基因等，從基因表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)等途徑探究BTG-1對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的影響仍有極大的探究空間。

綜上所述，食管鱗狀細(xì)胞癌組織存在BTG-1低表達(dá)現(xiàn)象，BTG轉(zhuǎn)染對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC9706凋亡有明顯促進(jìn)作用，或可為食管鱗狀細(xì)胞癌臨床治療提供新方向。

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（收稿日期：2018-05-22? 本文編輯：王? ?蕾）