持續(xù)有氧運動和高強度間歇運動對高血壓大鼠骨骼肌代謝及纖維類型的影響

孫一 裴晶晶 李學(xué)恒

摘 要：目的：對比8周持續(xù)有氧運動和高強度間歇運動對高血壓大鼠骨骼肌代謝及纖維類型的影響，為制定最佳運動康復(fù)處方提供理論依據(jù)。方法：30只自發(fā)性高血壓大鼠隨機分為安靜對照組（SED）、持續(xù)有氧運動組（CAE）和高強度間歇運動組（HIE）。實驗前后利用無創(chuàng)血壓儀測定尾動脈血壓，包括收縮壓（SBP）和舒張壓（DBP），實驗后分離比目魚?。?，I型肌纖維為主）和脛骨前?。旒。琁I型肌纖維為主），酶聯(lián)免疫吸附法測定檸檬酸合酶（CS）活性，ATP酶染色法鑒定肌纖維類型（I、II）以及毛細血管密度，Western Blot法測定線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體（CI、CII、CIII、CIV和CV），血管生成因子包括內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR2）、低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）蛋白相對表達量以及肌球蛋白重鏈（MHC）亞型（I、IIa、IIx和IIb）百分構(gòu)成比。結(jié)果：1）血壓水平：實驗后CAE組SBP和DBP均較實驗前顯著性降低（P<0.05），HIE組血壓水平無顯著性變化（P>0.05）。2）比目魚?。篊AE組和HIE組線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體CII～CV以及SDH蛋白表達量顯著性升高（P<0.05），CS活性均無顯著性變化（P>0.05）;HIE組毛細血管密度以及eNOS和VEGFR2蛋白表達量顯著性降低（P<0.05）、HIF-1α表達升高（P<0.05），CAE組毛細血管密度及各血管生成因子均無顯著性變化（P>0.05）;CAE組和HIE組MHC IIa型比例增加（P<0.05），MHC IIx型比例減少（P<0.05）。3）脛骨前?。篊AE組和HIE組線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體CI～CIII和CV蛋白表達量顯著性升高（P<0.05），CS活性均顯著性下降（P<0.05）;HIE組SDH蛋白表達量顯著性降低（P<0.05），CAE組無顯著性變化（P>0.05）;HIE組毛

細血管密度以及VEGF和VEGFR2蛋白表達量顯著性降低（P<0.05）、HIF-1α表達升高（P<0.05），CAE組毛細血管密度顯著性升高（P>0.05），但各血管生成因子均無顯著性變化（P>0.05）;CAE組MHC IIb型比例減少（P<0.05），MHC IIx型比例增加（P<0.05），HIE組MHC IIb型比例增加（P<0.05）。結(jié)論：持續(xù)有氧運動和高強度間歇運動對自發(fā)性高血壓大鼠骨骼肌代謝和纖維類型的影響存在顯著差異，持續(xù)有氧運動是改善高血壓骨骼肌氧化能力的適宜方式。

關(guān)鍵詞：高強度間歇運動;持續(xù)有氧運動;高血壓;骨骼肌;纖維類型;代謝

中圖分類號：G804.2 文獻標識碼：A文章編號：1006-2076（2019）01-0064-09

高血壓是心力衰竭以及心源性死亡的首要原因。高血壓患者心肌功能紊亂（心臟泵血機能減弱），同時可造成骨骼肌代謝異常[1]。高血壓的病理生理機制尚未完全明確，其中能量代謝異常在該疾病發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。動物模型研究證實[1]，高血壓心肌和骨骼肌線粒體含量以及毛細血管數(shù)量減少，骨骼肌II型纖維（快?。┍壤黾?，氧化能力下降。由于骨骼肌纖維類型轉(zhuǎn)換及代謝紊亂，患者常出現(xiàn)疲勞及運動不耐受，最終導(dǎo)致生活質(zhì)量降低。調(diào)控肌纖維類型分布及代謝是改善高血壓患者臨床癥狀、提高運動能力和生存質(zhì)量的策略之一。動物實驗以及臨床研究均證實[2]，運動是高血壓患者非藥物治療的重要手段，然而改善骨骼肌氧化能力的最佳運動處方（運動方式及運動負荷）至今尚未確定。

運動能夠誘導(dǎo)骨骼肌產(chǎn)生適應(yīng)，例如一次急性運動即可激活多種調(diào)節(jié)代謝的轉(zhuǎn)錄因子，其中γ過氧化物酶體增殖物活化受體輔活化蛋白1 （peroxisome proliferator-activated receptor gamma co-activator 1 alpha，PGC-1α）表達上調(diào)對線粒體生物合成起決定作用，而反復(fù)運動刺激（即長期規(guī)律運動）的累積效應(yīng)引起線粒體含量增加，氧化酶活性提高和/或表達量上調(diào)，骨骼肌有氧代謝能力隨之增強[3]。此外，運動尚能夠改變肌纖維類型分布，促使I型肌纖維比例增加。對于健康者，高強度間歇運動（high-intensity interval exercise，HIE）和持續(xù)有氧運動（continuous aerobic exercise，CAE）均可誘導(dǎo)上述適應(yīng)性反應(yīng)，且兩種運動方式間比較并無顯著性差異，提示骨骼肌適應(yīng)不存在運動強度依賴性[4]，因此相對于傳統(tǒng)CAE模式，HIE具有省時、有效等突出特點。本課題組前期針對健康SD大鼠的研究證實[5]，一次急性HIE可同時募集快肌和慢肌纖維并激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而長期（8周）HIE則提高快肌中I型和IIa型肌纖維以及慢肌中I型肌纖維比例，上調(diào)快肌和慢肌糖原含量和有氧代謝酶活性以及快肌無氧代謝酶活性，最終改善運動能力。然而HIE是否同樣適用于臨床患者特別是心功能處于代償期的心血管疾病者（如高血壓）尚缺乏有利證據(jù)。動物實驗顯示[6-9]，長時間劇烈運動或力竭運動可引起心臟適應(yīng)不良，甚至發(fā)生心律失常以及心源性猝死。據(jù)此推測，病理狀態(tài)下運動時應(yīng)存在“強度閾”，超過該閾值易造成病理性適應(yīng)。然而，Chicco等[10]針對高血壓大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，運動強度過低不足以誘導(dǎo)線粒體生物合成。因此，深入研究不同運動方式對高血壓的療效對于制定最佳運動康復(fù)方案具有重要意義。本研究目的在于對比HIE和CAE對自發(fā)性高血壓大鼠骨骼肌纖維類型和代謝的影響。我們假設(shè)，HIE和CAE均可增加骨骼肌線粒體含量、促進肌纖維向耐疲勞的慢肌轉(zhuǎn)換、改善毛細血管/肌纖維比例，最終提高骨骼肌氧化能力，從而證實HIE可作為高血壓患者省時、安全、有效的運動方式。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

30只自發(fā)性高血壓大鼠，8周齡，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。12 h/12 h晝夜交替光照，自由進食水。將實驗動物隨機分為安靜對照組（sedentary，SED），高強度間歇運動組（HIE）和持續(xù)有氧運動組（CAE）。

1.2 運動方案

所有動物適應(yīng)環(huán)境1周后進行3 d適應(yīng)性訓(xùn)練，方案為：速度10 m/min、坡度0°、時間10～15 min/d。隨后測定大鼠最高跑速（maximal velocity，Vmax）[11]，方法為：起始負荷為5 m/min，坡度為0°，每2 min遞增1.5 m/min，直至力竭（力竭標準：大鼠拒絕繼續(xù)運動，在電刺激下仍停留在跑臺后部）。

根據(jù)Borges等[12]和Hoydal等[13]的方法并稍加修改制定CAE和HIE組跑臺運動方案。HIE組：以80%Vmax運動4 min、40%Vmax運動4 min，之后依次交替進行，重復(fù)7次（運動時間為56 min）;CAE組：以60%Vmax持續(xù)運動56 min。兩種訓(xùn)練方式總的運動負荷相同，即HIE組：（80%×4+40%×4）×7=33.6 Vmax·min;CAE組：60%×56=33.6 Vmax·min，因此可排除因運動負荷不同造成的偏倚。兩組運動頻率均為4天/周，共8周，每周末重新測定Vmax以調(diào)整訓(xùn)練負荷。SED組在鼠籠內(nèi)安靜飼養(yǎng)8周。

1.3 動脈血壓測定

分別于訓(xùn)練前以及末次訓(xùn)練后48 h，采用智能無創(chuàng)血壓測試儀（BP-2010A）測量尾動脈血壓，包括收縮壓（systolic blood pressure，SBP）和舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）。

1.4 動物取材

血壓測定后用戊巴比妥鈉（100 mg/kg體重）麻醉動物，分離脛骨前?。旒?，II型肌纖維）和比目魚?。?，I型肌纖維），將組織分為兩部分，一部分進行蛋白表達或活性測定，取材后用錫紙包裹迅速投入液氮中并轉(zhuǎn)移至-80℃低溫冰箱凍存，另一部分制作組織切片進行組織化學(xué)測定（肌纖維類型、毛細血管密度）。

1.5 Western blot檢測蛋白表達量

將骨骼肌組織勻漿裂解，4℃、20 000 g離心30 min，用考馬斯亮藍法測定總蛋白含量。取10 μg蛋白樣品經(jīng)15% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。一抗4℃靜置過夜，包括內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS，1∶1 000）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF，1∶2 000）、血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2，1∶5 000）、低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α，1∶2 000）以及線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體（CI、CII、CIII、CIV和CV）抗體（1∶

1 000）。以1∶1 000辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體（二抗）37℃孵育1 h，充分洗滌后，使用ECL發(fā)光顯影，X線膠片壓片曝光，掃描各條帶的灰度值，β-actin（1∶10 000）為內(nèi)參蛋白。相對表達量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.6 檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）活性測定

將骨骼肌用外科剪剪碎，按照每g骨骼肌加入10 mL勻漿緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA、250 mmol/L蔗糖、pH值7.4）的比例混勻后勻漿30 s（5 000 rpm），取2 mL勻漿液待用。以牛血清白蛋白為標準，Bradford法測定蛋白濃度。利用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定骨骼肌勻漿液CS活性。

1.7 肌纖維類型和毛細血管密度測定

參照課題組前期建立的方法[5]，利用ATP酶染色法測定肌纖維類型。將骨骼肌標本置于4%的多聚甲醛緩沖液中固定4～8 h后，常規(guī)石蠟包埋、切片（5 μm）。進行堿預(yù)孵（pH 10.6）1～2 h。拍照后用圖像分析軟件（Simple PCI）分析肌纖維類型分布（即I型和II型肌纖維所占百分比）。在Ⅰ、Ⅱ型纖維混合區(qū)選取3～6個視野利用Simple PCI圖像分析軟件測量單位面積內(nèi)毛細血管以及肌纖維數(shù)量，用單位面積內(nèi)毛細血管數(shù)量與肌纖維數(shù)量比值（capillary/fiber，CF）作為毛細血管密度。

1.8 肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）亞型測定

用Western Blot法測定MHC亞型（方法同1.5）。成像掃描后，MHC呈現(xiàn)為四條清晰的條帶，即I、IIa、IIx和IIb。用凝膠圖像分析軟件分析MHC各亞型灰度值并計算各條帶所占百分比（%）。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標準差”表示，組間比較采用單因素方差分析，若P值<0.05，則采用LSD法進行多重比較。統(tǒng)計學(xué)差異定為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 實驗期間動物一般情況以及最終樣本量

實驗期間各組大鼠未出現(xiàn)體毛凌亂、掉毛、無光澤，精神異常以及大便性狀改變等運動相關(guān)不良癥狀及過度疲勞狀態(tài)。實驗過程中，由于拒跑等原因共剔除2只大鼠，最終納入統(tǒng)計的樣本量為n=28，其中SED組（n=10）、CAE組（n=9）、HIE組（n=9）。

2.2 血壓的變化

與實驗前比較，實驗后CAE組SBP和DBP均顯著性降低（P<0.05），SED組和HIE組血壓水平無顯著性變化（P>0.05）。

2.3 線粒體含量的變化

比目魚?。号cSED組比較，CAE組和HIE組線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體CII～CV蛋白表達量顯著性升高（P<0.05）;CS活性均無顯著性變化（P>0.05）;SDH蛋白表達量均顯著性升高（P<0.05）。脛骨前肌：與SED組比較，CAE組和HIE組線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體CI～CIII和CV蛋白表達量顯著性升高（P<0.05）;CS活性均顯著性下降（P<0.05）;HIE組SDH蛋白表達量顯著性降低（P<0.05），CAE組無顯著性變化（P>0.05）。

2.4 毛細血管密度的變化

比目魚肌：與SED組比較，HIE組CF顯著性降低（P<0.05），CAE組無顯著性變化（P>0.05）。脛骨前?。号cSED組比較，HIE組CF顯著性降低（P<0.05），CAE組顯著性升高（P>0.05）。

2.5 血管生成因子的變化

比目魚?。号cSED組比較，CAE組各血管生成因子無顯著性變化（P>0.05），HIE組eNOS和VEGFR2降低（P<0.05）、HIF-1α升高（P<0.05）。脛骨前?。号cSED組比較，CAE組各血管生成因子無顯著性變化（P>0.05），HIE組VEGF和VEGFR2降低（P<0.05）、HIF-1α升高（P<0.05）。

2.6 肌纖維ATP酶染色與MHC亞型的變化

ATP酶染色結(jié)果顯示，I型肌纖維呈深藍色，II型肌纖維呈淺藍色。MHC亞型的變化見表1、表2。比目魚?。号cSED組比較，CAE組和HIE組MHC IIa型比例增加（P<0.05），MHC IIx型比例減少（P<0.05）（見表1）。脛骨前?。号cSED組比較，CAE組MHC IIb型比例減少（P<0.05），MHC IIx型比例增加（P<0.05），HIE組MHC IIb型比例增加（P<0.05）（見表2）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，自發(fā)性高血壓大鼠進行CAE和HIE均可[JP+1]上調(diào)慢?。ū饶眶~肌）線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體和SDH蛋白表達量并促進骨骼肌纖維向抗疲勞類型轉(zhuǎn)換（MHC IIa型比例增加、IIx型比例減少），同時HIE下調(diào)eNOS和VEGFR2并上調(diào)HIF-1α蛋白表達并降低毛細血管密度。在快?。劰乔凹。┲?，CAE和HIE均增加電子傳遞鏈復(fù)合體蛋白含量，此外CAE誘導(dǎo)骨骼肌纖維向抗疲勞類型轉(zhuǎn)換（MHC IIb型比例減少，IIx型比例增加）并促進血管生成，但HIE卻增加MHC IIb型肌纖維比例，下調(diào)VEGF和VEGFR2并上調(diào)HIF-1α蛋白表達并降低毛細血管密度。上述結(jié)果提示，與健康大鼠不同，CAE和HIE對高血壓大鼠骨骼肌纖維類型和代謝的影響存在顯著差異，進一步提示CAE可能是改善高血壓大鼠骨骼肌氧化能力的適宜運動方式。

3.1 線粒體含量的變化

運動訓(xùn)練能夠促進骨骼肌線粒體增殖。SDH和CS是線粒體內(nèi)參與有氧代謝的關(guān)鍵酶，電子傳遞鏈復(fù)合體嵌合于線粒體內(nèi)膜并呈組成性表達，其表達量與線粒體氧化能力和線粒體含量呈正相關(guān)。在本研究中， CAE組和HIE組比目魚肌電子傳遞鏈復(fù)合體亞單位蛋白表達量均顯著性增加，同時SDH上調(diào)，提示兩種運動方式均可提高骨骼肌氧化能力。這與Shepherd等[14]和Scribbans等[15]針對健康受試者的研究結(jié)果一致，即CAE和HIE夠誘導(dǎo)骨骼肌線粒體產(chǎn)生相似的生理適應(yīng)。出乎意料的是，CAE組和HIE組比目魚肌CS活性均無顯著性變化，與Pereira等[16]的研究不同（CS活性上調(diào)），可能與研究對象、樣本量、組織特異性、肌纖維類型以及測試方法等因素有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，CAT組和HIE組脛骨前肌CS活性下降，此外HIE組SDH表達下調(diào)，這一結(jié)果與針對健康大鼠的研究截然相反（本應(yīng)升高）[17]，提示病理狀態(tài)（如高血壓）能夠?qū)\動誘導(dǎo)的骨骼肌適應(yīng)產(chǎn)生復(fù)雜影響。此外，多項以高血壓大鼠為實驗?zāi)Ｐ偷难芯孔C實，運動后CS活性的變化可能升高、不變或降低。Jacobs等[18]的研究同樣指出，運動誘導(dǎo)的線粒體功能改變可能與線粒體相關(guān)基因表達的變化并不一致。8周HIE后電子傳遞鏈復(fù)合體蛋白表達升高，這與前人針對大鼠高強度運動模型以及力竭運動模型得到的結(jié)果不同。呂梅等[19]的研究表明，一次性力竭性運動引起大鼠肝臟線粒體NADH-CoQ還原酶（即CI）活性下降，致使胞漿內(nèi)大量NADH無法進入呼吸鏈而堆積，線粒體氧利用能力降低;李潔等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，運動性疲勞時骨骼肌呼吸鏈CIII活性下降;研究結(jié)果存在分歧可能與動物模型、運動方案、運動強度、肌纖維類型等因素有關(guān)。鑒于本研究中CAE和HIE均上調(diào)線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體蛋白含量，結(jié)合上述結(jié)果我們推測，高血壓大鼠運動后快肌纖維中表征氧化能力的指標并非同步升高。

3.2 毛細血管密度及血管生成因子的變化

運動過程中，運動肌細胞內(nèi)局部氧分壓下降（處于低氧環(huán)境），低氧激活對缺氧敏感的轉(zhuǎn)錄因子HIF-1，后者作用于多個低氧反應(yīng)基因的啟動子并促進其表達，包括eNOS、VEGF等。eNOS催化精氨酸合成NO并介導(dǎo)血管舒張反應(yīng)，VEGF則是血管生成的關(guān)鍵調(diào)控因子。血管增殖有利于縮短血管與組織細胞之間的彌散距離、擴大彌散面積，血管舒張能夠增加局部組織血流量，以滿足運動肌的代謝需求。HIF-1α能夠抑制線粒體生物合成[21]，長期運動則可下調(diào)健康受試者HIF-1α表達量[22]。然而本研究卻發(fā)現(xiàn)，HIE組比目魚肌毛細血管密度下降，同時eNOS和VEGFR2表達下調(diào)而HIF-1α升高，CAE組毛細血管密度和血管生成因子均無顯著性變化，HIF-1α上調(diào)提示HIE可造成骨骼肌處于缺氧狀態(tài)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，脛骨前肌中，CAE組毛細血管密度增加，HIE組則下降，進而促進HIF-1α表達上調(diào)，再次說明HIE誘導(dǎo)運動肌發(fā)生低氧反應(yīng)。針對健康者/動物模型的研究證實，CAE和HIE均可增加骨骼肌毛細血管密度以及eNOS表達量[16]，而對于2型糖尿病大鼠，CAE上調(diào)慢肌纖維毛細血管密度而HIE則無此作用[23]，進一步提示CAE和HIE誘導(dǎo)的骨骼肌適應(yīng)與機體的健康狀況有關(guān)。

HIE對骨骼肌不良效應(yīng)的機制尚不清楚，可能與氧化還原失衡有關(guān)。由于強度較高，HIE大鼠心輸出量不能滿足運動肌的需氧量，無氧代謝形成大量次黃嘌呤核苷酸（inosine monophosphate，IMP），后者可造成活性氧（reactive oxygen species，ROS）過量產(chǎn)生[24]。研究表明，適量ROS參與機體諸多生理過程并抑制HIF-1α表達，而過量ROS則下調(diào)VEGFR2表達，影響VEGF介導(dǎo)的血管生成反應(yīng)[24]，因此本研究中HIE組毛細血管密度下降。上述研究表明，運動介導(dǎo)的過量ROS對于本處于氧化應(yīng)激狀態(tài)（如高血壓）的組織器官（如骨骼?。a(chǎn)生負面影響。

3.3 肌纖維類型轉(zhuǎn)換

肌纖維根據(jù)形態(tài)、代謝和收縮特性可大致分為慢?。↖型）和快?。↖I型）兩大類。根據(jù)MHC亞型可分為I、IIa、IIb和IIx四型。骨骼肌可根據(jù)功能需求而發(fā)生表型適應(yīng)性改變。研究發(fā)現(xiàn)，運動能夠改變肌纖維類型分布，一般而言，耐力運動促進肌纖維向慢縮、抗疲勞亞型轉(zhuǎn)換并按照IIb→IIx→IIa→I的順序進行[25]。在本研究中，CAE組和HIE組比目魚肌MHC IIa型比例增加，MHC IIx型比例減少，提示兩種運動方式均促進慢肌纖維向抗疲勞類型轉(zhuǎn)換。然而在脛骨前肌中，CAE組MHC IIb型比例減少、MHC IIx型比例增加，HIE組MHC IIb型比例增加，提示CAE誘導(dǎo)快肌纖維向慢縮、抗疲勞亞型轉(zhuǎn)換，而HIE則促使肌纖維向快縮、易疲勞亞型轉(zhuǎn)換。募集反應(yīng)在肌纖維類型轉(zhuǎn)換中具有重要作用，HIE可同時動員快肌和慢肌纖維并誘導(dǎo)兩類肌纖維發(fā)生適應(yīng)性變化，因此HIE在促進脛骨前肌纖維類型轉(zhuǎn)換同時增加線粒體含量。然而與本研究結(jié)果不同，本課題組前期以健康大鼠為受試對象的研究則證實[5]，HIE提高脛骨前肌中I型和IIa型肌纖維比例，提示HIE促進快肌纖維向抗疲勞亞型轉(zhuǎn)換，再次印證病理狀態(tài)下運動誘導(dǎo)的骨骼肌適應(yīng)與健康狀態(tài)下存在顯著差異。

4 結(jié)論

CAE和HIE對自發(fā)性高血壓大鼠骨骼肌代謝和纖維類型的影響存在差異，CAE是改善高血壓骨骼肌氧化能力的適宜方式，這一結(jié)論是否適用于以骨骼肌氧化能力受損為特征的其他疾病狀態(tài)（如糖尿病、心梗等）仍需進一步驗證。今后的研究應(yīng)進一步對比CAE和HIE對各種慢性病患者骨骼肌功能影響的差異，以形成最佳運動康復(fù)方案。

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