白藜蘆醇對糖尿病腎病小鼠腎臟氧化應(yīng)激及腎組織Nrf2通路蛋白表達的影響

高絲娜，李英，遲雁青，劉翠紅，曹義甫

(1石家莊市第三醫(yī)院，石家莊050000；2河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥。近年來，DN的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，已成為終末期腎衰竭的主要原因之一。因此，明確DN的發(fā)病機制及有效的防治措施是當(dāng)前備受關(guān)注的研究熱點。大量研究表明，氧化應(yīng)激是DN的主要病理生理機制。核轉(zhuǎn)錄因子(NF)E2相關(guān)因子2(Nrf2)是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，是細(xì)胞抗氧化還原的中樞調(diào)節(jié)者，Nrf2通過與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)相互作用，即Nrf2/ARE通路在細(xì)胞的防御保護中發(fā)揮重要作用[1]。血紅素氧合酶1(HO-1)是受Nrf2調(diào)節(jié)的比較重要的一種抗氧化酶。白藜蘆醇是一種多酚類植物抗毒素，近年研究表明，白藜蘆醇可能通過抑制氧化應(yīng)激發(fā)揮對DN的保護作用。2018年，本研究旨在研究白藜蘆醇是否通過激活Nrf2通路來抑制DN的氧化應(yīng)激損傷，我們觀察了白藜蘆醇對DN小鼠腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)及Nrf2通路蛋白表達的影響，探討白藜蘆醇對DN小鼠腎臟的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 雄性CD-1小鼠100只，體質(zhì)量20～25 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma公司(S0130)；白藜蘆醇購自Sigma公司；兔抗Nrf2多克隆抗體及兔抗HO-1多克隆抗體購自Abcam公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司；丙二醛(MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；總超氧化物歧化酶(T-SOD)測定試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 動物分組及DN模型制備 采用單腎切除后STZ干預(yù)制備DN模型。將小鼠采用6%水合氯醛(0.6 mL/100 g)腹腔麻醉后行右腎切除術(shù)，2周后切口完全愈合。將小鼠隨機分為正常對照組、白藜蘆醇對照組、模型組、白藜蘆醇治療組4組，每組10只。模型組及白藜蘆醇治療組小鼠按140 mg/kg腹腔注射STZ(溶于0.1 mol枸櫞酸緩沖液中，pH為4.5)，72 h后尾尖取血測定血糖，以血糖≥16.7 mmol/L作為糖尿病模型成功的標(biāo)志。正常對照組與白藜蘆醇對照組注射等體積的枸櫞酸緩沖液。

1.3 干預(yù)方法 DN造模成功后，將白藜蘆醇溶于0.5%羧甲基纖維素制成混懸液，白藜蘆醇對照組與白藜蘆醇治療組給予白藜蘆醇5 mg/(kg·d)灌胃，正常對照組與模型組給予相同體積的羧甲基纖維素溶液灌胃，共干預(yù)8周。實驗期間動物自由進食、飲水，不使用胰島素及其他降糖藥物。

1.4 腎功能相關(guān)指標(biāo)檢測 造模成功后第8周，各組取6只小鼠，收集24 h尿液。股動脈取血，分離血清，用Olympus AU5400型自動生化分析儀檢測腎功能相關(guān)指標(biāo)，包括24 h尿蛋白定量(UP)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)。

1.5 腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 取10%腎皮質(zhì)勻漿100 μL，根據(jù)試劑說明書，采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量，硫代巴比妥酸法測定MDA含量。取1%腎組織勻漿30 μL，采用黃嘌呤氧化酶法測定T-SOD活性。

1.6 腎組織Nrf2、HO-1蛋白表達檢測

1.6.1 免疫組化染色法檢測 切取腎臟，取部分腎組織置于4%多聚甲醛固定，切片厚4 μm，常規(guī)脫蠟至水，高壓修復(fù)，用SP三步法。一抗為兔抗Nrf2多克隆抗體(1∶200稀釋)，兔抗HO-1多克隆抗體(1∶100稀釋)，用PBS代替一抗作為陰性對照。DAB顯色，顯微鏡下觀察并拍攝圖像。

1.6.2 Western blotting法檢測 取部分腎皮質(zhì)組織，提取總蛋白及核蛋白，Bradford法進行蛋白定量?？偟鞍咨蠘恿繛?00 μg，核蛋白上樣量為50 μg，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒壓電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，一抗封閉，Nrf2(1∶1 000)；HO-1(1∶2 000)，4 ℃過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(1∶4 000稀釋)，37 ℃孵育2 h，再次洗膜后ECL發(fā)光顯影。以β-actin作為內(nèi)參照，核蛋白以Histon-H1作為內(nèi)參照。Western印跡條帶信號強度應(yīng)用Image J2X軟件進行定量分析，測定各條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組腎功能相關(guān)指標(biāo)比較 與正常對照組比較，模型組UP、Scr、BUN均升高；與模型組比較，白藜蘆醇治療組UP、Scr、BUN均下降(P<0.01或0.05)。見表1。

表1 各組腎功能相關(guān)指標(biāo)比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05，#P<0.01；與模型組比較，△P<0.05。

2.2 各組腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 與正常對照組比較，模型組腎組織MDA含量增加、T-SOD活性降低(P均<0.01)；與模型組比較，白藜蘆醇治療組MDA含量降低、T-SOD活性升高(P均<0.05)。見表2。

表2 各組腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05，#P<0.01；與模型組比較，△P<0.05。

2.3 腎組織Nrf2及HO-1蛋白表達比較 ①免疫組化染色結(jié)果：Nrf2蛋白表達定位于腎小球固有細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒。在正常對照組及白藜蘆醇對照組僅見少量表達，腎小管表達更明顯。模型組Nrf2蛋白表達較正常對照組增強，白藜蘆醇治療組Nrf2蛋白表達較模型組進一步增加。HO-1蛋白主要定位于腎小球壁層上皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，模型組HO-1蛋白表達較正常對照組增強，白藜蘆醇治療組HO-1蛋白表達較模型組進一步增加。見圖1、2。②Western blotting結(jié)果：模型組腎組織Nrf2總蛋白、核蛋白及HO-1蛋白表達均高于正常對照組，白藜蘆醇治療組Nrf2總蛋白、核蛋白及HO-1蛋白表達均高于模型組(P均<0.01)。見圖3、4。

3 討論

越來越多的研究證明，氧化應(yīng)激是糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生的一個重要機制。在氧化應(yīng)激存在時，機體的抗氧化能力減弱，能清除活性氧簇(ROS)的抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)及過氧化氫酶(CAT)等的含量降低，導(dǎo)致ROS過度積聚。而過多的ROS能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如MDA，因此MDA可反映體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，并間接反映組織細(xì)胞氧化損傷的程度[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，模型組UP、Scr、BUN均升高，腎組織勻漿MDA含量增加、T-SOD活性降低，提示DN小鼠腎組織損傷，且MDA含量升高及T-SOD活力下降，表明DN小鼠腎臟組織中存在明顯的氧化應(yīng)激。

注：A為正常對照組，B為白藜蘆醇對照組，C為模型組，D為白藜蘆醇治療組。

注：A為正常對照組，B為白藜蘆醇對照組，C為模型組，D為白藜蘆醇治療組。

圖3 各組腎組織Nrf2及HO-1蛋白表達情況

注：與正常對照組比較，△P>0.05，#P<0.01；與模型組比較，*P<0.01。

當(dāng)出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷時，機體會形成一套復(fù)雜的氧化應(yīng)激應(yīng)答系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2和它的胞質(zhì)接頭蛋白Keap1是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的中樞調(diào)節(jié)者。Nrf2是外源性有毒物質(zhì)和氧化應(yīng)激的感受器，正常情況下，Nrf2和細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白Keap1結(jié)合成二聚體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)受到外界氧化應(yīng)激因子刺激后，Nrf2與Keap1解離并轉(zhuǎn)位進入細(xì)胞核，然后通過與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)元件ARE相互作用，誘導(dǎo)編碼抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達[3]，如γ-谷氨酸合成酶(γ-GCS)、苯醌還原酶(NQO1)、谷胱甘肽S2轉(zhuǎn)移酶(GST)、HO-1等[4]。Jiang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在DN患者的腎小球中存在氧化應(yīng)激且Nrf2水平增高；動物研究證實，Nrf2-/-小鼠與Nrf2+/+小鼠相比可產(chǎn)生更多的ROS，且出現(xiàn)更為嚴(yán)重的DNA氧化損傷和腎臟損傷，表明Nrf2對STZ誘發(fā)的腎臟損害具有重要的保護作用。

Nrf2誘導(dǎo)的下游抗氧化酶HO-1是血紅素降解反應(yīng)的限速酶，能催化血紅蛋白分子降解為等摩爾的膽綠素、CO和自由鐵，而這些降解產(chǎn)物能通過減少氧化應(yīng)激損傷、阻止細(xì)胞凋亡、對炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)等發(fā)揮細(xì)胞保護作用[6,7]。Lee等[8]研究表明，HO-1在糖尿病狀態(tài)下發(fā)揮重要的腎臟保護作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用誘導(dǎo)劑氯化亞錫上調(diào)STZ誘導(dǎo)的糖尿病的自發(fā)性高血壓大鼠HO-1的表達后，降低了腎皮質(zhì)的還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶活性和尿中8-羥基脫氧鳥嘌呤核苷(8-OHdG)、硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)的排泄[9]。這些結(jié)果表明，誘導(dǎo)HO-1的表達能減少腎臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組Nrf2、HO-1蛋白表達均高于正常對照組，提示機體在出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷時激發(fā)自身防御反應(yīng)，通過激活Nrf2通路增加HO-1的表達，進而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。

白藜蘆醇是一種多酚類植物抗毒素，隨著對白藜蘆醇研究的深入，發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、保肝、 抗過敏、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂、神經(jīng)保護等多種生物學(xué)作用[10]。其對心血管疾病和腎臟疾病均有保護作用。Chang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能降低DN時的血糖和血肌酐，減少氧化應(yīng)激損傷，抑制促炎癥細(xì)胞因子并上調(diào)腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)水平，這些可能均參與了對DN早期的保護作用。Ungvari等[12]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以激活冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)其目標(biāo)基因如NADPH、HO-1等的表達，同時改善了高糖引起的氧化應(yīng)激損傷，當(dāng)用siRNA抑制Nrf2的表達時，白藜蘆醇的保護作用是明顯減弱的，提示白藜蘆醇的保護作用很可能是通過激活Nrf2通路來實現(xiàn)的。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇治療組與模型組比較，MDA含量減少、T-SOD活性增加，同時Nrf2總蛋白與核蛋白及HO-1蛋白表達均增多，表明白藜蘆醇能減輕DN小鼠腎臟的氧化應(yīng)激損傷，而且可能是通過激活Nrf2通路來實現(xiàn)的。

綜上所述，白藜蘆醇對DN小鼠的腎組織具有保護作用，其機制可能是通過激活Nrf2通路、上調(diào)其下游的HO-1蛋白的表達，從而減少腎組織氧化應(yīng)激損傷，進而保護腎臟功能。本研究為白藜蘆醇應(yīng)用于臨床、延緩DN的進展提供了理論依據(jù)。