大衛(wèi)顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高△

李曉，王學(xué)方，張麗先，李飛飛，寧二娟，魏悅

1.河南省生物技術(shù)開(kāi)發(fā)中心，河南 鄭州 450002；2.河南省植物天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002

大衛(wèi)顆粒由連翹、黃芩、柴胡、金銀花、甘草、紫蘇葉6味中藥組成，收載于《中藥部頒標(biāo)準(zhǔn)》(第十冊(cè))，具有清熱解毒、疏風(fēng)透表之功效[1]。臨床主要用于感冒發(fā)燒、頭痛、咳嗽、鼻塞流涕、咽喉腫痛等癥，研究表明，大衛(wèi)顆粒治療小兒病毒性上呼吸道感染總有效率達(dá)92.4%，明顯優(yōu)于利巴韋林對(duì)照組(79.1%)[2]；此外，大衛(wèi)顆粒對(duì)妊娠期急性上呼吸道感染的臨床癥狀有明顯緩解、可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，總有效率為92.31%[3]。

但該制劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)較為落后，只收載了薄層鑒別法鑒別綠原酸和相關(guān)檢查項(xiàng)目，前期有文獻(xiàn)報(bào)道了大衛(wèi)顆粒中綠原酸、黃芩苷等成分的含量測(cè)定方法[4-5]，但是其全面的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究未見(jiàn)報(bào)道。大衛(wèi)顆粒已上市多年，臨床應(yīng)用量大[6]，尤其是在兒科[7]，故有必要加強(qiáng)其質(zhì)控方法和標(biāo)準(zhǔn)研究，保證其臨床療效與安全性。

為此，本研究對(duì)制劑中主要藥味連翹、金銀花、柴胡等進(jìn)行薄層色譜(TLC)鑒別，并對(duì)其中綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷的含量進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)測(cè)定，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津，CMA-20A系統(tǒng)、LC-20AT二元高壓泵、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱、SPD-M20A檢測(cè)器、LC Soulation工作站)；GoodSee-20E薄層色譜成像系統(tǒng)(上?？普苌萍加邢薰?；ME204型萬(wàn)分之一分析天平[托利多儀器(上海)有限公司]；AUW220D十萬(wàn)分之一分析天平(日本島津)。

1.2 試藥

大衛(wèi)顆粒(陜西興邦藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為：160902、161001、161101，規(guī)格：6 g/袋)；綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：110753-201415，純度96.2%)、黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)：110715-201619，純度93.5%)、連翹酯苷A對(duì)照品(批號(hào)：111810-201606，純度93.4%)、連翹苷對(duì)照品(批號(hào)：110821-201615，純度94.9%)、甘草苷對(duì)照品(批號(hào)：111610-201607，純度93.1%)、金銀花對(duì)照藥材(批號(hào)：121060-201608)、連翹對(duì)照藥材(批號(hào)：120908-201216)、柴胡對(duì)照藥材(批號(hào)：120992-201509)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；硅膠G薄層板、硅膠H薄層板(青島海洋化工廠)；乙腈為色譜純；水為屈臣氏純凈水；正丁醇、甲醇、三氯甲烷等其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 連翹 供試品溶液：取本品4 g，加60 mL水溶解，用40 mL水飽和的正丁醇振搖提取，重復(fù)操作3次，將正丁醇液合并，分取60 mL供柴胡鑒別用，剩余的正丁醇液減壓回收至干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，即得[8]。

對(duì)照藥材溶液：取連翹對(duì)照藥材0.5 g，加40 mL水，加熱微沸1 h，濾過(guò)，濾液按供試品溶液制備方法制備，即得。

對(duì)照品溶液：取連翹苷對(duì)照品10 mg，加甲醇制成0.5 mg·mL-1的溶液，即得。

陰性對(duì)照溶液：按大衛(wèi)顆粒處方取缺連翹的其他藥味，按其制劑工藝制備缺連翹的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備，即得。吸取上述4種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開(kāi)劑為三氯甲烷-甲醇按體積比5∶1配置，將薄層板展開(kāi)，取出，晾干，采用10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果陰性對(duì)照對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材、對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

注：1～3.供試品；D.對(duì)照藥材；S.對(duì)照品；Y.陰性對(duì)照。圖1 連翹的薄層色譜圖

2.1.2 金銀花 供試品溶液：取2 g本品，加15 mL甲醇，超聲處理20 min，用甲醇補(bǔ)足減失的溶劑量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

對(duì)照藥材溶液：取0.5 g金銀花對(duì)照藥材，加15 mL甲醇，按供試品溶液制備方法制成，即得。

對(duì)照品溶液：取綠原酸對(duì)照品10 mg，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的溶液，即得。

陰性對(duì)照溶液：按大衛(wèi)顆粒處方取缺金銀花的其他藥味，按其制劑工藝制備缺金銀花的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備，即得。

吸取上述4種溶液各6 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以乙酸丁酯-甲酸-水按體積比7∶2.5∶2.5配置，靜置，取上層溶液為展開(kāi)劑，將薄層板展開(kāi)，取出，晾干，置365 nm紫外光燈下檢視[9]。結(jié)果陰性對(duì)照對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材、對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，均顯藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

注：1～3.供試品；D.對(duì)照藥材；S.對(duì)照品；Y.陰性對(duì)照。圖2 金銀花的薄層色譜圖

2.1.3 柴胡 供試品溶液：取2.1.1中剩余的正丁醇液，加入等體積的氨試液洗滌，再用等體積正丁醇飽和的水洗滌，棄去水層，正丁醇液減壓回收至干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，即得。

對(duì)照藥材溶液：取柴胡對(duì)照藥材0.5 g，加40 mL水，加熱微沸1 h，濾過(guò)，濾液按供試品溶液制備方法制備，即得。

陰性對(duì)照溶液：按大衛(wèi)顆粒處方取缺柴胡的其他藥味，按其制劑工藝制備缺柴胡的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備，即得。吸取上述3種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開(kāi)劑為三氯甲烷-甲醇-水按體積比13∶7∶2配置后，在10 ℃以下放置的下層溶液，將薄層板展開(kāi)，取出，晾干，采用1%對(duì)二甲氨基苯甲醛的硫酸乙醇溶液(1→10)為顯色劑，在70 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰后30 min，置紫外光燈(365 nm)下檢視[10]，結(jié)果陰性對(duì)照對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，見(jiàn)圖3。

2.1.4 甘草 對(duì)照品溶液：取甘草苷對(duì)照品10 mg，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的溶液，即得。

陰性對(duì)照溶液：按大衛(wèi)顆粒處方取缺甘草的其他藥味，按其制劑工藝制備缺甘草的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備，即得。

吸取2.1.1項(xiàng)下的供試品溶液及上述兩種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開(kāi)劑以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水按體積比15∶1∶1∶2配置，將薄層板展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視[11]。結(jié)果陰性對(duì)照對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，見(jiàn)圖4。

注：1～3.供試品；D.對(duì)照藥材；Y.陰性對(duì)照。圖3 柴胡的薄層色譜圖

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～15 min，13%A，87%B；15～20 min，13%～15%A，87%～85%B；20～28 min，15%A，85%B；28 min～38 min，15%～35%A，85%～65%B；3～50 min，35%A，65%B)[12]；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。在上述色譜條件下，待測(cè)成分分離良好，分離度>1.5。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 取綠原酸13.70 mg、連翹酯苷A 14.80 mg、黃芩苷17.04 mg，精密稱(chēng)量，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇適量使溶解，再加50%甲醇至刻度，搖勻，即得(臨用新制)。

2.2.3 制備供試品溶液 取本品適量，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱(chēng)定，置100 mL容量瓶中，加50%甲醇適量，超聲處理20 min，放冷，再加50%甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 按大衛(wèi)顆粒處方取缺金銀花、連翹、黃芩的其他藥味，按其制劑工藝制備陰性樣品，并按2.2.3供試品溶液制備方法制備，制成陰性對(duì)照溶液。分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各適量，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖5。結(jié)果，供試品中綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷對(duì)照品在相同保留時(shí)間處有相同色譜峰，并與其他組分峰基線(xiàn)分離較好，且相應(yīng)的陰性對(duì)照不出峰。表明該方法可以用于該制劑中3種成分的測(cè)定。

注：A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.綠原酸；2.連翹酯苷A；3.黃芩苷。圖5 大衛(wèi)顆粒的高效液相色譜圖

2.2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.8、1.0、1.5、2.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容制成系列對(duì)照品溶液。在2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以待測(cè)成分濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得綠原酸回歸方程：Y=31 859.2X-30 585，r=0.999 8；連翹酯苷A回歸方程：Y=777 875X-3316，r=0.999 9；黃芩苷回歸方程：Y=36 127.9X+839.84，r=0.999 9；結(jié)果表明，綠原酸在5.228～52.28 μg·mL-1，連翹酯苷A在5.92～59.20 μg·mL-1，黃芩苷在6.816～68.16 μg·mL-1與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2.6 進(jìn)樣精密度 取2.2.3項(xiàng)下供試品溶液(批號(hào)：160901)，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積并計(jì)算綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷含量。結(jié)果3種成分的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.9、5.0、7.2 mg·g-1，峰面積RSD分別為1.10%、0.76%、1.28%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批樣品(批號(hào)：160901)適量，共6份，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷含量。結(jié)果3種成分的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.9、4.9、7.2 mg·g-1，峰面積RSD分別為1.62%、1.83%、1.38%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.3項(xiàng)下供試品溶液(批號(hào)：160901)，分別于制備后 0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷含量。結(jié)果3種成分的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.8、4.9、7.2 mg·g-1，峰面積RSD分別為0.96%、1.25%、0.84%，表明供試品溶液室溫放置24 h穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批樣品(批號(hào)：160901)適量，共6份，分別加入實(shí)際質(zhì)量濃度為105.84 μg·mL-1綠原酸對(duì)照品溶液2 mL，276.46 μg·mL-1連翹酯苷A對(duì)照品溶液2 mL，254.37 μg·mL-1黃芩苷對(duì)照品溶液3 mL，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.10 含量測(cè)定 取3批本品各適量，分別按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3) mg·g-1

3 討論

在TCL鑒別中，原標(biāo)準(zhǔn)中僅收載了綠原酸的薄層鑒別方法，本研究在此基礎(chǔ)上，對(duì)處方中6味藥材的TCL鑒別方法均進(jìn)行了研究，其中黃芩薄層鑒別中，采用對(duì)照藥材作對(duì)照，陰性樣品有干擾，采用黃芩苷對(duì)照品作為對(duì)照無(wú)干擾，但考慮到含量測(cè)定中對(duì)制劑中黃芩苷的含量進(jìn)行測(cè)定，故本研究未收載黃芩的薄層鑒別，另外紫蘇葉的薄層鑒別中陰性樣品對(duì)鑒別有干擾，未能建立較好的TCL鑒別方法。綜上，通過(guò)研究最終建立了大衛(wèi)顆粒中連翹、金銀花、柴胡、甘草的TLC鑒別方法。同時(shí)，為了考察TLC系統(tǒng)的耐用性，實(shí)驗(yàn)中對(duì)不同溫度(4、25、35 ℃)、不同廠家薄層板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，TLC圖斑點(diǎn)清晰，分離度好，陰性對(duì)照均無(wú)干擾。

根據(jù)中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究要求，復(fù)方中藥含量測(cè)定方法中，應(yīng)首選君臣藥、貴重藥、毒性藥，不建議選取含量較低成分。連翹、金銀花為大衛(wèi)顆粒的君藥，綠原酸為金銀花中的主要功效成分，可作為大衛(wèi)顆粒的質(zhì)量控制性成分，連翹中的主要成分有連翹苷、連翹酯苷等，現(xiàn)有大部分連翹制劑多測(cè)定其連翹苷含量，但大量研究表明，連翹酯苷是連翹發(fā)揮抗菌、抗病毒等作用的主要功能成分[13]，且連翹中連翹酯苷的含量遠(yuǎn)高于連翹苷[14-15]，所以本研究將連翹酯苷A也作為大衛(wèi)顆粒的質(zhì)量控制性成分之一。另外，黃芩藥材中指標(biāo)性成分黃芩苷含量較高(≥9.0%)，且黃芩苷常作為黃芩相關(guān)制劑的含量測(cè)定成分[16]。綜上，本研究選擇綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷作為大衛(wèi)顆粒的質(zhì)量控制性成分，并采用高效液相法對(duì)3種成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定。

含量測(cè)定方法耐用性研究中，我們考察了不同廠家、不同品牌的3種色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex Luna 5u C18(2)(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)對(duì)制劑中綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷成分的分離情況，3種色譜柱對(duì)測(cè)定成分的分離均較好；另外實(shí)驗(yàn)中還考察了流動(dòng)相的不同酸度(甲醇-0.1%、0.2%、0.3%磷酸水、乙腈-0.2%、0.5%、0.8%醋酸水溶液)、不同柱溫(30、35、40 ℃)對(duì)分離效果的影響，結(jié)果表明，流動(dòng)相pH值與柱溫在一定的范圍內(nèi)波動(dòng)，對(duì)成分的測(cè)定無(wú)影響，說(shuō)明該方法耐用性良好。

綜上，本研究所建立的標(biāo)準(zhǔn)可用于大衛(wèi)顆粒的質(zhì)量控制，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供參考。