毛蕊花苷對(duì)大鼠遞增大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)下骨骼肌損傷的保護(hù)作用研究

朱洪竹 朱梅菊 蔡榮興 張崇林 彭勇 伍人樂(lè)

摘 要：目的：研究毛蕊花苷對(duì)遞增大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌損傷的保護(hù)作用。方法：SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC）、單純運(yùn)動(dòng)組（SE）、運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷低劑量組（EVL）、運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷中劑量組（EVM）、運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷高劑量組（EVH）。采用遞增大強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)疲勞模型。實(shí)驗(yàn)?zāi)⊙凸趋兰z測(cè)各組大鼠血清CK酶活性和骨骼肌氧化應(yīng)激指標(biāo)及HSP70蛋白表達(dá)量，并用光學(xué)顯微鏡觀察骨骼肌微細(xì)結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果：1）與SE組相比，毛蕊花苷各劑量組明顯減少了運(yùn)動(dòng)引起的血清CK活性的上升（P<0.05或P<0.01），減輕了運(yùn)動(dòng)所致的骨骼肌微細(xì)結(jié)構(gòu)的異常，且EVH組的效果要好于EVL組和EVM組。2）與SE組相比，毛蕊花苷各劑量組顯著抑制了運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的大鼠骨骼肌的氧化應(yīng)激水平（P<0.05或P<0.01），其中EVH組抗氧化損傷的效果要好于EVL組和EVM組。3）與SE組相比，毛蕊花苷劑量組進(jìn)一步誘導(dǎo)了運(yùn)動(dòng)引起的HSP70的高表達(dá)（P<0.05或P<0.01），其中以EVH組的蛋白表達(dá)增加更為顯著（P<0.05）。結(jié)論：毛蕊花苷對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌損傷有良好的改善作用，顯示出毛蕊花苷有明顯抗骨骼肌氧化應(yīng)激和減輕運(yùn)動(dòng)性骨骼肌微細(xì)結(jié)構(gòu)損傷的保護(hù)作用，其中高劑量補(bǔ)充組的改善效果要優(yōu)于其他劑量組，這可能與其能更好地誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌內(nèi)源性保護(hù)蛋白（HSP70）表達(dá)以發(fā)揮HSP70保護(hù)效應(yīng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：毛蕊花苷;HSP70;氧化應(yīng)激;骨骼肌損傷;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

中圖分類號(hào)：G804.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006-2076（2019）01-0053-05

過(guò)度運(yùn)動(dòng)或大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練會(huì)引起疲勞，常常會(huì)造成骨骼肌損傷，嚴(yán)重影響運(yùn)動(dòng)員的運(yùn)動(dòng)成績(jī)和身心健康，而運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷目前臨床上尚缺乏有效的防治措施。毛蕊花苷是馬先蒿屬植物的特征性成分之一[1]，屬于苯丙素苷類化合物，該類化合物具有明顯的體外抗骨骼肌疲勞、改善運(yùn)動(dòng)小鼠心肌等組織脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的作用[2]。但目前有關(guān)毛蕊花苷對(duì)運(yùn)動(dòng)所引起的骨骼肌損傷的保護(hù)作用研究很少見。熱休克蛋白70（heat shock protein，HSP70）是一種在高溫、炎癥、運(yùn)動(dòng)損傷等應(yīng)激條件下誘導(dǎo)高表達(dá)的內(nèi)源性保護(hù)蛋白[3-4]，與運(yùn)動(dòng)關(guān)系密切。近年HSP70已成為較受關(guān)注的骨骼肌內(nèi)源性保護(hù)途徑之一。毛蕊花苷能否依賴其對(duì)HSP70的調(diào)節(jié)發(fā)揮抗骨骼肌損傷的作用，目前研究尚不清楚。本研究擬通過(guò)建立遞增大強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)疲勞模型，觀察毛蕊花苷對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠血清酶活性的改變、骨骼肌微細(xì)結(jié)構(gòu)變化、氧化應(yīng)激指標(biāo)及HSP70表達(dá)的影響，為毛蕊花苷作為一種有效的、純天然的抗骨骼肌損傷的防治方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

68只體質(zhì)量（160±20）g的雄性SPF級(jí)SD大鼠，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司（SCXK（湘）2011-0003），置于室溫（23±0.5）℃，濕度40%～60%的環(huán)境下飼養(yǎng)。適應(yīng)3天后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC）、單純運(yùn)動(dòng)組（SE）、運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷低劑量組（EVL）、運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷中劑量組（EVM）、運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷高劑量組（EVH），共5組，除NC組8只外，其余均15只。分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水。

1.2 藥物灌胃處理

毛蕊花苷，純度99%，購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。藥物劑量換算參照文獻(xiàn)[5]，臨用前用生理鹽水混懸，配成相應(yīng)濃度的藥液。運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷低、中、高劑量組（EVL、EVM、EVH），分別按1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg，每天灌胃毛蕊花苷，灌胃體積2 ml/只。正常對(duì)照組和單純運(yùn)動(dòng)組用等體積的生理鹽水灌胃。1次/天，連續(xù)灌胃3周，每次在訓(xùn)練前2 h內(nèi)進(jìn)行。

1.3 運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案

跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)方式是參照文獻(xiàn)[6-7]方法并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)后改良的。除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠在坡度為0°的ZH-PT動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)（安徽淮北正華）上進(jìn)行遞增負(fù)荷強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，并采用聲、光、電刺激對(duì)消極跑動(dòng)或者不跑的大鼠進(jìn)行驅(qū)趕。每天觀察并記錄大鼠的一般情況。正常對(duì)照組大鼠以同樣的條件常規(guī)喂養(yǎng)，自由活動(dòng)，但不施加跑臺(tái)訓(xùn)練干預(yù)。訓(xùn)練時(shí)間3周，7天/周，每天1次（具體見表1）。

1.4 主要試劑

免抗鼠HSP70為多克隆抗體，購(gòu)于武漢博士德生物工程公司。CK、T-SOD、GSH-Px、MDA及考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物有限公司，并嚴(yán)格按測(cè)試盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.5 動(dòng)物取材與指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 動(dòng)物取材

末次訓(xùn)練結(jié)束后，大鼠稱重，用10%水合氯醛（0.4 ml/100 g）對(duì)大鼠腹腔麻醉，心臟采血，分離血清，待測(cè)CK活性。冰浴上分離腓腸肌組織，生理鹽水漂洗濾紙吸干后，標(biāo)記分裝，一份置10%甲醛溶液中固定作光鏡標(biāo)本，另一份置液氮中保存，用作HSP70蛋白表達(dá)檢測(cè)。

1.5.2 指標(biāo)檢測(cè)與方法

1）骨骼肌HE染色切片制備及觀察 固定后的樣品按常規(guī)方法制備石蠟切片，在BX41型光學(xué)顯微鏡（日本，OLYMPUS公司）下，觀察骨骼肌肌纖維、小血管、肌外膜及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等結(jié)構(gòu)的改變。

2）血清CK活性、骨骼肌T-SOD活性、GSH-Px活性、MDA含量 采用生化法（德國(guó)，ECOM-F1624型半自動(dòng)生化分析儀）。

3）HSP70 Western-blotting檢測(cè) 取冷凍腓腸肌組織100 mg加入PIPA裂解緩沖液，勻漿、12 000 rpm離心30 min（4℃）、取上清。取少量上清液進(jìn)行BCA法總蛋白定量。按常規(guī)方法上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、加一抗（抗體工作濃度為1：500）、二抗后，再依次洗膜、顯影、定影、掃描。用EC3凝膠電泳成像分析軟件（America）系統(tǒng)記錄每條蛋白電泳帶的灰度值，進(jìn)行定量分析。GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算各組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。多組間差異比較用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

正常對(duì)照組（NC）大鼠表現(xiàn)活躍，兩眼有神，神態(tài)安祥;單純運(yùn)動(dòng)組（SE）大鼠運(yùn)動(dòng)后表現(xiàn)為兩眼無(wú)神，活動(dòng)次數(shù)降低，遲鈍、逃避反應(yīng)能力差，毛發(fā)稀少無(wú)光澤等神疲癥狀;毛蕊花苷各劑量組上述疲勞癥狀明顯減輕。

2.2 各組大鼠血清CK活性、骨骼肌T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量的變化

與NC組相比，SE組和毛蕊花苷各劑量干預(yù)組（EVL、EVM、EVH）血清CK活性均有升高（均P<0.01）;與SE組相比，EVL、EVM、EVH各干預(yù)組血清CK活性均有降低（P<0.05或P<0.01），其中EVH組降低最為明顯且低于EVL組（P<0.05）（見表2）。

與NC組相比，SE組和毛蕊花苷各劑量干預(yù)組（EVL、EVM、EVH）骨骼肌T-SOD、GSH-Px活性均有下降（P<0.05或P<0.01）;與SE組相比，EVL、EVM、EVH干預(yù)各組兩指標(biāo)均有增加，其中EVH組增加尤為明顯（P<0.01），且GSH-Px活性顯著高于EVL組（P<0.01）。而MDA含量則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)：EVL、EVM、EVH各干預(yù)組均低于SE組（P<0.05或P<0.01），以EVH組降低最為明顯，且低于EVL組（P<0.05）（見表2）。

2.3 光鏡觀察結(jié)果

光鏡下，正常對(duì)照組骨骼肌細(xì)胞肌纖維排列整齊，多核，肌膜下可見肌細(xì)胞核呈扁橢圓形且分布均勻;單純運(yùn)動(dòng)組（即本實(shí)驗(yàn)的運(yùn)動(dòng)模型組）部分肌纖維有腫脹、扭曲、節(jié)段性斷裂和溶解甚至消失等損傷現(xiàn)象;運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷各劑量組肌纖維排列漸趨整齊，部分肌纖維扭曲、斷裂損傷等現(xiàn)象較運(yùn)動(dòng)模型組均有減輕，其中尤以高劑量組改善效果最好。

2.4 各組大鼠骨骼肌HSP70蛋白表達(dá)的變化

NC組可見少量的HSP70蛋白表達(dá)，模型運(yùn)動(dòng)SE組HSP70的蛋白表達(dá)量較NC組明顯增加（P<0.01）。運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷各劑量組HSP70蛋白表達(dá)明顯高于SE組（P<0.05或P<0.01），其中高劑量補(bǔ)充的EVH組增加更為顯著，且分別高于中、低劑量補(bǔ)充的EVM組和EVL組（均P<0.01）。

3 討論

運(yùn)動(dòng)引起骨骼肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，導(dǎo)致骨骼肌肌肉損傷，血清肌酸肌酶（Creatine Kinase，CK）會(huì)增加[8]。血清CK活性是間接反映骨骼肌損傷的一個(gè)敏感指標(biāo)，且與肌損傷程度呈正相關(guān)[9-10]。本研究結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)后CK酶活性的顯著增加，且高出正常水平的近3倍，提示本研究的遞增強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起了大鼠骨骼肌的損傷。此外，HE染色病理切片同時(shí)顯示單純運(yùn)動(dòng)SE組骨骼肌出現(xiàn)了肌纖維排列異常，節(jié)段性斷裂損傷、溶解甚至消失等病理現(xiàn)象，從形態(tài)學(xué)方面進(jìn)一步佐證了骨骼肌損傷這一特征。過(guò)度運(yùn)動(dòng)或大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體受損，誘發(fā)骨骼肌纖維微細(xì)結(jié)構(gòu)損傷，并引起HSP70高表達(dá)[11-12]。有研究顯示，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)HSP70表達(dá)的增加與運(yùn)動(dòng)負(fù)荷大小和運(yùn)動(dòng)周期有關(guān)，大鼠心肌HSP70的表達(dá)只有在跑速達(dá)到或超過(guò)24 m/min時(shí)才增加[8]。本研究采用3周遞增大強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)疲勞模型[13]，通過(guò)檢測(cè)運(yùn)動(dòng)大鼠HSP70表達(dá)，發(fā)現(xiàn)模型運(yùn)動(dòng)SE組大鼠骨骼肌HSP70被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，這是由于運(yùn)動(dòng)引起的高溫、機(jī)械應(yīng)力、運(yùn)動(dòng)損傷、自由基生成、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高等應(yīng)激因素引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能改變和蛋白質(zhì)變性損傷，誘導(dǎo)了HSP70的表達(dá)上調(diào)[14-16]。HSP70的表達(dá)量越大，說(shuō)明機(jī)體損傷越嚴(yán)重，應(yīng)激反應(yīng)越劇烈，與先前研究相類似[17]。

本研究結(jié)果同時(shí)顯示，SE組大鼠骨骼肌脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物-丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量明顯上升，高于NC組，而總超氧化物歧化酶（Total Superoxide Dismutase，T-SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）活性則降低，提示運(yùn)動(dòng)大鼠抗氧化能力降低，機(jī)體自由基生成增加，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)。這可能與長(zhǎng)時(shí)間的大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起的骨骼肌耗氧量增加，機(jī)體處于相對(duì)缺血缺氧狀態(tài)有關(guān)。機(jī)體缺血缺氧產(chǎn)生的過(guò)多氧自由基通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)使肌細(xì)胞膜發(fā)生過(guò)氧化損傷，骨骼肌受損，進(jìn)而誘導(dǎo)HSP70高表達(dá)[18]。HSP70是一種重要的應(yīng)激蛋白，是細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的、強(qiáng)有力的、內(nèi)源性保護(hù)途徑[19]。隨著3周遞增強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)產(chǎn)生HSP70的累積，HSP70可能與運(yùn)動(dòng)應(yīng)激后細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的損傷蛋白質(zhì)結(jié)合，發(fā)揮其分子伴侶功能，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[20]。這是機(jī)體應(yīng)激后產(chǎn)生的一種內(nèi)源性骨骼肌保護(hù)作用機(jī)制[21]，其具體機(jī)制尚待闡明。

HSP70是一種重要的分子伴侶，其骨骼肌保護(hù)作用已被實(shí)驗(yàn)研究所證實(shí)[8，11]。HSP70已成為較受關(guān)注的骨骼肌內(nèi)源性保護(hù)途徑之一。毛蕊花苷屬于苯丙素苷類化合物，抗氧化作用是該類化合物的主要活性之一[22];其清除氧自由基和抗氧化損傷的能力可能依賴于分子中羥基的數(shù)目;毛蕊花苷有兩個(gè)相同的苯酚環(huán)，其中每個(gè)苯酚環(huán)上均有兩個(gè)鄰位羥基，分子中羥基的數(shù)目越多，抗氧化損傷的能力就越強(qiáng)[23]。研究已表明毛蕊花苷有抗運(yùn)動(dòng)小鼠疲勞和抗骨骼肌線粒體氧化應(yīng)激損傷等作用，毛蕊花苷對(duì)骨骼肌的保護(hù)作用能否依賴其對(duì)HSP70的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)，目前尚不明確。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充毛蕊花苷后，各劑量組的HSP70蛋白表達(dá)明顯高于未補(bǔ)充藥物的運(yùn)動(dòng)模型SE組，其中以高劑量補(bǔ)充的EVH組增加更為明顯，說(shuō)明毛蕊花苷有進(jìn)一步上調(diào)遞增運(yùn)動(dòng)引起的骨骼肌HSP70高表達(dá)的作用，且其蛋白表達(dá)量與毛蕊花苷呈劑量依賴關(guān)系;同時(shí)骨骼肌抗氧化酶（T-SOD和GSH-Px）活性也顯著高于SE組，而MDA含量則明顯降低，血清CK活性明顯下降，骨骼肌微細(xì)結(jié)構(gòu)損傷有所好轉(zhuǎn)，大鼠疲勞癥狀有所改善，且高劑量毛蕊花苷補(bǔ)充組的效果要好于其他劑量組。提示，毛蕊花苷有可能通過(guò)誘導(dǎo)HSP70高表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)損傷蛋白的修復(fù)作用而發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。研究表明，誘導(dǎo)型HSP70可減輕氧化應(yīng)激所致的心肌損傷，HSP70對(duì)組織缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能是通過(guò)抗氧化酶（Mn-SOD）的增加來(lái)實(shí)現(xiàn)減少自由基對(duì)機(jī)體的損害[24]。以上表明毛蕊花苷提高運(yùn)動(dòng)大鼠抗氧化能力，減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物對(duì)骨骼肌的損傷，保護(hù)骨骼肌功能，其抗運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷的作用有可能是通過(guò)內(nèi)源性保護(hù)蛋白（HSP70）所介導(dǎo)。此外，毛蕊花苷還能通過(guò)提高運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP 酶活性，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)，有較明顯的抗運(yùn)動(dòng)疲勞和提高大鼠運(yùn)動(dòng)能力作用[13]。毛蕊花苷與骨骼肌損傷的關(guān)系還待進(jìn)一步研究。通過(guò)有針對(duì)性地補(bǔ)充外源性藥物活性成分或運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑，誘導(dǎo)內(nèi)源性保護(hù)蛋白（HSP70）的合理表達(dá)，調(diào)動(dòng)機(jī)體內(nèi)源性自我保護(hù)機(jī)制[12]，可以減輕運(yùn)動(dòng)所引起的骨骼肌損傷。也提示通過(guò)補(bǔ)充毛蕊花苷提高HSP70表達(dá)以發(fā)揮HSP70的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)成為可能。

4 小結(jié)

遞增強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可引起骨骼肌損傷，補(bǔ)充毛蕊花苷后對(duì)機(jī)體有良好的保護(hù)作用，且高劑量組的效果要好于其他劑量組，其機(jī)理可能是毛蕊花苷能較好地上調(diào)運(yùn)動(dòng)引起的骨骼肌內(nèi)源性保護(hù)蛋白（HSP70）高表達(dá)，提高骨骼肌抗氧化能力，減少大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體造成的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。

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