牛源金黃色葡萄球菌凝固酶分型與致病因子檢測

徐 結，侯 曉，張雪婧，蒲萬霞

(中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所/新獸藥重點開放實驗室/甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅 蘭州 730050)

奶牛乳房炎(Bovinemastitis)的防控一直都被公認為是世界性難題，它不僅使牛的產奶量下降，還影響牛奶的品質，嚴重影響奶牛的健康和生產性能，給乳源安全與公共衛(wèi)生帶來隱患，嚴重威脅人類的健康[1]。在奶牛乳房炎的病原中，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)一直均有較高的檢出率，是導致奶牛乳房炎的主要病原菌之一[2]。由于S.aureus所引起的感染較難控制，危害性大，傳播廣，而且其能夠產生多種致病因子，如腸毒素、血漿凝固酶、白細胞毒素、表皮剝脫毒素和溶血素等，這些致病因子還是引起奶牛乳房炎、人類尿路感染、心內膜炎、敗血癥、腹膜炎、骨關節(jié)疾病等各種疾病的致病原因[3]。因此很有必要對S.aureus進行準確的致病因子檢測與分型研究，實時掌握其可能存在的流行特點，為臨床合理用藥和乳房炎的防控提供依據。

血漿凝固酶是S.aureus所特有的致病因子，能夠保護其免于機體吞噬細胞的清除作用，臨床上也常用來作為S.aureus的檢測標識物[4]，而且是作為檢測致病性S.aureus的標識物[5]。Goh等在研究S.aureus凝固酶時發(fā)現，凝固酶編碼的凝固酶基因(Coa)在3'末端有一系列堿基重復序列，長度約為81 bp，不同基因型的S.aureus中其重復序列的數目也不同，通過設計特異性引物PCR擴增Coa基因，根據擴增產物片段大小進行基因分型；同時采用限制酶AluⅠ對PCR產物進行酶切，由于其酶切位點的差異性，Coa基因3'末端重復序列的可變區(qū)顯示多態(tài)性，所以可以根據酶切片段的多態(tài)性來進行二次分型，用來彌補Coa基因分型精準度不足的缺點[6]。采用Coa基因分型可以很大程度上提高對S.aureus的檢測效率，而且該基因分型操作簡單，重復性好，可以用于S.aureus的流行病學分析[7]。本研究首次對青海和甘肅地區(qū)35株奶牛乳房炎臨床分離的S.aureus進行Coa基因分型與主要致病因子的檢測，并分析基因型與致病因子之間的關系，為奶牛乳房炎的防控提供可靠的流行病學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品與主要試劑 本研究所用210份奶樣來自青海和甘肅地區(qū)的2個大型奶牛養(yǎng)殖場，其中青海地區(qū)96份奶樣，甘肅地區(qū)114份奶樣，利用滅菌采樣管采集乳樣，對奶牛的4個乳區(qū)及采樣人員手臂嚴格消毒，棄去前兩把奶，每頭牛采集2份樣品。Coa基因陽性S.aureus標準菌株CVCC2246和Coa基因陰性表皮葡萄球菌標準菌株CMCC(B)2606購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

A luⅠ、蛋白酶K和LaTaqDNA聚合酶購自TaKaRa公司；溶菌酶(Lysostaphin)購自Sigma公司；Mueller-Hinton肉湯與固體以及甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；生化鑒定微量發(fā)酵管購自蘭州榮昌微生物試劑公司；腦心浸出液(BHI)培養(yǎng)基購自北京賽百奧科技有限公司；瓊脂糖購自生工生物工程(上海)有限公司；基因組提取試劑盒購自天根(TIANGEN)生化科技有限公司。

1.2 細菌的分離鑒定 將采集的210份奶樣分別取100μL均勻涂布于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)22 h。挑取紅色菌落，接種于BHI液體培養(yǎng)基，然后劃線于MH固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)。挑選菌落形態(tài)和鏡檢結果與標準S.aureus特征相一致的菌株，進行后續(xù)鑒定。

1.3 分離菌株Coa基因的PCR擴增 采用倪春霞等[8]設計的特異性引物Coa F：5'-ACCACAAGGTA CTGAATCAACG-3'/Coa R：5'-TGCTTTCGATTGTTC GATGC-3'(由北京華大基因科技公司合成)，以提取的S.aureus的基因組為模板進行Coa基因的擴增，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4Coa基因的AluI酶切分析 根據文獻[6]和限制酶說明書對S.aureus的分離株進行AluⅠ酶切反應。利用Coa基因多態(tài)性分型的區(qū)分系數[9](The numerical index of discrimination)對分離株的分型方法進行評估，通過得到的數值來判定分型方法的區(qū)分力度。公式如下：

D=區(qū)分系數；N=分型的分離株總數；s=分型數；ni=i型中分離株的數量

1.5 分離菌株致病因子的檢測 以分離株的基因組DNA為模板，利用4種致病因子引物[10]對分離株進行α溶血素基因、β溶血素基因、LuKF(白細胞毒素F基因)、LuKS(白細胞毒素S基因)PCR擴增。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與討論

2.1 細菌的分離與鑒定結果 通過分離培養(yǎng)、生化鑒定，結果210份奶樣中共分離得到35株S.aureus，其中甘肅地區(qū)共分離出22株S.aureus(22/114，19.3%)，青海地區(qū)共分離出13株S.aureus(13/96，13.5%)。表明，甘肅、青海兩地奶樣中S.aureus的分離率較低，且前者的分離率略高于后者。

2.2Coa基因的PCR擴增與酶切分析結果 自Goh等發(fā)現Coa基因可以用于對S.aureus分型以來，由于Coa基因分型方法操作簡單，重復性好，費用低，全世界許多地區(qū)均采用此方法對S.aureus的基因多態(tài)性進行分型[6]。在我國，朱戰(zhàn)波等在2007年就首先對黑龍江奶牛養(yǎng)殖場分離出來的26株S.aureus進行了Coa基因分型[11]。本實驗以分離株的基因組為模板，利用Coa基因引物進行PCR的擴增。結果顯示，35株S.aureus共擴增出5種PCR型(圖1)。除PCR 1型僅存在于甘肅地區(qū)外，其它4種PCR型在兩地均有檢出，片段長度為800 bp的PCR 3型的分離株在兩地區(qū)的數量最多，是這兩個地區(qū)主要流行基因型，這表明可能由于這兩個地區(qū)相距較近，而且經常性的交流與溝通，造成不同基因型S.aureus在兩個地區(qū)相互傳播。

圖1 Coa基因的PCR鑒定Fig.1 Identification of coagulase genotype by PCR

2.3Coa基因的AluⅠ酶切分析Coa基因擴增的5種PCR型經過A luⅠ消化后共得到了8種不同的型/亞型。PCR 2型有3種不同的酶切結果，即亞型Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ(圖2)，其中亞型Ⅰ僅存在于甘肅地區(qū)，亞型Ⅱ僅存在于青海地區(qū)，亞型Ⅲ在兩地均存在；PCR 3型有2種不同的酶切結果，即亞型Ⅳ和Ⅴ，這兩種亞型在青海和甘肅地區(qū)均存在且分布最多。其余3種PCR型均分別僅有1種酶切結果，不分亞型。結果表明，青海和甘肅兩地區(qū)分離株PCR型的分布雖然有稍許差異，但在兩地區(qū)卻均廣泛分布。

圖2 Coa基因亞型的AluⅠ酶切鑒定Fig.2 Subtype identification of coagulase gene digested by AluⅠ

Coa基因的PCR產物經A luⅠ酶切出現了同種PCR型不同的酶切亞型，反應了這兩個地區(qū)菌株流行具有頻繁和廣泛的特征，呈現出地方流行性的現象，這可能與地區(qū)的環(huán)境條件有關。其余PCR型均僅有一種酶切產物，只有一種亞型。本實驗中35株S.aureus均能夠通過Coa基因進行多態(tài)性分型，其分離株區(qū)分系數為0.821，這個數值超過80%，表明Coa基因分型的方法區(qū)分力度好，適合于S.aureus的基因分型。這一結果與Elizabete[12]的報道稍有不同，可能與S.aureus的地方流行性差異有關。

2.4 致病因子在基因型中的分布 以各S.aureus基因組為模板，PCR檢測其致病因子。結果顯示，LukS和α溶血素在所有的S.aureus中均存在，致病因子LukF和β溶血素檢出率也較高，分別是30株(85.7%)和31株(88.6%)，其中致病基因β溶血素在甘肅地區(qū)檢出率為95.5%(21/22)，青海地區(qū)檢出率為76.9%(10/13)，致病因子LukF在甘肅地區(qū)檢出率為91.0%(20/22)，青海地區(qū)檢出率為76.9%(10/13)。致病因子在青海和甘肅地區(qū)均主要存在于PCR 3型的Ⅳ和Ⅴ亞型中(表1)。表明，甘肅地區(qū)致病因子LukF和β溶血素的檢出率均高于青海地區(qū)，且各致病因子廣泛分布于各基因型的菌株中。

表1 S.aureaus致病因子與其各PCR型分布情況Table 1 The comparison between virulence and genetype of S.aureus

致病因子溶血素和白細胞毒素是大多數致病性葡萄球菌產生的能夠抵抗宿主免疫吞噬的，能夠增強病原菌入侵宿主細胞能力的活性物質[13]。本研究顯示4種致病因子主要存在于S.aureusPCR 3型的流行菌株中，在其2種Coa基因亞型中均有分布，這一結果表明該4種致病因子可能在奶牛乳房炎的發(fā)病過程中起到重要的作用，甘肅地區(qū)葡萄球菌總的致病因子檢出率高于青海地區(qū)。

本研究結果顯示甘肅地區(qū)牛源S.aureus的分離率略高于青海地區(qū)，所有分離株均能夠擴增出Coa基因片段，PCR 3型是青海和甘肅地區(qū)主要流行的基因型。35株S.aureus均含有致病因子LukS和α溶血素，致病因子LukF和β溶血素檢出率也很高。致病因子普遍存在于S.aureus中，這可能是該菌引起奶牛乳房炎的主要誘因，值得關注。