幾種不同的化學(xué)預(yù)處理方法對甜高粱稈酶解糖化效果的影響

孫于慶,周 芳，康 靜,馮 沖*

(1.鄭州工程技術(shù)學(xué)院 化工食品學(xué)院，河南 鄭州 450044；2.鄭州市食品藥品監(jiān)督管理局，河南 鄭州 450006；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

甜高粱是具有高光合作用能力、高還原糖得率和生物量的能源作物，也是唯一能夠同時產(chǎn)出糧食、糖和生物質(zhì)的作物[1]。甜高粱不僅光合效率高，而且對種植環(huán)境具有很強(qiáng)的適應(yīng)性和抗逆性，在種植過程中，具有需求肥料量低、用水效率較高、生長周期較短等優(yōu)點，是適合大面積推廣種植的能源作物[2-6]。目前對于甜高粱的研究熱點集中在從甜高粱秸稈中制取可發(fā)酵單糖。甜高粱秸稈經(jīng)過水解糖化后可直接發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇，是一種極具潛力的可再生生物質(zhì)資源[7-10]。研究發(fā)現(xiàn)，甜高粱秸稈的主要成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。木質(zhì)素填充于纖維素和半纖維素之間，通過氫鍵和共價鍵與糖類聚合物連接在一起[11-13]，這種結(jié)構(gòu)嚴(yán)重阻礙了纖維素的降解，合適的預(yù)處理過程是打破這種抗性的有效手段。雖然通過一系列的物理、化學(xué)以及生物過程來解決從木質(zhì)纖維素中釋放結(jié)構(gòu)糖的問題，但是必須要面對成本高、基礎(chǔ)設(shè)施條件要求高以及技術(shù)突破的挑戰(zhàn)等現(xiàn)實情況[14-15]。比較理想的處理方法需要具備較低的資本和運營成本、最大限度地提高原料的利用率、 產(chǎn)生少量的酶抑制劑和發(fā)酵微生[16]。針對以上這些問題，本文選取幾種化學(xué)物質(zhì)，分別對甜高粱秸稈進(jìn)行預(yù)處理，同時對酶水解糖化效果進(jìn)行了研究，為充分利用甜高粱秸稈制備燃料乙醇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

甜高粱秸稈：取自鄭州郊區(qū)，切割粉碎30～40目；木聚糖酶及纖維素酶：購于上海杰能科酶制劑公司，其中木聚糖酶酶活1.76×106U/L，纖維素酶酶活2.07×106U/L。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制：準(zhǔn)確稱取100 mg分析純葡萄糖(預(yù)先在80℃烘至恒重)，置于小燒杯中，用少量的蒸餾水溶解后，定容轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，搖勻，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 化學(xué)預(yù)處理

3稱取高粱秸稈粉10 g，加入250 mL的三角瓶中，按照固液比 110(W/V)的比例分別加入不同濃度梯度的鹽酸、亞硫酸、甲酸、氫氧化鈉以及雙氧水與氫氧化鈉的混合液混合均勻，于121℃高溫條件下預(yù)處理60 min，冷卻至室溫。

1.2.2 酶解試驗

高粱秸稈經(jīng)過化學(xué)預(yù)處理后，調(diào)pH為5.0，加入纖維素酶2.5g/100g 和木聚糖酶2g/100g，MgCl2溶液2.5 nmol/L，吐溫-80為1mL/100g，用蒸餾水補(bǔ)充，使固液比為110(W/V)，在50 ℃，160 r/min條件下糖化 48 h，每 10 h 補(bǔ)加一次酶并對物料進(jìn)行預(yù)處理，共補(bǔ)加4 次。過濾，取濾液滅菌備用。

1.2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取7支25 mL刻度試管，編號，將試管搖勻，在沸水浴中加熱5min，取出后立即冷卻至室溫，再以蒸餾水定容至25 mL，混勻。在540 nm波長下，分別讀取其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.4 總糖含量測定

總糖含量測定采用3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽酸預(yù)處理對甜高粱秸稈酶解糖化效果的影響

添加不同濃度梯度的鹽酸(分別為0%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%)，考察鹽酸預(yù)處理對秸稈糖化效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對秸稈糖化效果的影響

由圖2可知，1.0%的鹽酸預(yù)處理酶解后還原糖得率最高值達(dá)到29.1%，說明1.0%的鹽酸預(yù)處理有利于纖維素酶和木聚糖酶的酶解作用。稀鹽酸水解時，大部分半纖維素溶解于酸溶液中,雙酶與纖維素的接觸面積增加，使纖維素的雙酶糖化率提高。

2.2 亞硫酸預(yù)處理對甜高粱秸稈酶解糖化效果的影響

添加不同濃度梯度的亞硫酸(分別為0%，1%，3%，5%，6%，7%，8%，9%)，考察亞硫酸預(yù)處理對秸稈糖化效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 亞硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對秸稈糖化效果的影響

由圖3可知，亞硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%時還原糖得率最高，為8.7%。顯而易見，亞硫酸預(yù)處理酶解糖化效果較差，其作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

2.3 甲酸預(yù)處理對甜高粱秸稈酶解糖化效果的影響

添加不同濃度梯度的甲酸(分別為0%，5%，10%，15%，20%，25%，30%)，考察甲酸預(yù)處理對秸稈糖化效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對秸稈糖化效果的影響

由圖4可知，甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時還原糖得率最高，為22.4%。

2.4 氫氧化鈉預(yù)處理對甜高粱秸稈酶解糖化效果的影響

添加不同濃度梯度的NaOH(分別為0%，1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%)，考察NaOH預(yù)處理對秸稈糖化效果的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時還原糖得率最高，為24.3%。堿預(yù)處理的機(jī)理是在堿的作用下,木質(zhì)素和其他半纖維素間的酯鍵發(fā)生皂化反應(yīng)。堿預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素變得更具多孔性，增大了接觸表面積，故堿預(yù)處理后的纖維素更易酶解[18]。經(jīng)NaOH預(yù)處理后還原糖得率提高幅度較大，說明經(jīng)NaOH預(yù)處理后雙酶糖化的效果較明顯。

圖5 NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)對秸稈糖化效果的影響

2.5 H2O2預(yù)處理對甜高粱秸稈酶解糖化效果的影響

添加不同濃度梯度的H2O2(分別為0%，1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%)，考察H2O2預(yù)處理對秸稈糖化效果的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)對秸稈糖化效果的影響

由圖6可知，H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時還原糖得率最高，為11.5%。由于雙氧水只含氫和氧，是比較綠色、環(huán)保的預(yù)處理試劑，但該研究的結(jié)果不太理想。據(jù)報道，雙氧水與氫氧化鈉混合預(yù)處理效果會更好，有待于進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

探索了幾種不同的化學(xué)物質(zhì)預(yù)處理方法對秸稈雙酶糖化效果的影響，發(fā)現(xiàn)影響程度最大的是1%的鹽酸，第二是8%的氫氧化鈉，第三是15%的甲酸，影響程度最小的是亞硫酸。最終確定了最佳預(yù)處理方案：1%(W/W)的稀鹽酸在121℃高溫條件下預(yù)處理60 min 后，加入纖維素酶2.5g/100g 和木聚糖酶2g/100g，MgCl2溶液2.5 nmol/L，吐溫-80為1mL/100g，固液比為110(W/V)，pH5.0，50 ℃酶解糖化48 h。在此條件下還原糖得率最高，其值為29.1%。