山楂原花青素抗氧化、清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的研究

宓 偉 韓麗珍 韓富磊 張紅萍 蔣 偉 李汶洋 楊靈華 黃續(xù)釗 田麗君

1 濱州醫(yī)學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室 煙臺 264003；2 臨沂市人民醫(yī)院腫瘤科；3 濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤科

山楂原花青素(hawthorn proanthocyanidins, HPC)是由聚合度不同的表兒茶素及兒茶素組成的混合物，是公認的天然抗氧化劑。研究表明，HPC可清除氧自由基、抑制炎癥反應(yīng)ICAM-1 的表達上調(diào)、抗心肌缺血再灌注損傷、抗動脈粥樣硬化、保護血管內(nèi)皮細胞和預防癌癥[6]。本實驗通過比較HPC與維生素C對自由基和亞硝酸鹽的清除能力及對亞硝胺合成的阻斷能力，衡量HPC在疾病防治、保健方面的生物學價值，以期為HPC的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 山楂原花青素(國西安綠天生物技術(shù)有限公司，批號20150402))；維生素C(華南藥業(yè)集團有限公司，批號 H44020774)；超氧陰離子自由基清除能力試劑盒、羥自由基清除能力試劑盒、總抗氧化能力檢測試劑盒(比色法)(美國Sigma公司)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(北京諾博萊德科技有限公司)；33%二甲胺水溶液為化學純；HCl、NaNO2、NaCl、對氨基苯磺酸、α-萘胺、Na2CO3、鹽酸萘乙二胺、95%乙醇均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.2 主要儀器 紫外-可見分光光度計(日本島津公司，UV-2700)；TGL-16M高速冷凍離心機(上海赫田科學儀器有限公司)；ALPH2-4真空冷凍干燥儀(德國托普公司)；1 500 W循環(huán)過濾超聲波清洗機(杭州寶珀超聲波科技有限公司)；HHD-1液晶顯示電熱恒溫水浴鍋(上海旌派儀器有限公司)；ML-T電子分析天平(梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 HPC抗氧化能力測定

1.2.3 HPC對羥自由基(·OH)的清除 采用羥自由基清除能力試劑盒檢測HPC對·OH的清除能力：Fenton反應(yīng)體系中H2O2在Fe2+催化下產(chǎn)生高反應(yīng)活性的·OH，電子受體存在的情況下，加入Griess 試劑顯色，形成紅色物質(zhì)與·OH的含量成正比例關(guān)系。具體操作：取底物應(yīng)用液0.2 mL置于試管中，依次加入不同濃度的樣品溶液0.2 mL后加入0.4 mL應(yīng)用液混勻，37℃反應(yīng)1 min，立即加入2.0 mL顯色劑終止反應(yīng)；于550 nm下測定A測定管雙蒸水代替不同濃度樣品，測定A對照管；0.03% H2O2標準應(yīng)用液代替不同濃度樣品，雙蒸水代替底物應(yīng)用液，測定A標準管；雙蒸水代替底物應(yīng)用液和樣品溶液測定A空白管。平行測定三次后取平均值計算·OH清除率D：

1.2.4 HPC清除DPPH·自由基的能力 采用體外DPPH法測定HPC清除DPPH·自由基的能力：DPPH無水乙醇溶液呈紫色，濃度與吸光度在517 nm呈線性關(guān)系。加入HPC等自由基清除劑后可結(jié)合或取代DPPH·，DPPH·濃度降低，吸光度變小，借此可評價HPC對 DPPH·的清除能力。具體操作：取1.0 mL不同質(zhì)量濃度的樣品和維生素C溶液，再分別加入 1.0 mL 0.0178 mmol/L DPPH無水乙醇溶液,避光室溫反應(yīng)20 min，于517 nm條件下測定A對照管，室溫避光保存30 min后測A測定管;以無水乙醇溶劑做空白對照，測定A空白管。實驗平行測試三次，計DPPH·自由基清除率為K：

1.2.5 HPC總抗氧化能力測定 采用總抗氧化能力測定試劑盒(FRAP法)測定HPC總抗氧化能力：酸性條件下Fe3+—TPTZ可被HPC還原為Fe2+—TPTZ，溶液由橘黃色變?yōu)樗{色，于593 nm時有最大吸收光。具體操作：向試劑盒檢測管中加入180 μL FRAP工作液，對照管加入5 μL PBS溶液；測定管加入5 μL不同濃度HPC與維生素C樣品。37℃ 5 min 于539 nm下測定A對照管和A測定管，平行三次。

1.2.6 HPC清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的測定

1.2.6.1 HPC對亞硝酸鹽清除能力 采用鹽酸萘乙二胺法：酸性條件下亞硝酸根離子與對氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)，經(jīng)鹽酸苯乙二胺偶合后生成玫紅色產(chǎn)物進行比色測定。具體操作：取不同濃度的HPC與維生素C溶液1.0 mL于試管中，依次加入2.0 mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH=3.0)、2.0 mL 0.01 mmol/mL亞硝酸鈉溶液混勻。37℃ 1 h后加入2.0 mL 0.4%對氨基苯磺酸混勻，5 min后加入1.0 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液混勻，538 nm條件下測定A空白管與A測定管。實驗平行測試三次，計亞硝酸鹽清除率為H：

1.2.6.2 HPC阻斷亞硝胺合成能力 采用α-萘胺法：酸性條件下二甲胺與亞硝酸鈉生成二甲基亞硝胺，HPC與二甲胺競爭結(jié)合亞硝酸鈉，從而阻斷亞硝胺生成。反應(yīng)體系中二甲基亞硝胺在紫外光照射下分解為二甲基仲胺和亞硝酸根，亞硝酸根經(jīng)對氨基苯磺酸重氮化后，再與α-萘胺偶合生成玫紅色化合物進行比色測定。具體操作：取不同濃度HPC與維生素C溶液1.0 mL于試管中,依次加入10.0 mL檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液(pH=3.0)、1.0 mL 1.0 mmol/L亞硝酸鈉溶液、1.0 mL 1.0 mmol/L二甲胺溶液，充分混勻，37℃ 1 h。吸取1.0 mL溶液于燒杯中，加入0.5 mL 0.5% Na2CO3后于紫外分析儀(245 nm)下照射15 min。取出后依次加入1.5 mL 1%的對氨基苯磺酸、1.5 mL 0.1% α-萘胺、0.5 mL蒸餾水，混勻靜置20 min。于525 nm下測定A空白管與A測定管，實驗平行測試三次，計亞硝胺阻斷能力為J：

2 結(jié)果

圖1 HPC對超氧陰離子自由基的清除作用

2.2 HPC對羥自由基(·OH)的清除

圖2 HPC對羥自由基的清除作用

HPC對·OH清除率較高，隨著濃度增大，清除率不斷提高(圖2)。HPC對清除·OH的EC50為120.5 mg/L。一定范圍內(nèi)，HPC濃度越高對·OH的清除能力越高， 但在290 mg/L其對·OH的清除率的增加幅度較??；當HPC濃度為320 mg/L時，·OH清除率達96.29%。HPC對·OH的清除能力顯著高于同濃度的維生素C，HPC能夠有效清除·OH。

2.3 HPC清除DPPH·自由基的能力

圖3 HPC清除DPPH·自由基的能力

HPC能夠有效清除DPPH·自由基(圖3)，隨著濃度的增大，DPPH·自由基清除率逐漸增加。當HPC濃度達到200 mg/L時，清除率趨于穩(wěn)定；當濃度為320 mg/L時，DPPH·自由基清除率達97.49%。HPC清除DPPH·自由基的EC50為96.02 mg/L,顯著高于維生素C。

2.4 HPC總抗氧化能力測定

圖4 HPC總抗氧化能力

HPC的總抗氧化能力顯著，抗氧化能力隨著濃度的增大而增大(圖4)。當HPC濃度為320 mg/L時，總抗氧化能力為21.47 μg/mL。在320 mg/L濃度以下時，HPC總抗氧化能力均顯著高于維生素C(P<0.05)。

2.5 HPC清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的測定

圖5 HPC對亞硝酸鹽清除能力

HPC能夠清除反應(yīng)體系中的亞硝酸鹽(圖5)，濃度在20～80 mg/L范圍內(nèi)清除亞硝酸鹽能力較弱；在80～140 mg/L濃度范圍內(nèi)，HPC對亞硝酸鹽的清除率增幅明顯；在140～320 mg/L時清除率達80%以上，當濃度為320 mg/L時，亞硝酸鹽清除率達93.62%。

圖6 HPC阻斷亞硝胺合成能力

HPC阻斷亞硝胺合成能力與濃度成正相關(guān)(圖6)，隨著濃度的增大，亞硝胺合成阻斷能力不斷提高，HPC濃度為320 mg/L時，亞硝胺合成阻斷能力達74.45%。HPC對亞硝胺合成阻斷的EC50為171.6 mg/L，但相同濃度條件下HPC阻斷亞硝胺合成能力明顯低于維生素C。

圖7 HPC和維生素C對亞硝酸鹽清除活性和

320 mg/L時維生素C對亞硝酸鹽清除率和亞硝胺合成阻斷能力達到最大，分別為89.07%和89.97%(圖7)。100 、290 mg/L時維生素C對亞硝酸鹽清除率和亞硝胺合成阻斷能力接近，80～260 mg/L范圍內(nèi)亞硝胺合成阻斷能力高于亞硝酸鹽清除率。與維生素C組比較HPC組對亞硝酸鹽清除活性和亞硝胺形成抑制作用不同，80～320 mg/L范圍內(nèi)HPC對亞硝酸鹽清除率顯著高于亞硝胺合成阻斷能力；而20～80 mg/L時亞硝胺合成阻斷能力低于亞硝酸鹽清除率。

3 討論

細胞在代謝過程中產(chǎn)生大量氧自由基，這些氧自由基主要結(jié)合含不飽和鍵的生物大分子，對生物膜、核酸和蛋白質(zhì)造成損傷[7]，引發(fā)機體衰老、慢性病、免疫性疾病和腫瘤等病變。HPC由不同數(shù)量的兒茶素和表兒茶素縮合而成，總抗氧化能力顯著高于維生素C，是清除體內(nèi)自由基有效的天然抗氧化劑，在清除氧自由基、提高抗氧化能力方面發(fā)揮著重要作用[8]。實驗中HPC在一定的濃度范圍內(nèi)，其對·OH 的清除率、DPPH·自由基及總抗氧化能力顯著高于維生素C，且其清除能力與總抗氧化能力隨濃度升高而升高，當濃度為320 mg/L 時，HPC對·OH 的清除率達 96.29%，對DPPH·自由基清除率可達97.49%，總抗氧化能力可達21.47 μg/mL。HPC對不同種類自由基清除率存在明顯差異，總抗氧化能力顯著高于維生素C，能夠有效避免自由基對細胞的損傷。

亞硝酸鹽可直接與血紅蛋白結(jié)合引發(fā)高鐵血紅蛋白癥[9]，而且與食物中含氮化合物結(jié)合后生成強致癌物亞硝胺。亞硝胺與消化系統(tǒng)腫瘤如肝癌、胃癌和食道癌密切相關(guān)[10]，清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺的合成對預防癌癥有著重要的意義。本實驗中HPC能夠有效除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺的合成，HPC濃度升高時其對亞硝酸鹽的清除能力隨之增大，在HPC濃度為140～320 mg/L 范圍內(nèi)，HPC對亞硝酸鹽的清除率均大于維生素C；320 mg/L的HPC對亞硝酸鹽的清除率可達93.62%。