白刺花胚性愈傷組織誘導(dǎo)及體細胞胚發(fā)生和萌發(fā)

吳麗芳 魏曉梅 陸偉東

（曲靖師范學(xué)院生物資源與食品工程學(xué)院 云南高原生物資源保護與利用研究中心，曲靖 655011）

白刺花（Sophora davidii）屬豆科槐屬落葉灌木，廣泛分布于西北、華北、華中、華東和西南地區(qū)，云南主要生長于昆明、曲靖、楚雄、玉溪、紅河、大理、麗江、迪慶等海拔850-2 500 m地區(qū)［1］。白刺花因根系深而強大，耐旱、耐貧瘠、耐火燒、耐踐踏及固氮能力強等特性，常成為石漠化治理優(yōu)良的本地樹種［2］。白刺花根、莖、葉、花及果實含生物堿，具有清熱利咽、解暑和涼血消腫等藥用價值［3］。此外，粗蛋白含量高（20.79%），礦質(zhì)元素含量豐富，并含有多種維生素，適量的纖維素、碳水化合物、果膠等，具有重要的食用價值［4］。白刺花行種子繁殖，雖結(jié)實量大，但種子硬實［5］，具有一定的休眠性［6］，因此，幼苗稀少，成為通過種子繁殖來擴大種群數(shù)量的瓶頸之一。植物體細胞胚再生方式具有來源于單個的原始胚性細胞、遺傳相對穩(wěn)定、繁殖系數(shù)高、可作為外源基因遺傳轉(zhuǎn)化受體等特點，因此已成為遺傳改良、快速繁育和商品化生產(chǎn)種苗的重要途徑［7］。

最早的植物體細胞胚發(fā)生成功的報道來自于Steward和Reinert對胡蘿卜根的培養(yǎng)，之后一段時期內(nèi)體細胞胚的研究成果多來自于草本植物，而在母本植物研究方面，最早的研究工作始于Rao［8］對檀香（Santalum albumLinn.）組培研究中發(fā)現(xiàn)體細胞胚結(jié)構(gòu)，但未獲得再生植株，直到Gupta等［9］首次報道挪威云杉體細胞胚胎發(fā)生成功以來，世界范圍內(nèi)，已通過體胚發(fā)生途徑誘導(dǎo)并培育出180余種木本植物再生植株。如花旗松（Pseudotsuga menziesii）、火炬松（Pinus taeda）、輻射松（Pinus radiata）、挪威云杉（Picea abies）、水曲柳（Fraxinus mandshurica）、雜交鵝掌楸（Liriodendronhybrids）。這些植物通過體胚誘導(dǎo)的再生植株已成功應(yīng)用于生產(chǎn)實踐。然而，迄今為止，有關(guān)白刺花體細胞胚胎發(fā)生的研究尚見報道。

本研究以白刺花下胚軸和子葉為外植體進行胚性愈傷組織誘導(dǎo)和體細胞胚發(fā)生、萌發(fā)的研究，以期建立白刺花體細胞胚發(fā)生、發(fā)育及其調(diào)控技術(shù)體系，為利用組培技術(shù)解決白刺花種子繁殖的瓶頸問題提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2015年8-10月在曲靖師范學(xué)院校園里采集白刺花種子，脫去外殼剔除有蟲害的種子后，自然風(fēng)干保存?zhèn)溆谩嶒炗?016-2018年曲靖師范學(xué)院生物資源與食品工程學(xué)院生物技術(shù)實驗室及云南省高校云貴高原動植物多樣性及生態(tài)適應(yīng)性進化重點實驗室完成。

1.2 方法

1.2.1 白刺花無菌苗獲得 將健康飽滿無損害的種子用刀片劃破種皮，70%的酒精消毒30 s，0.1%HgCl2消毒12 min，無菌水沖洗5-6次，吸干水分接種于不添加任何激素的MS（蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L）培養(yǎng)基上，25℃，10 μmol/m2·s弱光培養(yǎng)14 d后取下胚軸和子葉。

1.2.2 愈傷組織及胚性愈傷組織的誘導(dǎo) 取無菌苗下胚軸、子葉分別接種于B5和MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，兩種培養(yǎng)基均添加1.0和2.0 mg/L 2，4-D、0.5 mg/L 6-BA、0.5 mg/L TDZ、40 g/L蔗糖、100 mg/L谷氨酰胺和7.0 g/L瓊脂，pH 5.8。每種外植體每種培養(yǎng)接種25瓶，每5瓶為1重復(fù)，5次重復(fù)，接種后，暗培養(yǎng)15 d；然后轉(zhuǎn)移到25℃、10 μmol/m2·s的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，白天14 h/黑暗10 h，培養(yǎng)40 d，觀察并統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)情況及誘導(dǎo)率。

愈傷組織誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出愈傷組織外植體的數(shù)量/接種外植體的數(shù)量×100%；

胚性愈傷組織誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出胚性愈傷組織外植體的數(shù)量/接種外植體的數(shù)量×100%

1.2.3 胚性愈傷組織的保持與增殖 將上述誘導(dǎo)獲得的胚性愈傷組織分別接種于MS培養(yǎng)基（含0.5 mg/L TDZ、0.5 mg/L 6-BA、2，4-D、40 g/L蔗 糖、100 mg/L谷氨酰胺和7 g/L瓊脂，pH 5.8），2，4-D濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/L，每處理接種25瓶，每5瓶為1重復(fù)，5次重復(fù)，光照強度為 10 μmol/m2·s，白天 14 h/黑暗 10 h，25 d 左右繼代一次，共繼代2次。繼代之后，測定愈傷組織的增殖重量和增值率。

胚性愈傷組織增殖量（鮮重）G0=G2-G1，G1為接種后培養(yǎng)瓶全重，G2為增殖后培養(yǎng)瓶全重。

1.2.4 體細胞胚發(fā)生 將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到體細胞胚發(fā)生的分化培養(yǎng)基上（MS+0.2 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA+40 g/L蔗糖+100 mg/L谷氨酰胺+7 g/L瓊脂，pH 5.8），ABA分別為0、1.0、5.0、10.0、15.0和20.0 mg/L，每處理接種25瓶，每5瓶為1重復(fù)，5次重復(fù)，20 μmol/m2·s光照培養(yǎng)，白天14 h/黑暗10 h，溫度25℃。培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計體細胞胚的發(fā)生率及不同培養(yǎng)基上每克鮮重愈傷組織的體細胞胚總數(shù)。

胚性愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及體細胞胚發(fā)生的誘導(dǎo)過程中，分別觀察和記錄胚性愈傷組織和體細胞胚發(fā)生數(shù)量，在顯微鏡和解剖鏡下觀察胚性愈傷組織的質(zhì)地和形態(tài)。

體細胞胚發(fā)生率（%）=產(chǎn)生體細胞胚的愈傷組織數(shù)/接種胚性愈傷組織的外植體數(shù)×100%

1.2.5 體細胞胚胎的萌發(fā)及植株再生 將獲得的體細胞胚胎接種于1/3 MS培養(yǎng)基上（0.2 mg/L NAA＋0.1 mg/L 6-BA＋2 g/L活性炭＋25 g/L蔗糖＋7 g/L瓊脂，pH 5.8），30 μmol/m2·s光照培養(yǎng)，直至獲得完整植株，統(tǒng)計體胚萌發(fā)率。然后將幼苗煉苗后移栽至裝有基質(zhì)（腐殖土∶珍珠巖：＝ 2∶1）的花盆中，30 d后統(tǒng)計植株成活率。

體細胞胚萌發(fā)率（%）=萌發(fā)成幼苗的體胚/接種的體胚×100%

植株成活率（%）=移栽成活的植株（株）/移栽的總株數(shù)（株）×100%形狀圓形、橢圓形及其他不規(guī)則形狀，細胞核常偏向一側(cè)且相對小（圖1-C）。

圖1 胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

2 結(jié)果

2.1 接種后愈傷組織生長狀況

將白刺花下胚軸、子葉接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，10-15 d后發(fā)現(xiàn)從下胚軸一端或子葉邊緣明顯膨大有愈傷產(chǎn)生（圖1-A），20-40 d愈傷長得最快，50 d后愈傷開始干涸褐化。形成的愈傷組織主要有3種類型，第Ⅰ類顏色偏綠，質(zhì)地較硬，結(jié)構(gòu)緊密，不易分開，生長緩慢，胚性差不易長期繼代，屬于非胚性愈傷組織。

第Ⅱ類顏色偏白，透明或半透明、水漬狀、結(jié)構(gòu)疏松，易褐化死亡，分化能力差，屬于非胚性愈傷組織。

第Ⅲ類顏色淡黃色或黃綠色，質(zhì)地較碎，結(jié)構(gòu)疏松、表面顆粒狀，具有分化胚狀體的能力且能繼代培養(yǎng)，屬胚性愈傷組織。顯微鏡及解剖鏡下使用改良苯酚品紅染液對細胞壓片觀察，胚性愈傷組織細胞壁明顯要厚，細胞小，細胞核稍大，有的細胞還可以看見核仁（圖1-B）；非胚性愈傷組織細胞大，

2.2 不同培養(yǎng)基對白刺花下胚軸胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將白刺花下胚軸接種在B5和MS培養(yǎng)基上，其愈傷組織和胚性愈傷組織誘導(dǎo)率存在一定差異（表1），B5培養(yǎng)基上，當(dāng)6-BA或TDZ濃度為0.5 mg/L時，隨著2，4-D濃度的增加，愈傷組織和胚性愈傷組織誘導(dǎo)呈遞增趨勢，當(dāng)2，4-D濃度相同時，同一濃度的細胞分裂素6-BA誘導(dǎo)效果不及TDZ，2，4-D、6-BA和TDZ 3種激素配合使用其效果優(yōu)于2，4-D與單一的細胞分裂組合。

MS培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)效果與B5培養(yǎng)基類似，愈傷組織誘導(dǎo)率從84.6%升高至95%，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率也從52.1%升至77.3%。隨著2，4-D濃度的增加，愈傷組織誘導(dǎo)率和胚性愈傷組織誘導(dǎo)率均呈上升趨勢。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中的成分和含量對白刺花下胚軸愈傷組織和胚性愈傷組織誘導(dǎo)率有影響，不同的激素種類也會影響其誘導(dǎo)效果，2，4-D濃度的高低對愈傷組織和胚性愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生較大影響。

2.3 不同培養(yǎng)基對白刺花子葉胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

白刺花子葉接種在B5和MS培養(yǎng)基上，結(jié)果（表2）表明，MS和B5培養(yǎng)雖均能誘導(dǎo)白刺花子葉形成愈傷組織和部分胚性愈傷組織，但MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果優(yōu)于B5培養(yǎng)基。在MS培養(yǎng)基上，白刺花誘導(dǎo)率隨2，4-D濃度的不同而不同，當(dāng)2，4-D增至2.0 mg/L時，白刺花愈傷組織誘導(dǎo)率從76.7%上升至92.6%，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率也從19.2%增加到41.0%。相同濃度的TDZ和6-BA 2種激素相比，TDZ的誘導(dǎo)效果優(yōu)于6-BA。B5培養(yǎng)基上誘導(dǎo)效果與MS培養(yǎng)基類似。

表1 不同培養(yǎng)基對白刺花下胚軸胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表2 不同培養(yǎng)基對白刺花子葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.4 白刺花胚性愈傷組織的保持和增殖

白刺花下胚軸和子葉誘導(dǎo)形成的胚性愈傷組織經(jīng)增殖培養(yǎng)2次后，胚性愈傷組織不斷增殖，接種前7 d內(nèi)愈傷組織外部沒有多大變化，7-20 d明顯增大（圖2-A，圖2-B），超過25 d愈傷增殖緩慢，開始在一側(cè)有褐化產(chǎn)生（表3）。從表3可以看出，以下胚軸為外植體的胚性愈傷組織增殖中，愈傷組織的增殖量隨著2，4-D濃度的增加而遞增，當(dāng)2，4-D為0.1 mg/L時，胚性愈傷組織的增殖量為1.39 g，增殖率為100.72%，而當(dāng)2，4-D為0.5 mg/L時胚性愈傷組織的增殖量為2.29 g，增殖率為172.18%，但從后期體細胞胚誘導(dǎo)中，過高的2，4-D濃度反而對體細胞胚的誘導(dǎo)產(chǎn)生不利影響，而2，4-D在0.2-0.3 mg/L的濃度誘導(dǎo)體細胞胚的效果較好，誘導(dǎo)頻率較高，質(zhì)量較好。以子葉為外植體的胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)中，對2，4-D的反應(yīng)不及下胚軸的明顯，雖愈傷組織的增殖量也隨2，4-D濃度的增加有所上升，但幾個濃度水平間差異不大，2，4-D為0.4 mg/L，增值率最高為149.63%。

2.5 白刺花體細胞胚發(fā)生

將0.2 mg/L 2，4-D增殖培養(yǎng)基上的胚性愈傷組織接種于不同濃度的ABA體細胞胚發(fā)生誘導(dǎo)培養(yǎng)上（表4，圖2-C），6種不同濃度的ABA上均能誘導(dǎo)產(chǎn)生體細胞胚，但濃度不同，體細胞胚發(fā)生率和每克愈傷組織上形成的體細胞胚數(shù)都不相同，其中以下胚軸為外植體的體細胞胚誘導(dǎo)中，沒添加ABA時，體細胞胚發(fā)生率僅27.32%，體細胞胚數(shù)為17個/g；當(dāng)ABA濃度為1.0 mg/L時，體細胞胚發(fā)生率增加了12.60%，體細胞數(shù)增加了12個/g，且隨著ABA濃度增至15 mg/L時，獲得了最高體細胞胚發(fā)生率（67.22%）和體細胞胚數(shù)（68個/g），與對照相比，體細胞發(fā)生數(shù)量增加了4.0倍，ABA濃度超過15 mg/L，體細胞胚發(fā)生率和每克愈傷組織上體細胞胚數(shù)反而下降。

表3 胚性愈傷組織增殖情況

以子葉為外植體的體細胞胚誘導(dǎo)中，與胚軸的結(jié)果類似，當(dāng)ABA濃度為1.0-15 mg/L時，體細胞胚發(fā)生率和體細胞胚數(shù)隨ABA濃度的增加而增加，ABA濃度為15 mg/L時，體細胞胚發(fā)生率最高為62%，體細胞胚數(shù)62個/g，與對照相比，體細胞胚數(shù)增加了4.77倍，ABA濃度超過15 mg/L時，體細胞胚發(fā)生率和體細胞胚數(shù)反而下降。

表4 ABA對白刺花體細胞胚發(fā)生的影響

2.6 體細胞胚胎萌發(fā)及植株再生

將從2種外植體上獲得的成熟體細胞胚輕輕轉(zhuǎn)至體細胞胚萌發(fā)培養(yǎng)基（1/3MS+0.2 mg/L NAA＋0.1 mg/L 6-BA＋2.0 g/L活性炭＋25 g/L蔗糖＋7 g/L瓊脂）中，7 d以后開始從下胚軸一端首先長出主根，20 d后可以觀察到完整的小幼苗，再經(jīng)20 d培養(yǎng)，健康的幼苗已完全長出（圖2-D），通過統(tǒng)計2種外植體誘導(dǎo)的體細胞胚其體細胞胚萌發(fā)率均在80%以上。將得到的幼苗煉苗移栽至溫室花盆中，30 d后幼苗移栽成活率達90%以上。

3 討論

通過體細胞胚胎發(fā)生被認為是植物再生植株獲得的重要途徑之一，由于再生植株來源于單個胚性細胞，克服了遺傳嵌合性問題，為高等植物在細胞水平上進行遺傳操作及品種改良提供一條有效的途徑［10］。然而在體細胞胚形成過程中，諸多因素影響其培養(yǎng)效果，如外植體類型、培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑等。體細胞胚誘導(dǎo)研究中，以幼胚［11-13］、成熟胚［14-15］、下胚軸［16-18］、子葉［19］、葉片［20］等為外植體均有報道，Trolinder等［21］對棉花葉片、莖段、子葉、中胚軸、上胚軸和下胚軸進行研究，認為下胚軸最容易誘導(dǎo)體細胞胚的發(fā)生，子葉次之。孫艷香等［22］通過對保豐苜蓿的研究發(fā)現(xiàn)下胚軸和葉柄產(chǎn)生愈傷組織及體細胞胚的能力較強，而子葉和真葉較弱。

圖2 愈傷組織增殖及體細胞胚胎發(fā)生

本研究中，下胚軸是胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體，培養(yǎng)基類型也是影響植物體細胞胚發(fā)生又一因素，據(jù)目前報道的資料顯示，70%的植物體細胞胚的誘導(dǎo)使用的是MS培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基中含有較高濃度的硝酸鹽和螫合鐵，營養(yǎng)元素相對比較全面，對多數(shù)植物的體細胞胚發(fā)生具有促進作用［23］。陳金慧等［10］對鵝掌楸的體胚發(fā)生的研究認為MS培養(yǎng)基最有利于體細胞胚的誘導(dǎo)。郭祖寶等［24］采用B5培養(yǎng)基成功誘導(dǎo)了胡蘿卜體胚發(fā)生。本研究MS培養(yǎng)基對白刺花愈傷組織及胚性愈傷組織的誘導(dǎo)效果優(yōu)于B5培養(yǎng)基研究證明2，4-D在誘導(dǎo)胚性愈傷組織中是必不可少的，特別是2，4-D與多種激素的配合使用更有利于體細胞胚的誘導(dǎo)［25］。2，4-D過高或過低都會對體細胞胚的形成和增殖產(chǎn)生影響，本研究中以下胚軸為外植體的胚性愈傷組織增殖中，2，4-D 0.5 mg/L時胚性愈傷組織的增殖量為2.29 g，增殖率為172.18%，但從后期體細胞胚誘導(dǎo)中，過高的2，4-D濃度反而對體細胞胚的誘導(dǎo)產(chǎn)生不利影響，而2，4-D在0.2-0.3 mg/L的濃度誘導(dǎo)體細胞胚的效果較好，誘導(dǎo)頻率較高，質(zhì)量較好。以子葉為外植體的胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)中，幾個濃度水平間差異不大。

ABA可促進體細胞的發(fā)育和體胚的成熟早有報道［26］，通常認為，ABA可促進細胞內(nèi)脂類、蛋白質(zhì)、淀粉等生物大分子物質(zhì)的積累，從而促進體細胞胚的成熟，但不同植物所需ABA的最佳濃度及其處理時間都有所不同。本研究中，沒添加ABA時，以下胚軸為外植體的體細胞胚發(fā)生率僅27.32%，而添加了ABA后，體細胞胚發(fā)生率和體胚數(shù)隨ABA濃度增加而增加，以子葉為外植體的體細胞胚誘導(dǎo)中，也得出了類似下胚軸的結(jié)果，ABA超過15 mg/L時，體細胞胚發(fā)生率和體細胞胚數(shù)反而下降。

4 結(jié)論

白刺花外植體種類及培養(yǎng)基類型均會影響胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，其中MS培養(yǎng)基較適合啟動細胞脫分化形成愈傷組織，下胚軸比子葉更易誘導(dǎo)胚性愈傷組織。適量濃度的2，4-D能促進愈傷組織的增殖，反之則會抑制體細胞胚的發(fā)生。