薏仁米糠多肽的功能特性研究

楊華連，陳 莉*，盧紅梅，任勰珂，楊 新

（1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

薏仁米（Coix chinensisTod）是一種集營(yíng)養(yǎng)、保健、美容等多種功效于一身的原材料[1-5]。貴州省是我國(guó)主要的薏仁米生產(chǎn)區(qū)之一，黔西南州興仁縣被授予“中國(guó)薏仁米之鄉(xiāng)”的稱號(hào)。薏仁米產(chǎn)業(yè)為該縣帶去了前所未有的機(jī)遇，促進(jìn)了當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展。但目前該縣的薏仁米加工企業(yè)主要還在采用粗放型的加工模式，產(chǎn)品較為單一，精深加工不足，生產(chǎn)設(shè)備落后，綜合利用率不高，這些短板制約了相關(guān)市場(chǎng)的拓展和新興產(chǎn)品研發(fā)，也影響了薏仁米生產(chǎn)加工企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的提高。薏仁米糠是薏仁米加工過程中的主要副產(chǎn)物[6]，富含蛋白質(zhì)、米糠油、多糖、植酸鈣[7]等營(yíng)養(yǎng)成分，有益于人體健康及某些疾病的預(yù)防和治療。米糠多肽是以米糠蛋白為原料制得的一種天然植物蛋白肽[7]，具有抗氧化、降血壓、促進(jìn)發(fā)育等功效，安全性較高，在食品、醫(yī)療、美容等領(lǐng)域[8]具有很好的研究?jī)r(jià)值和意義。目前較為常見的植物蛋白原料是玉米和豆類[9]，而對(duì)米糠蛋白多肽的研究，特別是薏仁米糠多肽的研究較少。

本研究以實(shí)驗(yàn)室自制的薏米糠蛋白為原料，通過雙酶分步酶解得到薏仁米糠多肽，分析其功能特性指標(biāo)在不同的pH值和溫度條件下的變化趨勢(shì)，以期為薏米糠多肽在食品工業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，促進(jìn)薏米糠相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展[10-13]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

薏仁米糠：貴州興仁縣某食品有限公司。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、硼酸、濃硫酸、石油醚、硫酸鉀、三氯乙酸、十二烷基硫酸鈉、鹽酸、無水硫酸銅、大豆色拉油、氯化鈉等（均為分析純）、酪蛋白磷酸肽（生化試劑）：美國(guó)Sigma公司。

雙縮脲試劑：將1.5 g硫酸銅及6.0 g酒石酸鉀鈉溶于500 mL蒸餾水中，攪拌加入300 mL 10%NaOH溶液，加蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

SH2石墨消解儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；K9840自動(dòng)凱氏定氮儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；DHG-9070B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH-b型數(shù)顯恒溫水浴鍋、80-2電動(dòng)離心機(jī)：常州奧華儀器有限公司；2D-2A自動(dòng)電位滴定儀：上海大普儀器有限公司；CJJ-781磁力加熱攪拌器；城西曉陽電子儀器廠；FW-80萬能粉碎機(jī)：上海仕元科學(xué)器材有限公司；722S可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；XHF-D高速內(nèi)切式勻漿機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

參照參考文獻(xiàn)[14]提取薏仁米糠蛋白，具體操作步驟：

脫脂薏仁米糠→堿液浸泡提取→離心→上清液等電點(diǎn)沉淀→靜置、離心→沉淀物→水洗至中性→真空干燥→薏仁米糠蛋白

參照參考文獻(xiàn)[15]提取薏仁米糠多肽，具體操作步驟：

薏仁米糠蛋白溶液→雙酶分步酶解（先加2%中性蛋白酶酶解180 min，再加2%堿性蛋白酶酶解120 min）→滅酶離心分離→薏仁米糠多肽液→真空冷凍干燥→薏仁米糠多肽

1.3.2 薏仁米糠多肽溶解性的測(cè)定

采用參考文獻(xiàn)[16]的方法，結(jié)果以氮溶解指數(shù)（nitrogen solubilityindex，NSI）表示。在燒杯中配制1%的多肽液，調(diào)節(jié)不同梯度的pH（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）及溫度（20 ℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃），恒溫水浴30 min后，3000r/min離心15 min，取1 mL上清液于試管中，加入4 mL雙縮脲試劑，渦輪混勻器混勻1min，室溫條件下放置30min，于波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度值。用10 mg/mL的酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPP）溶液在相同條件下測(cè)定其吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為y=0.058 3x-0.0062（R2=0.999 3）。NSI的計(jì)算公式如下：

1.3.3 薏仁米糠多肽乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[17]的方法，配制1%的多肽溶液，調(diào)節(jié)不同梯度pH（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0），取5 mL樣液加入5 mL大豆色拉油，調(diào)節(jié)不同的溫度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃），恒溫水浴30 min。10 000 r/min高速均質(zhì)30 s，形成均一的乳化液，2 500 r/min離心5 min，測(cè)量離心管中乳化層的高度以及液體的總高度。

將乳化后的多肽液，在80℃條件下恒溫水浴30 min，2 500 r/min離心10 min，計(jì)算樣品的乳化穩(wěn)定性。薏仁米糠多肽的乳化性及乳化穩(wěn)定性計(jì)算公式如下：

1.3.4 薏仁米糠多肽起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定

采用參考文獻(xiàn)[17]的方法。配制濃度為5%的多肽溶液，調(diào)節(jié)pH（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）及溫度（20 ℃、25 ℃、30℃、35℃、40℃、45℃），恒溫水浴30min，10000r/min高速均質(zhì)3 min，液面高度計(jì)為h1，靜置30 min后液面高度記為h2。多肽的起泡性及泡沫穩(wěn)定性計(jì)算公式如下：

1.3.5 薏仁米糠多肽持水性（water holding capacity，WHC）的測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[18]的方法，結(jié)果以每克多肽樣品吸附水的質(zhì)量表示。稱取一定質(zhì)量（m1）的多肽樣品于干燥離心管（質(zhì)量m0）中，加蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）及溫度（20℃、25 ℃、30℃、35℃、40℃、45 ℃、50 ℃），恒溫水浴30 min，然后4 000 r/min離心15 min，除去上清液后稱量離心管質(zhì)量（m2包含殘留物），多肽持水力計(jì)算公式如下：

1.3.6 吸油性測(cè)定

采用參考文獻(xiàn)[20]的方法，結(jié)果以每克多肽樣品吸附油的質(zhì)量表示。稱取1 g多肽樣品于10 mL離心管中，加入大豆色拉油3 mL，將樣品和大豆色拉油混勻，于室溫條件下靜置6 h，在1 000 r/min條件下離心20min，吸去上層未被吸附的色拉油，稱質(zhì)量，參照下式計(jì)算樣品吸油性：

式中：m0為蛋白質(zhì)量，g；m1為蛋白質(zhì)量＋離心管質(zhì)量，g；m2為吸油后蛋白質(zhì)量＋離心管質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值及溫度對(duì)薏仁米糠多肽溶解性的影響

圖1 pH值（A）、溫度（B）對(duì)多肽溶解性的影響Fig.1 Effect of pH(A)and temperature(B)on the solubility of polypeptide

由圖1A可知，pH值對(duì)多肽NSI的影響很明顯，隨pH值的增大，多肽的NSI先降低后升高，當(dāng)pH值為4.0時(shí)，多肽溶解性最低，為26.50%。薏仁米糠多肽等電點(diǎn)為pH4.2左右，在等電點(diǎn)附近，僅帶有少量電荷的多肽以中性離子的方式存在，多肽與溶劑之間的相互作用較弱，多肽分子間作用頻率增加，分子聚合導(dǎo)致了沉淀的產(chǎn)生，因此，溶解性降至較低水平；當(dāng)調(diào)節(jié)體系的pH偏離等電點(diǎn)時(shí)，帶有電荷的多肽分子產(chǎn)生了靜電排斥力，分散性能提升，多肽的溶解性增加[20]。

由圖1B可知，隨著溫度的升高，薏仁米糠多肽的NSI呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，35℃時(shí)NSI達(dá)到最大值，為42.13%，這是因?yàn)榈蜏夭焕谒肿?、蛋白質(zhì)分子間的相互作用，隨著溫度的升高，多肽分子的立體結(jié)構(gòu)得以伸展，表面積增加，增強(qiáng)了與水分子間的相互作用，溶解度增大；隨著溫度升至40℃左右時(shí)，肽鍵的特定結(jié)構(gòu)受到破壞[21]，疏水基團(tuán)暴露，產(chǎn)生沉淀，溶解度降低。

2.2 pH值及溫度對(duì)薏仁米糠多肽乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

2.2.1 pH值對(duì)薏仁米糠多肽乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

由圖2可知，薏仁米糠多肽乳化性隨pH值的增大呈先降低后升高的趨勢(shì)，pH值為5.0時(shí)達(dá)到最低值，為50.52%；乳化穩(wěn)定性隨著pH值的增大而升高，在pH 5.0～8.0的范圍內(nèi)上升較迅速，在pH值為8.0時(shí)達(dá)到最大值，為87.15%。這是因?yàn)槊附庵频眯》肿佣嚯?，制取過程中疏水性氨基酸側(cè)鏈外露，堿性條件提高了多肽分子的親油性，蛋白質(zhì)分子中靜電荷數(shù)量上升、分布范圍擴(kuò)大，多肽分子與油滴間吸引力增強(qiáng)，界面張力減小，乳化穩(wěn)定性增強(qiáng)。

2.2.2 溫度對(duì)薏仁米糠多肽乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

圖3 溫度對(duì)多肽乳化性（A）及乳化穩(wěn)定性（B）的影響Fig.3 Effect of temperature on polypeptide emulsibility(A)and emulsifying stability(B)

由圖3可知，隨著溫度的升高，多肽的乳化性和乳化穩(wěn)定性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。多肽乳化性在20～40℃范圍內(nèi)隨溫度的升高而升高，在40℃時(shí)達(dá)到最大值，為89.72%；多肽的乳化穩(wěn)定性在20～60℃范圍內(nèi)隨溫度的上升而升高，60℃達(dá)到最大值，為88.75%。之后，溫度繼續(xù)上升，多肽的乳化性及乳化穩(wěn)定性均開始降低。這是由于適度的升溫增大了多肽分子的接觸表面積，有利于多肽分子吸附在油水界面，但若溫度過高，多肽溶解性降低產(chǎn)生沉淀，乳化顆粒的運(yùn)動(dòng)頻率提高，水油界面上多肽分子的凝膠作用受到阻礙[22]，多肽的乳化性和乳化穩(wěn)定性開始降低。

2.3 pH值及溫度對(duì)薏仁米糠多肽起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響

2.3.1 pH值對(duì)薏仁米糠多肽起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響

圖4 pH值對(duì)多肽起泡性（A）和泡沫穩(wěn)定性（B）的影響Fig.4 Effect of pH on polypeptide foaming ability(A)and foaming stability(B)

由圖4可知，多肽的起泡性隨pH增大而升高，這種變化趨勢(shì)與溶解性有一定的相關(guān)性，溶解性隨著pH值增大先降低后升高，pH值上升初期（即在等電點(diǎn)附近）溶解度差，蛋白濃度偏低，導(dǎo)致形成的泡沫數(shù)量比較少，所以起泡性比較差，當(dāng)pH＞5.0后，隨著溶解性的增加，起泡性快速上升。pH值為8.0時(shí)，多肽的起泡性達(dá)到最大值，為287%。多肽的起泡穩(wěn)定性則隨著pH增大呈現(xiàn)出先降低后增大的變化趨勢(shì)。酶解制備多肽使得多肽的疏水性氨基酸殘基暴露，從而使多肽分子吸附在氣-水界面上，界面張力降低，泡沫穩(wěn)定性較高。酶解作用使得形成的肽鏈較短，在pH5.0～7.0范圍內(nèi)小分子肽不易在界面形成交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定液膜，形成的泡沫迅速崩塌，泡沫穩(wěn)定性較差[23]，于pH6.0處達(dá)到最低值，為88.07%。

2.3.2 溫度對(duì)薏仁米糠多肽起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，隨著溫度的升高，多肽的起泡性和泡沫穩(wěn)定性都呈現(xiàn)出先升高后降低的變化，分別在35℃、25℃達(dá)到最大值，分別為410.21%、80.58%。在20～35℃之間時(shí)，多肽起泡性隨溫度的升高而增大，這是由于溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加劇，溶解性增加，多肽濃度提高，產(chǎn)生的泡沫體積增加，多肽分子界面吸附能力變大，起泡性提高；泡沫穩(wěn)定性取決于多肽濃度、體系的黏度等，多肽制備過程中蛋白酶作用使得疏水性氨基酸殘基暴露于多肽分子外，使多肽泡沫穩(wěn)定性具有較高的起始值，隨著水浴溫度提高，泡沫穩(wěn)定性先升高后降低。

圖5 溫度對(duì)多肽起泡性（A）和泡沫穩(wěn)定性（B）的影響Fig.5 Effect of temperature on polypeptide foaming ability(A)and foaming stability(B)

2.4 pH值及溫度對(duì)薏仁米糠多肽持水力的影響

由圖6A可知，薏仁米糠多肽持水性隨著pH值的增大都呈現(xiàn)先下降后升高的變化趨勢(shì)，這與多肽的溶解性具有較大的關(guān)聯(lián)。在pH4.0時(shí)，分子帶電荷少，分子之間的相互作用強(qiáng)，多肽分子和水分子之間的相互作用被削弱，持水力較低，為6.30%；偏離等電點(diǎn)時(shí)，多肽分子帶的正負(fù)電荷之間具有的相互作用力使多肽結(jié)構(gòu)膨脹，與水分子的結(jié)合較好，持水力維持一個(gè)較高值。

由圖6B可知，多肽的持水力隨著溫度的升高總體上呈一個(gè)先緩慢升高后快速下降的變化趨勢(shì)，薏仁米糠多肽在50℃、60℃時(shí)持水力分別為8.52%、8.67%，80℃時(shí)持水性降為最低值，為6.81%。隨著溫度的升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，促進(jìn)了多肽分子對(duì)水分的吸收，導(dǎo)致持水力增強(qiáng)，當(dāng)溫度超過一定限度之后，部分多肽開始聚集沉淀，多肽分子與水分子之間的有效作用面積減少，因此持水力較低。

圖6 pH值（A）、溫度（B）對(duì)多肽持水力的影響Fig.6 Effect of pH(A)and temperature(B)on polypeptide water holding capacity

2.5 薏仁米糠多肽吸油性

薏仁米糠多肽的吸油性為2.17%，利用薏仁米糠多肽較高的吸油性，可將其添加至食品中，起到促進(jìn)脂肪代謝，提高人體代謝水平的作用[24]。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室自制的薏仁米糠多肽為實(shí)驗(yàn)材料，測(cè)定6種功能特性指標(biāo)，研究其在不同的pH值和溫度條件下的性質(zhì)差異。結(jié)果表明，多肽溶解性在pH4.0時(shí)達(dá)到最低值，為26.50%；在35℃時(shí)達(dá)到最大值，為42.13%；乳化性在pH5.0時(shí)達(dá)到最低值，為50.52%，在40℃時(shí)達(dá)到最大值，為89.72%；持水性在pH4時(shí)達(dá)到最低值，為6.30%，在80℃時(shí)達(dá)到最低值，為6.81%；而乳化穩(wěn)定性和起泡性在pH5.0～8.0范圍內(nèi)隨pH的升高而增強(qiáng)，均在pH8時(shí)達(dá)到最大值，為87.15%、287%；乳化性穩(wěn)定性在60℃時(shí)達(dá)到最大值，為88.75%，起泡性在35℃時(shí)達(dá)到最大值，為410.21%；而泡沫穩(wěn)定性在pH6.0時(shí)達(dá)到最低值，為88.07%，在25℃時(shí)達(dá)到最大值，為80.58%；薏仁米糠多肽的吸油性為2.17%。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于薏仁米糠多肽的研究較少，對(duì)多肽的功能性質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、品質(zhì)改良以及在食品工業(yè)中的應(yīng)用研究都是現(xiàn)階段極具潛力的研究方向。