玉米穗發(fā)芽突變體vp-like8的遺傳分析及突變基因鑒定

王 瑞 陳陽松 孫明昊 張秀艷 杜依聰 鄭 軍,*

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玉米穗發(fā)芽突變體的遺傳分析及突變基因鑒定

王 瑞1,**陳陽松1,**孫明昊1,2張秀艷3杜依聰1鄭 軍1,*

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081;2吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 吉林長春 130118;3中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院, 北京 100193

玉米突變體具有明顯的穗發(fā)芽性狀且能穩(wěn)定遺傳, 遺傳分析表明該突變性狀受隱性單基因控制。用與自交系鄭58雜交構(gòu)建F2遺傳定位群體, 利用BSR-Seq方法, 將基因初定在玉米第3染色體160.4 Mb~165.6 Mb區(qū)間內(nèi)。參考玉米基因組信息, 發(fā)現(xiàn)已報(bào)道的穗發(fā)芽基因位于此定位區(qū)間內(nèi)。分別利用、的雜合突變體進(jìn)行等位測驗(yàn), 發(fā)現(xiàn)雜交后代中正常與穗發(fā)芽籽粒符合3∶1遺傳分離比。經(jīng)序列分析, 發(fā)現(xiàn)突變體中基因在第2內(nèi)含子有343 bp堿基的缺失, 且第3內(nèi)含子有222 bp重復(fù)序列的插入, 而已報(bào)道的突變體只在第2個(gè)內(nèi)含子有343 bp堿基的缺失。通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測發(fā)現(xiàn), 與正常籽粒相比,與突變籽粒中基因的轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低。以上證據(jù)表明,是一個(gè)新的基因等位突變體。

玉米; 穗發(fā)芽; 突變體;; 基因定位

穗發(fā)芽嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量與品質(zhì), 給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的損失。早在20世紀(jì)20年代, 就已經(jīng)有玉米穗發(fā)芽相關(guān)的研究報(bào)道[1-5]。截至目前已發(fā)現(xiàn)十多個(gè)玉米穗發(fā)芽突變體, 通過對這些突變體基因的克隆, 發(fā)現(xiàn)這些突變體大多是植物激素脫落酸(ABA)合成途徑或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受阻, 從而導(dǎo)致穗發(fā)芽的表型。根據(jù)Robertson的評定標(biāo)準(zhǔn)[6], 將已鑒定的玉米穗發(fā)芽突變體分為兩種類型。一類是胚乳和幼苗的顏色不發(fā)生改變的突變體, 包括/、、/、和[7-12]; 另一類是玉米籽粒顏色發(fā)生改變的突變體, 該突變體植株類胡蘿卜素和葉綠素的生物合成受到影響, 包括、、/、、和/[13-18]。

是玉米中典型的ABA不敏感突變體,基因編碼一類特異的轉(zhuǎn)錄因子, 在玉米種子發(fā)育成熟過程中的胚和胚乳中特異表達(dá), 調(diào)控種子對植物激素ABA的響應(yīng)過程[7]。研究表明位于VP1蛋白氨基端的保守結(jié)構(gòu)域?qū)BA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要, 而VP1蛋白最大的保守區(qū)域B3則在ABA含量較低時(shí)起重要作用, B3結(jié)構(gòu)域與下游基因的啟動(dòng)子結(jié)合, 并激活其表達(dá)[21]。此外, 通過對突變體中糊粉層和胚組織中的花青素合成受阻現(xiàn)象深入研究, 發(fā)現(xiàn)VP1蛋白可能通過與多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子互作, 進(jìn)而激活基因來控制花青素代謝[19], 表明VP1轉(zhuǎn)錄因子在種子成熟過程中參與了多個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。

研究作物穗發(fā)芽的遺傳調(diào)控, 克隆穗發(fā)芽相關(guān)基因, 將為深入解析作物穗發(fā)芽的分子遺傳機(jī)制, 以及鑒定和篩選耐穗發(fā)芽的種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。盡管目前已克隆多個(gè)玉米穗發(fā)芽基因, 但玉米籽粒穗發(fā)芽形成的分子遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍不夠清晰。因此, 有必要進(jìn)一步鑒定新的玉米穗發(fā)芽突變體, 克隆更多的穗發(fā)芽基因, 并深入研究其調(diào)控玉米穗發(fā)芽的遺傳機(jī)制。本研究對一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的玉米穗發(fā)芽突變體(命名為)進(jìn)行遺傳分析和基因定位, 經(jīng)等位測驗(yàn)和突變基因的分子鑒定發(fā)現(xiàn),是基因的一個(gè)新等位突變體。該研究為進(jìn)一步探索玉米穗發(fā)芽的分子遺傳機(jī)制豐富了實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

玉米突變體是本實(shí)驗(yàn)室在玉米繁種過程中新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)穗發(fā)芽突變體。授粉后30 d,雜合植株的果穗上呈現(xiàn)出明顯的穗發(fā)芽分離的表型。利用雜合體與自交系鄭58雜交, 然后再自交得到F2群體用于基因定位?；蛲蛔凅w326B()訂購自Maize Genetics Cooperation Stock Center (玉米遺傳學(xué)合作庫存中心, https:// maizecoop.cropsci.uiuc.edu/request)。

1.2 vp-like8突變體的表型鑒定和遺傳分析

由于玉米果穗成熟收獲時(shí), 穗發(fā)芽的胚芽已脫水干枯致死, 因此突變體以雜合體形式保存。隨機(jī)選取有穗發(fā)芽分離果穗上的正常籽粒種植, 自交后代中, 再選取有穗發(fā)芽表型果穗上的正常籽粒種植。以此方式連續(xù)多代自交, 觀察突變體的遺傳穩(wěn)定性, 并進(jìn)行遺傳分析。在每一世代自交授粉后30 d, 對穗發(fā)芽的表型進(jìn)行鑒定, 剝開果穗苞葉, 選取出現(xiàn)穗發(fā)芽表型的果穗, 脫粒并統(tǒng)計(jì)正常與穗發(fā)芽籽粒的分離比。

1.3 目的基因的初定位

BSR-Seq方法已被證明適用于玉米突變體基因的定位與克隆[22-23], 本研究利用該方法對突變體基因進(jìn)行初定位。授粉后30 d, 隨機(jī)挑選出現(xiàn)穗發(fā)芽表型分離的F2果穗, 分別挑選40粒正常和穗發(fā)芽籽粒, 去除種皮后分別混合成2份實(shí)驗(yàn)樣品, 液氮速凍并迅速研磨至粉末, 使用植物總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司, Cat# DP432)提取樣品總RNA。利用Illumina HiSeq2000型測序儀(北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。參照BSR-Seq分析流程[22], 比對、分析測序結(jié)果, 提取樣本間的SNP標(biāo)記, 計(jì)算SNP標(biāo)記與突變基因的連鎖概率, 分析獲得基因的初定位區(qū)間。

1.4 定位區(qū)間基因檢索及等位測驗(yàn)

根據(jù)BSR-Seq 數(shù)據(jù), 將基因定位于第3染色體160.4 Mb~165.6 Mb區(qū)間內(nèi), 利用MaizeGDB數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://www.maizegdb.org/), 檢索該定位區(qū)間內(nèi)所有基因的注釋信息, 發(fā)現(xiàn)該區(qū)間內(nèi)存在已經(jīng)報(bào)道的玉米穗發(fā)芽基因[7]。

為檢測與是否等位, 隨機(jī)挑選、雜合體后代中正常籽粒(基因型應(yīng)為野生型或雜合型), 各種植2行, 每行25株。開花授粉時(shí), 任選中一行單株自交, 并收集此行所有單株花粉進(jìn)行混粉作為父本, 分別授予中一行的每一單株。同理,的另一行的每一單株自交, 同時(shí)分別收集此行每個(gè)單株的花粉, 混粉后作為父本與的另一行的每一單株雜交。授粉30 d后, 剝開苞葉, 檢查是否有穗發(fā)芽突變表型的果穗[23]。

1.5 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增和序列分析

用CTAB方法分別提取突變體和授粉后30 d分離果穗上正常與穗發(fā)芽籽粒的基因組DNA[24]。依據(jù)基因組序列, 利用Primer3引物設(shè)計(jì)軟件(http://primer3.ut.ee/), 設(shè)計(jì)8對引物(VP1-G- F1/R1~VP1-G-F8/R8)(表1), 擴(kuò)增產(chǎn)物瓦片式覆蓋了基因組序列。分別以突變體與基因組DNA為模板, 擴(kuò)增基因片段, 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序(北京六合華大基因科技有限公司), 分析測序結(jié)果, 分別判斷基因的突變情況。PCR 擴(kuò)增體系為2 × KOD buffer 25 μL, 引物(10 μmol L–1) 0.75 μL, 模板DNA 2 μL, dNTPs (2.5 μmol L–1) 5 μL, KOD FX酶(1.0 U μL–1) 1 μL, 用超純水補(bǔ)至50 μL。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性10 s, 59℃退火30 s, 68℃延伸1 min, 循環(huán)數(shù)為35; 68℃延伸7 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶[23]。

表1 本研究所用的引物

1.6 vp-like8和vp1再次等位測驗(yàn)

依據(jù)測序結(jié)果, 分別用特異引物(VP1-G-F4/ R4、VP15-G-F6/R6), 準(zhǔn)確鑒定出與的雜合突變體。取雜合突變體花粉, 授予雜合突變體植株; 同理, 取雜合突變體花粉授予雜合突變體植株。授粉后30 d, 檢測果穗上籽粒穗發(fā)芽情況, 統(tǒng)計(jì)分離比[23]。

1.7 RNA的提取及基因表達(dá)量分析

授粉后30 d, 取穗發(fā)芽和正常的籽粒, 去除種皮, 提取籽粒RNA (同上)。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司, Cat# AU311-02)反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 設(shè)計(jì)特異引物VP1-CDS-F1/R1, 以GAPDH作為內(nèi)參引物(表1), 利用ABI 7300實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行基因的表達(dá)分析。PCR體系為dye I 0.4 μL, 10′qMix 10 μL, 引物(10 μmol L–1) 0.5 μL, 模板cDNA 1 μL, 補(bǔ)滅菌超純水至20 μL。PCR擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性2 min, 95℃變性10 s, 60℃退火15 s, 72℃延伸30 s, 設(shè)置40個(gè)循環(huán), 在72℃延伸30 s階段收集熒光, 并添加熔解曲線, 用公式2–ΔΔCt計(jì)算正常和穗發(fā)芽籽粒中基因表達(dá)量差異[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體vp-like8的表型和遺傳分析

正常情況下, 玉米授粉后30~40 d, 隨著籽粒胚乳的硬化, 玉米籽粒逐漸成熟。但對于突變體雜合體的果穗, 授粉后30 d, 呈現(xiàn)出明顯的穗發(fā)芽分離表型(圖1-A)。籽粒完全成熟收獲時(shí), 穗發(fā)芽籽粒提前萌發(fā)的胚芽已干枯致死(圖1-B, C), 經(jīng)連續(xù)自交, 發(fā)現(xiàn)穗發(fā)芽性狀能夠穩(wěn)定遺傳。如表2所示, 隨機(jī)挑選有穗發(fā)芽性狀分離的果穗, 統(tǒng)計(jì)分離比, 經(jīng)卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其分離比符合3∶1, 表明突變體穗發(fā)芽性狀由單隱性核基因調(diào)控。

圖1 vp-like8突變體穗發(fā)芽表型

A: 授粉30 d 后突變體雜合果穗上的穗發(fā)芽籽粒和正常籽粒; B: 授粉后60 d后突變體雜合果穗上穗發(fā)芽籽粒和正常籽粒; C: 成熟的正常籽粒(WT)和穗發(fā)芽籽粒(); 標(biāo)尺=1 cm。

A: viviparous and normal kernels on aheterozygous ear at 30 days after self-pollination; B: viviparous and normal kernels on aheterozygous ear at 60 days after self-pollination; C: mature normal (WT) and viviparous kernels (); Bar = 1 cm.

表2 vp-like8雜合突變體自交授粉后正常籽粒和穗發(fā)芽籽粒的分離情況

χ2(0.05)(1)=3.84.

2.2 Vp-like8基因定位

BSR-Seq基因定位發(fā)現(xiàn), 在玉米10條染色體中, 只有第3染色體出現(xiàn)一個(gè)明顯的峰。以> 0.5作為標(biāo)準(zhǔn), 將基因定位在第3染色體160.4 Mb~ 165.6 Mb區(qū)間內(nèi)(圖2)。

2.3 vp-like8和vp1初步等位測驗(yàn)

分析發(fā)現(xiàn)在初定位的區(qū)間內(nèi)存在已報(bào)道的基因, 為判斷二者是否為同一個(gè)基因, 通過和雜合體的正反交進(jìn)行了等位測驗(yàn)。在雜合突變體混粉雜交的果穗中, 發(fā)現(xiàn)有穗發(fā)芽分離的果穗(圖3-A); 同時(shí), 在雜合突變體混粉雜交的果穗中, 也發(fā)現(xiàn)有穗發(fā)芽分離的果穗(圖3-B)。初步證明突變體很有可能是基因的一個(gè)等位突變體。

圖2 利用BSR-Seq方法對vp-like8突變體基因的初定位

2.4 vp-like8突變位點(diǎn)鑒定

為準(zhǔn)確驗(yàn)證和是等位基因并鑒定的突變位點(diǎn), 參考基因組序列(基因組序列全長5085 bp, 有6個(gè)外顯子, 開放閱讀框共2717 bp), 共設(shè)計(jì)8 對PCR引物(表1), 分別擴(kuò)增、突變體基因組DNA, 擴(kuò)增產(chǎn)物起始于起始密碼子上游?423 bp, 到終止密碼子下游1088 bp結(jié)束, 瓦片式覆蓋了基因組序列。測序發(fā)現(xiàn),突變體中基因在第2內(nèi)含子處缺失343 bp堿基, 且在第3內(nèi)含子插入222 bp的重復(fù)序列; 而突變體只在第2內(nèi)含子處缺失343 bp堿基 (圖4)。由此證明, 這2個(gè)突變體的基因突變方式不同, 即是一個(gè)新的等位突變基因。

圖3 利用雜合體對vp-like8和vp1進(jìn)行等位測驗(yàn)

A: 以雜合突變體混粉雜交的果穗上出現(xiàn)穗發(fā)芽籽粒。B: 以雜合突變體混粉雜交的果穗上出現(xiàn)穗發(fā)芽籽粒。

A: viviparous kernels were emerged onheterozygous ear crossed by the mixed pollen ofheterozygous plants; B: viviparous kernels were emerged onheterozygous ear crossed by the mixed pollen ofheterozygous plants.

圖4 Vp1基因結(jié)構(gòu)示意圖及突變體的突變位置

根據(jù)和在基因上的突變位置, 設(shè)計(jì)特異引物VP1-G-F6R6、VP1-G-F4R4, 分別鑒定出和雜合體, 利用雜合體植株再次進(jìn)行等位測驗(yàn)。授粉后30 d, 檢查穗發(fā)芽情況, 發(fā)現(xiàn)無論是正交(×), 還是反交(×), 雜交果穗都出現(xiàn)穗發(fā)芽表型的分離。統(tǒng)計(jì)分析, 發(fā)現(xiàn)正常與穗發(fā)芽籽粒符合3∶1分離比(表3)。進(jìn)一步確認(rèn)突變體就是基因的等位突變體。

2.5 Vp1基因在vp-like8突變體中的表達(dá)檢測

選取和雜合體, 分別提取其自交果穗中正常和穗發(fā)芽籽粒的總RNA, 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法, 檢測基因的轉(zhuǎn)錄水平。如圖5所示, 在突變體和中, 穗發(fā)芽籽?；虻谋磉_(dá)量都顯著低于正常籽粒, 表明和中不同方式的突變都影響了基因正常轉(zhuǎn)錄。

表3 vp-like8與vp1突變體等位測驗(yàn)

χ2(0.05)(1)=3.84.

圖5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測Vp1基因分別在vp-like8、vp1突變體的正常(normal)和穗發(fā)芽(vp)籽粒中的表達(dá)量

3 討論

玉米穗發(fā)芽性狀受種子內(nèi)各內(nèi)源激素水平的影響, 其中植物激素ABA可促進(jìn)未成熟種子中胚的發(fā)育及成熟種子的休眠等過程[25]。近年來, 玉米穗發(fā)芽突變體的研究已相對深入, 發(fā)現(xiàn)ABA與玉米穗發(fā)芽表型密切相關(guān), 無論ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常還是ABA合成途徑受阻, 都會(huì)發(fā)生穗發(fā)芽突變。目前所發(fā)現(xiàn)的玉米穗發(fā)芽突變體大多是ABA合成途徑異常所致, 而ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常導(dǎo)致的相對較少。

已有研究報(bào)道,是單拷貝基因, 編碼分子質(zhì)量為73,335道爾頓的蛋白質(zhì), 特異地在種子發(fā)育過程中的胚和胚乳里表達(dá)[7]。玉米VP1激活胚成熟和胚休眠相關(guān)基因的表達(dá), 參與玉米胚成熟發(fā)育進(jìn)程的調(diào)控[19], 且抑制與種子萌發(fā)相關(guān)基因的表達(dá)[26]。玉米VP1是擬南芥ABI3的同源蛋白, 是種子發(fā)育進(jìn)程中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子, 擬南芥ABI3調(diào)控胚發(fā)育過程。研究表明, ABI3調(diào)控胚芽休眠、質(zhì)體發(fā)育和開花等過程[27-31]。本研究中在第2內(nèi)含子處缺失343 bp堿基, 并第3內(nèi)含子處有222 bp重復(fù)序列的插入, 與所報(bào)道的突變體只在第2個(gè)外顯子有343 bp堿基缺失的突變方式不同, 因此,是一個(gè)新的未見報(bào)道的基因等位突變體。對于中222 bp的插入序列, 該序列末端有17 bp的重復(fù)序列, 經(jīng)序列檢索比對分析發(fā)現(xiàn), 222 bp序列為類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子, 且在高粱、水稻、谷子等作物中均存在。我們檢測到突變體中基因mRNA的表達(dá)量顯著降低, 推測可能就是由于第2內(nèi)含子的缺失以及第3內(nèi)含子的222 bp插入序列, 導(dǎo)致了基因不能正常轉(zhuǎn)錄和剪切, 進(jìn)而不能翻譯成正常的VP1蛋白, 造成了其功能的缺失。綜上,突變體的表型鑒定與基因克隆, 為進(jìn)一步深入研究玉米基因的功能提供了新的實(shí)驗(yàn)材料。

4 結(jié)論

新發(fā)現(xiàn)一個(gè)玉米穗發(fā)芽突變體, 受單隱性核基因控制。中基因在第2內(nèi)含子處缺失343 bp堿基, 在第3內(nèi)含子處插入222 bp重復(fù)序列, 是基因的一個(gè)新等位突變體, 為探討玉米穗發(fā)芽的分子機(jī)制提供了新的試材。

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Genetic analysis and causal gene identification of maize viviparous mutant

WANG Rui1,**, CHEN Yang-Song1,**, SUN Ming-Hao1,2, ZHANG Xiu-Yan3, DU Yi-Cong1, and ZHENG Jun1,*

1Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;2College of Agronomy, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, Jilin, China;3School of Life Science, China Agricultural University, Beijing 100193, China

The maize mutantshows clear viviparous phenotype and stable inheritance, and genetic analysis showed that the mutant phenotype was controlled by a single recessive gene. Using an F2segregation population derived fromand inbred line Zheng 58, the causal gene was mapped to an interval from 160.4 Mb to 165.6 Mb on chromosome 3 by the BSR-Seq technology. According to the maize genomic database, a previously discovered viviparous genewas identified to be in this mapping interval. The test crosses fromandheterozygous plants showed a 3:1 segregation ratio between normal and viviparous kernels. The genomic sequence analysis revealed thatmutant had a 343 bp deletion in the second intron and 222 bp insertion in the third intron ofgene, which is different frommutation of an only 343 bp deletion in the second intron ofgene. Further real time PCR analysis revealed that, compared with the normal kernels, the transcript level ofwas significantly decreased both inandviviparous kernels. Taken together, these evidences suggest thatis a new allele mutant of.

maize;; mutant;; gene mapping

2018-08-15;

2019-01-12;

2019-02-22.

10.3724/SP.J.1006.2019.83058

鄭軍, E-mail: zhengjun02@caas.cn

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

王瑞, E-mail: 18612261636@163.com; 陳陽松, E-mail: chenyangsong14@163.com

本研究由國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0101002)和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助。

This work was supported by the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0101002) and the Agricultural Science and Technology Innovation Program of Chinese Academy of Agricultural Sciences.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190222.0900.002.html