縫隙連接蛋白40磷酸化介導(dǎo)自發(fā)性高血壓大鼠腦基底動(dòng)脈血管舒張功能*

趙小玲， 王家寧， 何瓊

1宜昌市優(yōu)撫醫(yī)院藥劑科(湖北宜昌 443000)； 2湖北醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)研究所(湖北十堰 442000)； 3湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院心臟中心(湖北十堰 442000)

維持小動(dòng)脈血管內(nèi)壓力平衡的關(guān)鍵是血管收縮和舒張的協(xié)調(diào)[1]，縫隙連接是小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞間直接進(jìn)行物質(zhì)交換的通道[2]?？p隙連接允許鉀離子通過細(xì)胞膜來調(diào)節(jié)血管的舒縮功能[3]，當(dāng)細(xì)胞外鉀離子通過縫隙連接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞膜超極化，大鼠動(dòng)脈血管舒張[4]?？p隙連接是由6個(gè)單體連接蛋白組成的六聚體[5]，在血管壁上起主要作用的是縫隙連接蛋白40(Connexin 40, Cx40[6])，Cx40存在著多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，單體連接蛋白磷酸化導(dǎo)致六聚體的功能發(fā)生改變[7-8]，但是目前國內(nèi)對(duì)Cx40在自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertension rats，SHR)腦基底動(dòng)脈血管的功能尚未報(bào)道。因此，2016年12月至2018年3月我們以SHR腦基底動(dòng)脈血管Cx40作為研究靶點(diǎn)，綜合應(yīng)用多種技術(shù)研究了Cx40磷酸化與腦基底動(dòng)脈血管舒張功能的變化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)所用Wistar大鼠和SHR購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK京(北京)2007-0001。體重在200～300 g，雌雄不拘，清潔級(jí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 18-β甘草次酸(18-β glycyrrhetinic acid, 18β-GA)批號(hào)及規(guī)格：G10105-10g、乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)批號(hào)及規(guī)格：A6625-500g、苯腎上腺素(phenylephrine, PE)批號(hào)及規(guī)格：1533002-200mg和硝普鈉(sodium Nitroprusside, SNP)批號(hào)及規(guī)格：1614501-500mg，以上均購自Sigma公司；Connexin 40抗體批號(hào)及規(guī)格：sc-365107，購自SANTA公司，KCl等其余試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 溶液制備 K-PSS液成分(mmol/L)： KCl 123.70，MgSO4·7H2O 1.17，KH2PO41.18，CaCl22.5，NaHCO325，EDTA 0.026，葡萄糖5.5。生理鹽溶液(physiological saline solution，PSS)成分(mmol/L)：NaCl 119，KCl 4.69，MgSO4·7H2O 1.17，KH2PO41.18，CaCl22.5，NaHCO325，EDTA 0.026，葡萄糖5.5，pH 7.4。

1.4 方法

1.4.1 大鼠無創(chuàng)血壓測量 在清醒安靜狀態(tài)下測量大鼠尾動(dòng)脈的血壓和心率，血壓測量方法參考章艷萍等[9]。

1.4.2 壓力機(jī)動(dòng)圖測量 參照王蕊等[10]實(shí)驗(yàn)方法,大鼠在麻醉狀況下處死，取出基底動(dòng)脈血管，固定在壓力機(jī)動(dòng)系統(tǒng)(Pressure myograph system, DMT, 110P, Denmark)水浴槽上，DMT自動(dòng)分析血管直徑，單位是μm。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)Wistar 大鼠和SHR腦基底動(dòng)脈血管段分別進(jìn)行孵育，待血管穩(wěn)定(壓力維持60 mmHg)后，預(yù)先給予10-5mol/L的PE孵育血管20 min，至血管收縮穩(wěn)定后，累積給予不同濃度的血管舒張劑SNP (0.1～300 μmol/L)。

血管直徑舒張幅度變化公式D(μm)=DX-DP，DP為血管在PSS中穩(wěn)定時(shí)的直徑，DX為血管加入不同濃度的藥物時(shí)血管穩(wěn)定后的直徑，Dmax為血管加入藥物后的直徑舒張幅度最大值；血管舒張率(rate)=(DP-DX)/Dmax。

1.4.3 免疫熒光技術(shù) 參照羅勇等[11]實(shí)驗(yàn)方法：分離的腦基底動(dòng)脈血管置于多聚甲醛內(nèi)，冰凍切片后備用，依次加入：過氧化氫去除過氧化物酶，兔抗Cx40特異性抗體，加入二抗，共聚焦定量分析熒光強(qiáng)度。

1.4.4 Western blot技術(shù) 參照張傳林等[12]實(shí)驗(yàn)方法：腦基底動(dòng)脈血管加入200 μL細(xì)胞裂解液、冰上裂解20 min、超聲波處理器破碎、收集上清、測定蛋白濃度、上樣(20 μg)、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、加抗體孵育、ECL熒光顯色，Image J圖像分析軟件定量分析。

2 結(jié)果

2.1 Wistar大鼠和SHR尾動(dòng)脈血壓的比較 Wistar大鼠尾動(dòng)脈收縮壓(121.2±10.6) mmHg，SHR的尾動(dòng)脈收縮壓(217.7±9.6) mmHg，SHR收縮壓顯著高于Wistar大鼠(P<0.01，n=6)，但是兩者心率分別是：(329.3±41.4)和(319.4±40.5)次/min，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 18β-GA對(duì)Wistar大鼠和SHR腦基底動(dòng)脈段舒張反應(yīng)的影響 給予100 μmol/L的18β-GA預(yù)孵育腦動(dòng)脈血管段20 min后，累積給予不同濃度的SNP也可濃度依賴的引起腦動(dòng)脈段舒張，但與未加入18β-GA相比，SNP引起Wistar大鼠腦動(dòng)脈段的舒張幅度在10～300 μmol/L之間發(fā)生下移(P<0.05，n=6)。SNP引起SHR腦動(dòng)脈段舒張幅度與未加入18β-GA相比，SNP引起SHR腦動(dòng)脈段的舒張幅度在0.1～300 μmol/L之間發(fā)生明顯下移(P<0.05，n=6)。18β-GA干預(yù)20 min后，SHR舒張幅度對(duì)較低濃度(0.1～3 μmol/L)SNP反應(yīng)下移，較Wistar大鼠差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，n=6)。見表1。

硝普鈉濃度(μmol/L)Wistar& SNPWistar& SNP+18β-GASHR&SNPSHR&SNP+18β-GA 0.1168.6±10.2141.0±12.4170.1±12.746.1±5.9?△ 0.3187.1±10.7167.5±15.4188.3±11.474.8±10.7?△ 1206.3±11.4193.3±12.7209.2±10.989.2±9.4?△ 3223.2±13.1197.8±12.6227.6±13.1161.0±10.9?△ 10243.3±12.6204.6±10.9#239.1±12.5208.1±11.6△ 30270.2±15.2223.9±11.5#261.1±14.1219.7±12.4△ 100294.6±14.7234.6±12.9#283.1±13.0228.1±13.1△ 300304.7±15.6256.9±12.1#308.2±14.3243.8±12.8△

#與Wistar& SNP 比較P<0.05; △與SHR&SNP 比較P<0.05；*與Wistar& SNP+18β-GA 比較P<0.01

2.3 SHR腦基底動(dòng)脈段連接蛋白Cx40分布 免疫熒光結(jié)果顯示：Wistar大鼠腦基底動(dòng)脈血管Cx40光密度均值為23.4±4.1；SHR腦基底動(dòng)脈血管Cx40光密度均值為13.2±3.7。相比Wistar大鼠，SHR腦基底動(dòng)脈血管Cx40光密度明顯下調(diào)(P<0.01，n=6)(圖1)。

*與Wistar大鼠比較P<0.01

2.4 SHR腦基底動(dòng)脈血管Cx40表達(dá) Western blot結(jié)果顯示：Wistar大鼠腦基底動(dòng)脈血管Cx40平均值是22.1±1.2，磷酸化Cx40平均值是15.3±1.3；SHR腦基底動(dòng)脈血管Cx40平均值是13.9±0.9，磷酸化Cx40平均值是21.6±1.0。相比Wistar大鼠，SHR腦基底動(dòng)脈血管Cx40表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01，n=6)，磷酸化Cx40表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01，n=6)(圖2)。

*與Wistar大鼠比較P<0.05

3 討論

SHR收縮壓高于Wistar大鼠，提示SHR血管舒張功能降低，有研究表明，18β-GA能阻斷血管平滑肌細(xì)胞間的縫隙連接[13-14]，我們應(yīng)用18β-GA干預(yù)后， SHR腦基底動(dòng)脈血管舒張率下調(diào)幅度明顯降低，提示SHR收縮壓升高與縫隙鏈接介導(dǎo)的血管舒張功能降低呈正相關(guān)，縫隙連接介導(dǎo)的血管舒張功能降低導(dǎo)致SHR收縮壓升高；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示SHR腦基底動(dòng)脈血管Cx40分布密度降低，提示縫隙連接介導(dǎo)的血管舒張功能降低與Cx40分布密度呈負(fù)相關(guān)。Western blot結(jié)果顯示SHR腦基底動(dòng)脈血管Cx40磷酸化表達(dá)水平上調(diào)，Cx40表達(dá)水平下調(diào)，提示縫隙連接介導(dǎo)的血管舒張功能降低與Cx40磷酸化呈正相關(guān)。10～300 μmol/L SNP介導(dǎo)的Wistar大鼠和SHR血管舒張幅度較給予100 μmol/L 18β-GA孵育前明顯下調(diào)，但Wistar大鼠和SHR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與高濃度(10～300 μmol/L) SNP通過釋放NO，激活G蛋白偶聯(lián)受體，通過多種途徑發(fā)揮舒張作用相關(guān)[15]。

總之，通過本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們推測：SHR腦基底動(dòng)脈血管組成縫隙連接的Cx40磷酸化水平上調(diào)，引起縫隙連接介導(dǎo)的血管舒張功能障礙，導(dǎo)致血管收縮，是高血壓大鼠收縮壓上升的重要原因之一。