山羊痘病毒059蛋白表達(dá)及鑒定

米麗開(kāi)姆·托合提尼亞孜 張雪萍 何川川 童劍軍楊 倩 李有文,2*

（1 塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾843300）

（2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾843300）

（3 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾843300）

羊痘是由羊痘病毒（Capripox virus, CPV）感染山羊、綿羊或牛等反芻動(dòng)物引起的一種烈性傳染病。病畜以發(fā)熱、全身起痘為典型特征［1］。羊痘病毒包括山羊痘病毒（Goatpoxvirus, GTPV），綿羊痘病毒（Sheeppoxvirus, SPPV）和皮膚疙瘩病病毒（Lumpy skin disease virus,LSDV）三個(gè)種［1］。

一般來(lái)說(shuō)，羊痘病毒對(duì)宿主的感染范圍是非常局限的，即山羊痘病毒只感染山羊而綿羊痘病毒只感染綿羊，皮膚疙瘩病病毒只感染牛，但實(shí)際生產(chǎn)中也有交叉感染［2,3］，人也偶有感染的報(bào)道。羊痘病毒是在細(xì)胞漿內(nèi)復(fù)制的有囊膜的雙股DNA 病毒［4］。成熟的病毒粒子多呈卵圓形，大小約為150～180 nm×150～180 nm［5］。山羊痘病毒基因組呈線形，全長(zhǎng)約150 kb，共編碼147 個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼密度為93%［6］。其中間區(qū)域（ORFs024～123）是羊痘病毒的保守序列，編碼與病毒DNA 復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，蛋白合成、加工等生長(zhǎng)繁殖相關(guān)的重要蛋白［2］。核心蛋白就是中間區(qū)域中一類重要的結(jié)構(gòu)蛋白［3］。對(duì)山羊痘病毒Pellor 株的全基因組研究發(fā)現(xiàn)其含有3 種6 個(gè)病毒核心蛋白［2,7,8］：包括1 個(gè)病毒核心蛋白（viral core protein）ORF091 基因，3 個(gè)DNA 結(jié)合的病毒核心蛋白（DNA-Binding core protein）ORF027、ORF039、ORF059 基因和2 個(gè)推測(cè)的核心蛋白（Putative core protein）ORF037、ORF053 基因［5］。核心蛋白是一種多功能蛋白，對(duì)丙肝病毒（HCV）研究發(fā)現(xiàn)其核心蛋白是病毒粒子核衣殼的組成成分，HCV 核心蛋白的表達(dá)可以引起肝脂肪變性和肝細(xì)胞癌（HCC）的發(fā)生［9］。另外，HCV 核心蛋白還可抑制宿主的免疫功能，干預(yù)細(xì)胞凋亡及正常生長(zhǎng)過(guò)程等［10］。對(duì)于羊痘病毒核心蛋白的研究資料尚不多，但肯定會(huì)有重要作用，為了了解羊痘病毒核心蛋白ORF059 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和生物學(xué)特點(diǎn)，本研究擬對(duì)2010年新疆南疆暴發(fā)的山羊痘疫情中的山羊痘病毒分離珠（GTPV-Thx-2010）的ORF059 基因進(jìn)行擴(kuò)增、序列分析，并進(jìn)行原核表達(dá),初步研究其生物學(xué)特性，為進(jìn)一步對(duì)其生物學(xué)功能和作用機(jī)制等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與菌種

本實(shí)驗(yàn)的毒株來(lái)自新疆南疆2010 年流行的羊痘分離株（THX 株），保存于塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；原核表達(dá)系統(tǒng)用宿主大腸桿菌DH5α、BL21、原核表達(dá)載體pET-42 b 含His 標(biāo)簽均保存于新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要藥品及試劑

2×Utaq PCR Mix（購(gòu)買自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司），PrimeSTAR HS DNA Polymerase、dNTP、T4 DNA 連接酶（購(gòu)自大連寶生物科技有限公司），瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒（購(gòu)買北京天根生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），EcoRI、XhoI（購(gòu)自Thermo 公司），DNA 純化試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Omega公司）。Western blot 用DAB 顯色劑（購(gòu)買自武漢博士德生物工程有限公司），實(shí)驗(yàn)常用試劑配制方法見(jiàn)附錄。

1.1.3 主要使用儀器

瓊脂糖水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司），F(xiàn)250 經(jīng)濟(jì)型加熱制冷循環(huán)器（優(yōu)萊博技術(shù)（北京）有限公司），ZWY-103B 恒溫培養(yǎng)振蕩器、ZXGPB2160 隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司），全自動(dòng)凝膠成像分析儀、HC 高電流電泳儀、T100 Thermal Cycler 梯度PCR 儀、Mini-PROTEAN Tetra 電泳槽、Mini-Trans-Blot 電泳轉(zhuǎn)印槽（Bio-Rad生命科學(xué)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 山羊痘病毒基因組的提取

將被病毒感染過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)液取200 μL 到1.5 mL 的離心管中，按照天根生物科技有限公司的病毒基因組提取試劑盒說(shuō)明提取山羊痘病毒基因組備用。

1.2.2 原核表達(dá)載體構(gòu)建

1.2.2.1 引物合成

根據(jù)參考已經(jīng)在GenBank 上發(fā)表的羊痘病毒基因的全序列（GenBank AF124517）中059 號(hào)基因的序列，用DNAMAN 軟件設(shè)計(jì)059 號(hào)基因的特異性引物，為了便于后期克隆，分別在其上下游引物的5′端加NdeΙ、XhoΙ 限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)（下劃線處），引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，見(jiàn)表1。

表1 合成的引物

1.2.2.2 059基因的擴(kuò)增

以GTPV-THX-2010 株提取的基因組為模板，用059基因的特異性引物PCR 擴(kuò)增。100μL擴(kuò)增體系：模板4. 8 μL，5×PrimeStar Buffer 20 μL，dNTP4 μL，上下游引物各2. 4 μL，PrimeStar HS DNA Polymerase 1.2μL，dd H2O 65.2μL。擴(kuò)增程序：94 ℃40 s、94 ℃30 s、57 ℃40 s、72 ℃40 s，72 ℃10 min，30 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后純化回收（按照DNA回收試劑盒操作）。

1.2.2.3 059基因與質(zhì)粒的酶切與純化

取059 基因20 μl，pET-42b 質(zhì)粒15 μl 分別于兩個(gè)離心管，分別加通用10xBuffer 4 μl，EcoRI 2 μl，XhoI 2μl，加入水至40μl，充分混勻后，于37 ℃水浴鍋中3 h。酶切產(chǎn)物用DNA純化試劑盒純化，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.4 059基因與原核表達(dá)載體的連接與鑒定

將酶切純化的059 基因5 μl 與載體1 μl 于同一離心管中，加T4 連接酶1 μl，10xT4buffer 1 μl，水2 μl，于16 ℃水浴連接8～10 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)DH5α 并涂板培養(yǎng)12 h，挑菌搖菌，做菌液PCR 鑒定，PCR 陽(yáng)性菌提取質(zhì)粒，并做雙酶切（EcoRI/XhoI）鑒定，質(zhì)粒送武漢天一輝遠(yuǎn)生物有限公司測(cè)序鑒定。

1.2.3 THX 株059基因核苷酸及推測(cè)的氨基酸序列分析059 基因的測(cè)序結(jié)果利用軟件DNAMAN 和DNASTAR 進(jìn)行同源性比較和遺傳進(jìn)化關(guān)系分析。并推測(cè)其氨基酸序列，做蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和分子量預(yù)測(cè)。

1.2.4 059蛋白表達(dá)及鑒定

1.2.4.1 059蛋白的表達(dá)取經(jīng)鑒定構(gòu)建正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)BL21，按張孝忠等［11］的方法表達(dá)并鑒定其結(jié)果。

1.2.4.2 Western Blot檢測(cè)

對(duì)059 基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。按張孝忠等［11］的方法表達(dá)并鑒定其結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增目的基因

目的基因通過(guò)PCR 擴(kuò)增之后，其產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定得到GTPV-059 號(hào)基因全長(zhǎng)結(jié)果，765bp處有一條帶，與理論值相符，見(jiàn)圖1。

圖1 GTPV-059基因PCR擴(kuò)增

2. 2 PET42b-GTPV-059 重組質(zhì)粒的菌液PCR 檢驗(yàn)結(jié)果

按照分子克隆的常規(guī)方法，將pET42b 載體和PCR產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化后挑單菌落搖菌并進(jìn)行菌液PCR 鑒定，得到PET42b-GTPV-059的陽(yáng)性質(zhì)粒結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 PET42b-GTPV-059重組質(zhì)粒菌液PCR鑒定

2.3 PET42b-GTPV-059重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果

雙酶切鑒定重組質(zhì)粒PET42b-GTPV-059的鑒定結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 PET42b-GTPV-059重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.4 GTPV-059基因序列分析

表2 GTPV-059基因核苷酸及氨基酸序列

THX 株059 基因的測(cè)序結(jié)果如表2 右側(cè)所示，該基因全長(zhǎng)約765 bp，與參考株GTPV-Pellor 相似性高達(dá)99.34%，序列分析顯示該基因C+G 含量為26.12%，與羊痘病毒整體GC 組成一致；推測(cè)編碼255 個(gè)氨基酸（如表2 左側(cè)），其中強(qiáng)酸性氨基酸（D,E）35 個(gè)，強(qiáng)堿性氨基酸（K,R）32 個(gè)，等電點(diǎn)為5.4，分子量為29 KDa，陰影區(qū)為強(qiáng)堿性區(qū)域。

2.5 GTPV-059遺傳進(jìn)化樹

根據(jù)GTPV-059 的測(cè)序結(jié)果，與GenBank 中發(fā)表的羊痘的序列做遺傳進(jìn)化分析，本次分離的山羊痘病毒南疆株與其他山羊痘病毒株聚于一個(gè)分支，親緣關(guān)系最近。對(duì)059 基因，羊痘病毒屬的三處種中，綿羊病病毒與疙瘩皮膚病病毒的親緣關(guān)系相對(duì)較近，而與山羊痘病毒的關(guān)系較遠(yuǎn)（見(jiàn)圖4）。

圖4 GTPV-059基因遺傳進(jìn)化關(guān)系分析

2.6 GTPV-059蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

對(duì)推測(cè)的GTPV-059 蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α 螺旋為主，多個(gè)α 螺旋與β 折疊結(jié)構(gòu)交織，并有較多的轉(zhuǎn)角相連，蛋白有較強(qiáng)的親水性和抗原性，見(jiàn)圖5。

圖5 GTPV-059蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.7 059蛋白表達(dá)檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)SDS-PAGE 電泳對(duì)原核表達(dá)中的蛋白進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)GTPV-059 蛋白大小29 KDa，與理論一致，蛋白表達(dá)量較高，見(jiàn)圖6。

圖6 059蛋白原核表達(dá)檢測(cè)

2.8 059蛋白Wastern-blot鑒定

用His 一抗鑒定059 蛋白與His 標(biāo)簽融合表達(dá)的結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 059蛋白表達(dá)的Wastern-blot鑒定

3 討論

核心蛋白是一類與糖胺聚糖共價(jià)結(jié)合的多肽鏈的總稱，也是一類具有重要生物功能的蛋白質(zhì)，所有生物均含有核心蛋白，包括動(dòng)植物和細(xì)菌病毒等微生物［12］。目前發(fā)現(xiàn)的核心蛋白約2 萬(wàn)～25 萬(wàn)種。羊痘病毒就含有至少6種核心蛋白，這可能與痘病毒特殊而復(fù)雜的增殖過(guò)程相一致。痘病毒是一類有囊膜的不分節(jié)段的大型雙股DNA 病毒，與許多dsDNA 病毒在宿主在細(xì)胞核中復(fù)制不同的是痘病毒有自己在宿主細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制的特殊復(fù)制機(jī)制，病毒增殖過(guò)程中的很多酶、調(diào)節(jié)蛋白都是由病毒自身的蛋白完成，病毒轉(zhuǎn)錄只識(shí)別痘病毒科的啟動(dòng)子，病毒基因表達(dá)分兩個(gè)階段，早期基因編碼非結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)參與基因組復(fù)制，晚期基因編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白［13］。在此過(guò)程中，核心蛋白可能發(fā)揮重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白（HBc）作為pregenomic啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活劑［14］。

在本研究中，克隆了新疆南疆2010 年暴發(fā)的羊痘病毒疫情中的分離株THX株的ORF059基因，并構(gòu)建了原核表達(dá)載體PET42b-GTPV-059，用IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)了其蛋白，并分析預(yù)測(cè)了其二級(jí)結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)該蛋白是以α-螺旋為主，β-折疊或片層結(jié)為輔，并由少量的轉(zhuǎn)角連接，交替形成的蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖5）。作為一個(gè)核蛋白，其應(yīng)該是一個(gè)帶陽(yáng)離子的堿性蛋白，但是該蛋白等電點(diǎn)為5.4，是一個(gè)酸性蛋白。分析該蛋白氨基酸組成發(fā)現(xiàn)其中間區(qū)域有一個(gè)強(qiáng)堿性區(qū)域（見(jiàn)表2-AA 序列中陰影），對(duì)應(yīng)區(qū)域也是強(qiáng)的親水性區(qū)域（見(jiàn)圖5 第8 行122-127 區(qū)域），這可能是一個(gè)與核苷酸結(jié)合的位點(diǎn)。另外DNA 結(jié)合蛋白質(zhì)可能包含鋅指，helix-turn-helix，亮氨酸拉鏈等結(jié)構(gòu)，促進(jìn)核酸綁定。圖5 所示有二級(jí)結(jié)構(gòu)中可見(jiàn)有多個(gè)helix-turn-helix 的結(jié)構(gòu)，也可以作為核蛋白的可能性的證據(jù)。作為核心蛋白都含有幾個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，分析ORF059 蛋白中包含至少3 個(gè)結(jié)構(gòu)域，符合核心蛋白的結(jié)構(gòu)條件。

本研究的ORF059 蛋白就是山羊痘病毒核心蛋白之一。該蛋白有255個(gè)氨基酸構(gòu)成，在細(xì)菌中可以較好的表達(dá)，得到大量蛋白，有利于其高級(jí)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的研究。該蛋白是一種DNA 結(jié)合核心蛋白，因此既是一種核心蛋白，也是一種核蛋白（nucleoprotein）。核蛋白就是與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，因其最初發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞核中而得名，其實(shí)在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中都含有。核蛋自在生物的生長(zhǎng)和繁殖過(guò)程中有著獨(dú)特的功能和作用。如包裹基因組防止其被降解，參與基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等的調(diào)節(jié)。核蛋白一般都含有特殊的氨基酸信號(hào)序列,起蛋白質(zhì)定向、定位作用.如煙草斑紋病毒與小兒麻痹癥病毒、流行性感冒病毒等動(dòng)植物病毒本身就是核蛋白［15］，所以核蛋白的研究在動(dòng)及植物病害的防治及臨床醫(yī)學(xué)上有十分重要意義。