豚鼠不同年齡自發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎顯微變化的觀察

陶劍鋒 王瑩 王超 張硯卓 姜旭 吳成愛

隨著人們生活、工作方式的改變及社會人口的老齡化，骨關(guān)節(jié)退行性病變已成為高發(fā)疾病，其中代表性疾病之一為骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)。根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì),50歲以上的人群中，OA發(fā)病率達(dá)到50%；55歲以上的人群中，OA發(fā)病率高達(dá)80%；女性發(fā)病率高于男性。OA在嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量、增加家庭負(fù)擔(dān)的同時，還造成重大的社會經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前認(rèn)為，OA是一種多病因所致的全關(guān)節(jié)疾病，其病變部位不僅局限于軟骨，亦累及滑膜、韌帶以及軟骨下骨。大量研究表明，軟骨下骨在OA發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。利用一種能夠模擬人類關(guān)節(jié)自然退變過程的動物模型是研究該疾病發(fā)生發(fā)展的理想方式。Hartley豚鼠在OA相關(guān)研究中是一種典型的動物模型，它隨著年齡的增長自發(fā)出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨的退變、降解和丟失[2]。這一動物模型能否準(zhǔn)確模擬人類OA的發(fā)生過程，還沒有得到論證。近年興起的顯微(micro)-CT，作為一種無創(chuàng)檢測手段常被用來評價小動物的骨組織。目前該成像技術(shù)的分辨率通常在10～82 μm，可充分滿足臨床與動物實(shí)驗(yàn)對脊柱等部位的皮質(zhì)骨和骨小梁結(jié)構(gòu)觀察及形態(tài)計(jì)量學(xué)分析的需求[3-4]。本研究選擇不同年齡組的雌雄性豚鼠，通過后肢膝關(guān)節(jié)的大體形態(tài)學(xué)、X線和micro-CT檢查，探討Hartley豚鼠在不同生長階段關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的改變情況與性別、體質(zhì)量的相關(guān)性。

資料與方法

一、資料

1.動物與飼養(yǎng)：選取健康1月齡Hartley豚鼠36只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，雌雄性各18只)。飼養(yǎng)于北京市創(chuàng)傷骨科研究所動物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，環(huán)境條件符合中國國家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境及設(shè)施》(GB14925-2010)：飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在(24±2)℃，相對濕度在40%～70%，照度晝夜明暗交替時間為12 h/12 h。實(shí)驗(yàn)動物自由攝入水。飼料(北京實(shí)驗(yàn)動物研究中心)為豚鼠專用清潔級飼料。水為專用實(shí)驗(yàn)動物飲用水。動物飼養(yǎng)管理和動物實(shí)驗(yàn)操作均符合《北京市實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》，并通過北京積水潭醫(yī)院-北京市創(chuàng)傷骨科研究所倫理委員會的批準(zhǔn)。飼養(yǎng)方式為雌雄分開，同性別群養(yǎng)，1個月齡組為每籠9只，隨著月齡增長體質(zhì)量增加，逐漸減少每籠的只數(shù)，至5個月齡時每籠6只。將不同性別的豚鼠隨機(jī)分為1、3、5月齡組，每組各6只。均在達(dá)到分組月齡期2～3 d以內(nèi)處死取材。

2.樣本制備：經(jīng)戊巴比妥90 mg/kg 腹腔內(nèi)注射麻醉后腹主動脈穿刺取血處死各亞組動物(n=6)，分離血清-80℃冰箱保存。稱重，每只動物統(tǒng)一取完整的左右后肢膝關(guān)節(jié)，剔除周圍組織，用生理鹽水清洗。用佳能EOS 40D數(shù)碼相機(jī)、50 mm鏡頭(佳能公司，日本)觀察關(guān)節(jié)軟骨的大體形態(tài)。標(biāo)本保存于-80℃冰箱中。

二、方法

1.Micro-CT掃描與三維重建：將股骨標(biāo)本經(jīng)保濕處理后置于Micro-CT(SKYSCAN 1172，比利時)儀器中進(jìn)行掃描，掃描方式為旋轉(zhuǎn)180°,步長0.4°，掃描分辨率為12 μm，管電壓60 kV，管電流120 μA，曝光時間700 ms，0.5 mm鋁過濾器[5-6]。掃描完畢后，采用設(shè)備自帶的重構(gòu)軟件NRECON(V1.6.9.4)獲得標(biāo)本的橫斷面圖。

為了分析軟骨下骨小梁參數(shù)，選取以2.05 × 2.05 × 0.6 mm3大小的感興趣容積(volume of interest，VOI)，采用CTAn(V1.14.4)軟件完成圖像二值化(閾值80～255)后并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。比較各組VOI范圍內(nèi)結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(structure model index,SMI)、骨小梁模式因子(trabecular bone pattern factor,Tb.Pf)、各向異性的程度(degree of anisotropy, DA)、骨小梁厚度 (trabecular thickness, Tb.Th)和骨小梁間隙(Trabecular Separation,Tb.Sp)。

2.膝關(guān)節(jié)的X線評估:將膝關(guān)節(jié)標(biāo)本置于10 cm深的水膜中，使用數(shù)字化移動式X線攝影系統(tǒng) (DR,SHIMADZU MUX-200D，日本)放射成像，放射條件為55 mV，14 mAs，投照高度為100 cm。由同一位放射科醫(yī)生評價各組膝關(guān)節(jié)變化情況。

結(jié) 果

一、豚鼠體質(zhì)量

(1)雌性：1月齡體質(zhì)量(316.3±7.2)g；3月齡體質(zhì)量(583.5±57.2)g；5月齡體質(zhì)量(819.8±166.3)g。(2)雄性：1月齡體質(zhì)量(363±23.9)g；3月齡體質(zhì)量(814.8±99.4)g；5月齡體質(zhì)量(951.3±65.9)g(圖1)。3月齡和5月齡雄性豚鼠體質(zhì)量明顯高于雌性豚鼠體質(zhì)量。

二、大體觀察

(1)1月齡：雌雄性豚鼠脛骨平臺、股骨髁、股骨髕面等關(guān)節(jié)面光滑平整，光澤明亮，無裂紋及軟化灶，關(guān)節(jié)邊緣規(guī)則齊平，無骨贅形成，關(guān)節(jié)軟骨外觀呈半透明。(2)3月齡：雌雄性豚鼠脛骨平臺、股骨髁、股骨髕面等關(guān)節(jié)面光滑平整，光澤明亮，無裂紋及軟化灶，關(guān)節(jié)邊緣規(guī)則齊平，無骨贅形成。(3)5月齡：雌雄性豚鼠脛骨平臺、股骨髁、股骨髕面等關(guān)節(jié)面粗糙，光澤暗淡，無裂紋及軟化灶，無骨贅形成(圖2)。

三、膝關(guān)節(jié)X線檢查

膝關(guān)節(jié)為OA的好發(fā)部位，早期常有骨摩擦音出現(xiàn)，這是關(guān)節(jié)軟骨退行性變和破裂引起的癥狀，X線檢查也無異常發(fā)現(xiàn)。與1月齡的雌雄性豚鼠膝關(guān)節(jié)相比，3月齡和5月齡雌雄性豚鼠膝關(guān)節(jié)間隙變窄。3月齡和5月齡之間關(guān)節(jié)間隙未見明顯的差異，并且未見骨贅形成(圖3)。

圖1 雌雄性豚鼠體質(zhì)量與年齡(月齡)之間的相關(guān)性(n=6)

四、Micro-CT檢查

Micro-CT掃描豚鼠后肢膝關(guān)節(jié)脛骨平臺軟骨下骨，通過軟件分析計(jì)算出ROI范圍內(nèi)Tb.Th、骨小梁間隙、SMI、 DA。與1月齡比較，3月齡和5月齡雌雄性豚鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)Tb.Th明顯增高(P<0.05)，而膝關(guān)節(jié)外側(cè)未見明顯的變化。與1月齡比較，3月齡和5月齡雌雄性豚鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)和外側(cè)SMI顯著降低(P<0.05)；在3月齡和5月齡雄性豚鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)和外側(cè)，DA顯著降低(P<0.05)，而雌性豚鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)有顯著的降低(P<0.05)。在不同的月齡、雌雄性豚鼠中Tb.Sp未見明顯的變化(圖4)。

討 論

OA是一種退變性關(guān)節(jié)疾病，病變過程中可觀察到關(guān)節(jié)軟骨、滑膜、軟骨下骨及周圍軟組織(肌肉、韌帶等)的結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨失常，傳導(dǎo)應(yīng)力負(fù)荷失常，導(dǎo)致軟骨的生物力學(xué)及生物化學(xué)環(huán)境發(fā)生改變，逐漸發(fā)生軟骨的降解質(zhì)變，最終發(fā)生軟骨變薄、纖維化、糜爛、裂隙、肉眼下潰瘍及全層關(guān)節(jié)面消失等。以往對OA的病因研究多集中于關(guān)節(jié)軟骨的破壞;近期的研究認(rèn)為，軟骨下骨改變在OA發(fā)病過程中起著促進(jìn)作用，即軟骨下骨硬化與OA 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而不只是OA的結(jié)果。一些研究結(jié)果表明，軟骨下骨動態(tài)形態(tài)的改變是OA發(fā)展中的組成部分[7-8]。這些變化與許多局部非正常生物力學(xué)通路有關(guān)，不僅影響骨的變化，而且與其他異常結(jié)構(gòu)變化一起促進(jìn)軟骨退變[9-10]。目前軟骨下骨對OA發(fā)病的先導(dǎo)作用并不確定，因此使用動物模型來探索其發(fā)病機(jī)制成為常用的研究手段。

圖2豚鼠膝關(guān)節(jié)大體形態(tài)觀察A1、3、5月齡雌性豚鼠的股骨髕面、股骨髁和脛骨平臺B1、3、5月齡雄性豚鼠的股骨髕面、股骨髁和脛骨平臺

圖3 雌雄性豚鼠膝關(guān)節(jié)X線 A～C 雌性豚鼠 D～F 雄性豚鼠

多項(xiàng)研究證明，人的關(guān)節(jié)軟骨與嚙齒類動物模型在OA發(fā)病機(jī)制上有相似之處，如人OA軟骨、小鼠和豚鼠OA模型的軟骨都能分泌血管內(nèi)皮生長因子[2,11-12]。 Hartly豚鼠原發(fā)性O(shè)A與人的原發(fā)性O(shè)A相似，并且是一種容易獲得、價格便宜、飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)的動物，因此，通常被作為骨關(guān)節(jié)炎的模型[2,13]。對雄性Hartly豚鼠的研究證明，在軟骨退行性變發(fā)生之前和發(fā)生時，軟骨下骨脆性增強(qiáng)，成骨活動增強(qiáng)，軟骨下骨參與了骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展[13]。本研究在雌性豚鼠原發(fā)性O(shè)A的研究中發(fā)現(xiàn)，雌性豚鼠在30 d時形態(tài)學(xué)結(jié)果為正常軟骨，90 d時其關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)學(xué)都已經(jīng)有中度以上的損害。年齡增加至210 d的豚鼠，形態(tài)學(xué)研究結(jié)果顯示軟骨破壞進(jìn)一步加重[2]。

對人類的流行病學(xué)研究結(jié)果表明，女性在50歲以后OA發(fā)病率明顯增加，中年女性膝關(guān)節(jié)OA患者的血清雌激素處于低水平狀態(tài)。因此，女性O(shè)A可能與絕經(jīng)后卵巢功能低下有關(guān)[14]。然而，并不是所有的婦女在絕經(jīng)以后都患OA，提示激素的單獨(dú)作用可能不足以導(dǎo)致OA。

本研究使用不同發(fā)育階段的雌雄性豚鼠，分析了性別、年齡和體質(zhì)量對膝關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨的影響。大體形態(tài)結(jié)果顯示，5月齡雌雄性豚鼠與1、3月齡相比，膝關(guān)節(jié)脛骨平臺、股骨髁、股骨髕面等關(guān)節(jié)面粗糙，光澤暗淡。X線影像結(jié)果顯示，隨著月齡的增加，關(guān)節(jié)間隙變窄。相同月齡的雄性和雌性豚鼠之間未見明顯的差異。Micro-CT分析發(fā)現(xiàn)Hartly豚鼠在OA發(fā)生發(fā)展過程中，在關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)軟骨下骨Tb.Th明顯增加而外側(cè)未見顯著變化；與1月齡相比，3月齡和5月齡豚鼠關(guān)節(jié)內(nèi)、外側(cè)SMI和DA顯著降低，雄性和雌性豚鼠呈現(xiàn)相似趨勢。這些改變一方面可能與豚鼠正常生長有關(guān)，另一方面，可能是OA進(jìn)展的始動因素或反饋效應(yīng)之一，這一問題的闡明尚有待深入研究。

綜上所述，年齡增加至5月齡的豚鼠自發(fā)性地發(fā)生膝關(guān)節(jié)OA。在1、3、5月齡豚鼠原發(fā)性O(shè)A發(fā)生發(fā)展中可能與性激素水平關(guān)系不大。3月齡和5月齡雄性豚鼠體質(zhì)量明顯高于雌性豚鼠體質(zhì)量，體質(zhì)量改變是否促進(jìn)OA的發(fā)展有待評估，至少在5月齡豚鼠難以確定。對于軟骨和軟骨下骨兩者的因果關(guān)系，在3月齡和5月齡豚鼠中也暫時難以確定。未來可利用5月齡后的豚鼠進(jìn)一步研究性別、體質(zhì)量與OA的相關(guān)性，并且進(jìn)一步闡明在OA發(fā)生發(fā)展中軟骨和軟骨下骨兩者的相互關(guān)系。

注：a為兩組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05

圖4豚鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)和外側(cè)Micro-CT參數(shù)比較