報告基因法在生物技術(shù)藥物活性檢測中的應(yīng)用

牛安娜，蘇昕，張曉鵬

1.沈陽藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071

報告基因法（reporter gene assays，RGA）是通過分子生物學(xué)手段，將報告基因整合入待測的生物系統(tǒng)中，繼而通過檢測報告基因產(chǎn)生的信號，研究特定生物學(xué)過程的方法。從廣義上講，利用熒光蛋白觀察轉(zhuǎn)染細胞的效率，或者利用抗性基因篩選陽性克隆都屬于報告基因法。具體而言，報告基因與目的基因或調(diào)控序列相連，通過檢測報告基因編碼產(chǎn)物的活性，直觀反映細胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄活性或表達水平[1]。比如將報告基因置于特定啟動子調(diào)控序列之后，可研究某種條件下啟動子的調(diào)控或特定基因調(diào)控下目的蛋白的表達。作為報告基因，其序列和功能一般均已得到鑒定，最重要的是其表達產(chǎn)物易于被檢測。報告基因法的應(yīng)用非常廣泛[2]，常用于信號通路分析、受體功能鑒定、生物大分子相互作用及藥物篩選等領(lǐng)域[3]。

1 報告基因法的發(fā)展近況

近些年，隨著生物技術(shù)藥物的蓬勃發(fā)展，報告基因法逐漸應(yīng)用于生物藥物的生物學(xué)活性檢測之中。一般是在充分理解藥物的分子藥理機制的基礎(chǔ)上，建立相應(yīng)的細胞模型，利用報告基因表征待測藥物參與的、特定的信號通路的激活，產(chǎn)生生物效應(yīng)，從而反映藥物的生物學(xué)活性。

以干擾素為例，早期就有應(yīng)用報告基因測定干擾素活性的研究[4]。在2015年版《中國藥典》中，報告基因法被收錄為Ⅰ型干擾素活性測定的標準方法之一[5]。繼干擾素后，重組人促紅細胞生成素[6]、促胰島素分泌肽融合蛋白[7]、抗血管內(nèi)皮生長因子抗體[8]、程序性凋亡受體1 抗體[9]和抗白細胞介素5 抗體[10]等生物制品相繼建立了基于報告基因的生物學(xué)活性檢測方法。基于報告基因的生物學(xué)活性測定方法的應(yīng)用范圍正在不斷擴大，應(yīng)用前景廣闊。

表1總結(jié)了近年來文獻報道的基于報告基因法的生物技術(shù)藥物活性檢測方法?？梢钥吹剑瑘蟾婊蚍ǖ膽?yīng)用基本涵蓋了生物藥物的各種類型，包括細胞因子、激素、融合蛋白藥物、抗體等。

2 生物學(xué)活性檢測與報告基因法

生物學(xué)活性是藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一[23]，是藥物有效性的保證。不同的藥品具有不同的生物學(xué)活性（表1）。生物學(xué)活性檢測也稱為效力測定或生物測定，就是用適當?shù)姆椒?，定性或定量地反映生物學(xué)活性。而為了藥物評價的需要，一般要采用定量方法得到藥物產(chǎn)生特定生物學(xué)效應(yīng)的具體量值。

從表1可以看到，利用報告基因法進行藥物活性測定基本都是在活細胞體系上通過基因工程構(gòu)建報告細胞系來建立的?；诩毎幕钚詸z測方法有其獨特優(yōu)勢：相較于生化反應(yīng)，它更能體現(xiàn)藥物的生物學(xué)活性[24]；而相對于動物實驗，細胞實驗又表現(xiàn)出更好的重復(fù)性、易操作性和更低的人力、物力、時間成本。

報告基因法與基于細胞水平的活性測定相得益彰。藥物誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生生物學(xué)應(yīng)答，這個過程中涉及特定信號通路的活化和傳導(dǎo)。而報告基因法則可以通過報告基因信號的檢測，快速表征相關(guān)信號的激活，從而反映藥物相應(yīng)的生物學(xué)活性。

報告基因法應(yīng)用于生物制品活性檢測有如下優(yōu)勢。一是快速。表1中各個生物制品相關(guān)的報告基因法基本可在1 d 內(nèi)完成檢測，遠遠優(yōu)于傳統(tǒng)方法。以干擾素為例[4]，傳統(tǒng)的噬斑法要從病毒感染到觀察到細胞病變，至少需要2 d。從這個角度而言，快速的報告基因法不僅能夠極大地降低時間成本，最重要的是提高了藥物研發(fā)的效率。二是方法變異度小。以表1中抗血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抗體的生物學(xué)活性檢測為例，報告基因法的精密度和準確性都較高（變異系數(shù)CV 均小于10%），而傳統(tǒng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）增殖法精密度和準確性的CV 都小于15%[8]。較小的變異度意味著測定結(jié)果更為真實、可靠。三是能夠反映藥品生物學(xué)活性的分子機制。中國藥典和美國藥典均指出，藥物活性測定的方法應(yīng)盡可能反映或模擬藥物預(yù)期的作用機制[5,25]，若測定方法不能反映功能相關(guān)作用機制，則需要證明其他測定方法與生物活性測定方法相關(guān)。一個成功的報告基因活性測定方法，正是利用了藥品活性相關(guān)的信號通路，從而能夠直觀地反映藥物的作用機制。

表1 報告基因檢測在生物藥物活性檢測領(lǐng)域的應(yīng)用

3 報告基因法的要素

用于生物學(xué)活性檢測的報告基因法在建立之初主要考慮3 個要素：檢測用細胞、待測的報告基因，以及涉及的信號通路的選擇。

3.1 檢測用細胞的選擇

為了檢測方法的穩(wěn)定性，檢測所用細胞一般選用能夠穩(wěn)定傳代的細胞系或細胞株，以方便報告基因的轉(zhuǎn)基因操作和細胞的克隆化。由原代細胞或不穩(wěn)定的細胞系構(gòu)建的報告細胞，無法保證本次檢測時細胞的狀態(tài)一致，也就無法準確、定量地反映待測藥品的質(zhì)量。同時，檢測用細胞還要盡量考慮是待測藥物的靶細胞，藥物刺激與靶細胞產(chǎn)生的變化相關(guān)，這樣能更加真實地反映待測藥物的活性，也便于與其他方法進行比較。例如，在測定抗白細胞介素6（IL-6）/IL-6 受體（IL-6R）抗體藥物的生物學(xué)活性研究中，作者選用IL-6 依賴的DS-1 細胞作為測定的靶細胞[21]。DS-1 是 IL-6 依賴的 B 淋巴細胞，只能在 IL-6 存在的條件下存活。靶表面含IL-6R，能與IL-6 結(jié)合激活下游信號通路，在機體免疫中發(fā)揮重要作用。抗IL-6/IL-6R 抗體藥物可阻斷IL-6/IL-6R 相互作用，用于治療免疫相關(guān)疾病。選用DS-1 作為靶細胞更能真實地模擬抗IL-6/IL-6R 抗體藥物作用的機制。

3.2 報告基因的選擇

報告基因是編碼基因，其編碼產(chǎn)物可以是某些蛋白或酶類[26]。迄今發(fā)展的報告基因種類很多，在不同領(lǐng)域的應(yīng)用也非常廣泛。選擇報告基因的原則，一是要考慮報告基因的表達是否對宿主細胞有影響，是否有內(nèi)源性活性的干擾[27]；二是要考慮報告基因檢測信號的類型和相應(yīng)的檢測方法是否成熟。

常用的報告基因有CAT（氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶）、SEAP（分泌型堿性磷酸酶）、GFP（綠色熒光蛋白）、β-半乳糖苷酶、GUS（葡萄糖醛酸酶）等[28]。但如表1所示，生物制品活性測定中多采用螢光素酶基因作為報告基因。相對于其他報告基因，螢光素酶具有諸多優(yōu)勢：檢測靈敏度高，如螢火蟲螢光素酶的檢測靈敏度可達10-20mol[29]，靈敏度約為CAT的100 倍，信號半衰期可維持數(shù)小時；檢測范圍寬，可達7～8 個數(shù)量級[30]；與β半乳糖苷酶相比，哺乳動物細胞無內(nèi)源性螢光素酶活性[31]；有多種商品化螢光素酶檢測系統(tǒng)可選。

3.3 細胞信號通路的選擇

藥物作用于細胞，細胞內(nèi)會產(chǎn)生多種效應(yīng)，最終表現(xiàn)可能是促進細胞增殖，或抑制細胞增殖、產(chǎn)生細胞毒效應(yīng)或抗病毒效應(yīng)等[32]。在分子層面上，這些表型的背后勢必涉及多條信號通路的協(xié)同、競爭和整合。因此，應(yīng)盡量選擇與最終細胞表型相關(guān)、最能反映藥品藥理性質(zhì)的通路。這就要求對藥品的作用機制有全面的理解。如若不然，選擇其他通路雖然也能反映藥物活性，但是違背了藥典的“應(yīng)盡可能反映或模擬產(chǎn)品預(yù)期的作用機制”的原則。例如，在采用螢光素酶報告基因法篩選5-羥色胺（5-HT）受體藥物介導(dǎo)信號通路的研究中[33]，作者詳細比較了藥物刺激后 3 種相關(guān)信號通路 SRE、CRE、NAFT 引起細胞效應(yīng)的變化，分別得到了不同的信噪比和半數(shù)有效量。結(jié)果顯示，相比較于NFAT-Luc，CRE-Luc與SRE-Luc 方法的信噪比較高。但由于SRE-Luc易受細胞培養(yǎng)基中血清的干擾而影響實驗結(jié)果，而CRE-Luc 不受血清影響，更能反映受體激活狀態(tài)，因此最終選擇CRE-Luc 信號通路用于篩選不同的5-HT 受體激動劑和抑制劑。

4 報告基因法在生物藥物研發(fā)中的應(yīng)用

基于報告基因法檢測藥品生物學(xué)活性，除了可用于最終產(chǎn)品質(zhì)量的檢定和放行[34]，也可用于生物制藥的各個階段。

可用于早期候選分子的設(shè)計與篩選。由于報告基因法簡單快速，可以構(gòu)建相應(yīng)的高通量篩選方法[35]。如高通量篩選γ-珠蛋白基因的激活劑，利用螢光素酶雙報告基因法，從約15 000 個化合物的庫中篩選得到1072 個具有生物學(xué)活性的化合物，在此過程中報告基因的檢測用時約2 h，極大地提高了藥物的篩選效率[36]。

可用于生物制品生產(chǎn)工藝的優(yōu)化。在生產(chǎn)工藝建立和優(yōu)化的過程中，經(jīng)常需要摸索大量實驗條件，對不同條件下獲得的樣品進行檢測，隨后根據(jù)檢測結(jié)果進一步優(yōu)化實驗條件。這一過程中生物學(xué)活性檢測往往是限速步驟。報告基因法的引入可以很好地解決這個問題，而且適用于實驗設(shè)計研究方法[37]。

更為重要的是，報告基因法靈敏度高，可以檢測到因生產(chǎn)工藝變化帶來的對產(chǎn)品生物學(xué)活性的微小影響。不同生產(chǎn)工藝會影響蛋白翻譯后修飾[38]，進而造成產(chǎn)品的生物學(xué)活性變化。這些變化一般很小，常規(guī)活性檢測方法由于方法本身變異度較大，會掩蓋掉這些微小差異。因此，在本階段采用報告基因法進行活性檢測，可以使生產(chǎn)工藝的優(yōu)化和質(zhì)量研究更加有效。

5 結(jié)語

生物學(xué)活性測定方法多種多樣，發(fā)展迅速，而報告基因檢測方法可通過報告基因直觀地反應(yīng)藥物的生物學(xué)活性及更深層的藥物作用機理，目前已應(yīng)用到許多藥物的生物學(xué)活性檢測中。近年來報告基因法也應(yīng)用于免疫和腫瘤藥物領(lǐng)域，如一些腫瘤相關(guān)的免疫抑制檢查點藥物活性檢測也應(yīng)用報告基因法反映藥物的活性和作用機制。由于報告基因法具有快速、靈敏及易于高通量的特點，利用其檢測生物制品的生物學(xué)活性，可以應(yīng)用于從靶點篩選、生產(chǎn)工藝驗證到終產(chǎn)品的質(zhì)量控制等藥物研究的各個階段，加速藥物的研發(fā)。報告基因法還可以反映藥物的分子機制，從而更加準確地表征其生物學(xué)活性。在我國生物制品研究快速發(fā)展的今天，報告基因法的應(yīng)用有利于生物制品質(zhì)量體系的建立和規(guī)范，促進產(chǎn)業(yè)發(fā)展。