豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)與RV-23抗菌肽復(fù)合材料的制備及生物學(xué)特性初步研究

李文，季守平

軍事醫(yī)學(xué)研究院 衛(wèi)生勤務(wù)與血液研究所，北京 100850

脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（acellular dermal matrix，ADM）是組織再生修復(fù)材料的研發(fā)熱點(diǎn)。ADM 是將人或動物的真皮組織用物理化學(xué)和生物方法去除表皮及皮內(nèi)細(xì)胞成分后獲得的細(xì)胞外基質(zhì)成分，具有天然三維結(jié)構(gòu)[1]。ADM的主要成分，如膠原蛋白、非膠原糖蛋白、彈力纖維、分散在彈力纖維中的黏多糖、蛋白聚糖和結(jié)締組織糖蛋白都與創(chuàng)傷修復(fù)密切相關(guān)[2]。ADM 材料能夠吸附血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF），維持其生物活性[3]。此外，ADM 降解產(chǎn)生的甘氨酰-組氨酰-賴氨酸（GHK）三肽，也具有促進(jìn)膠原、黏多糖和蛋白聚糖合成，激發(fā)脯氨酸酶活性，促進(jìn)血管生成等生物學(xué)功能，加速傷口愈合[4-5]。ADM 生物相容性好，不易損壞，具有良好的細(xì)胞親和性。而且，ADM 成分結(jié)構(gòu)與細(xì)胞生長的微環(huán)境相似，能誘導(dǎo)上皮組織再生，應(yīng)用前景廣闊[6]。按來源不同，ADM 可分為人ADM 和異種ADM。人ADM 免疫反應(yīng)低、療效好，但來源有限，難以在臨床上大量應(yīng)用[7]。因此，來源廣泛、價(jià)格低廉的豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（porcine ADM，PADM）進(jìn)入人們的研究視野。PADM 在皮膚的三維結(jié)構(gòu)、生物性狀和免疫特性等方面與人的相似，已在燒傷、整形、創(chuàng)傷修復(fù)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[8-10]。但是，PADM 殘留異種抗原（α-Gal 抗原）會引起較強(qiáng)的異種免疫反應(yīng)。我們在前期研究中，用α-半乳糖苷酶清除α-Gal 抗原，獲得低免疫原PADM。經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理總局檢定，發(fā)現(xiàn)α-Gal 抗原清除率超過90%[11]。

為了避免傷口愈合和組織修復(fù)中可能發(fā)生的細(xì)菌感染，我們將抗菌肽RV-23 與PADM 微粒混合，制備兼具抗感染及再生修復(fù)功能的復(fù)合材料。RV-23 來源于加州紅腿蛙[12]，由23 個(gè)氨基酸殘基組成，具有α螺旋結(jié)構(gòu)，可與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)菌去極化，使細(xì)胞膜形成孔洞，導(dǎo)致細(xì)菌裂解死亡，具有廣譜抑制細(xì)菌生長活性[13]。據(jù)報(bào)道，作為一種細(xì)菌選擇性抗菌肽，RV-23 具有良好的血液相容性，不影響紅細(xì)胞、血小板、白蛋白、凝血系統(tǒng)等血液成分的結(jié)構(gòu)和功能[14]。但RV-23 單獨(dú)使用對真核細(xì)胞也有一定的細(xì)胞毒性，阻礙了其臨床應(yīng)用。在本研究中，我們制備的PADM 和RV-23 復(fù)合材料具有較強(qiáng)的抗菌性和較低的溶血性，對真核細(xì)胞的毒性進(jìn)一步減弱，且該材料穩(wěn)定性強(qiáng)，作為新型醫(yī)用抗菌敷料具有良好的使用價(jià)值和開發(fā)前景。

1 材料與方法

1.1 材料

人表皮角化細(xì)胞HaCaT 由本實(shí)驗(yàn)保存；人新鮮全血由解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心輸血科提供；PADM 薄片及粉末由本實(shí)驗(yàn)室制備；RV-23 抗菌肽由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；DMEM 培養(yǎng)基、MEM 培養(yǎng)基購自 Gibco 公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；增強(qiáng)型CCK-8 試劑購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Tricine-SDS-PAGE 凝膠試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉購自Sigma 公司；TritonX-100 購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 制備PADM/RV-23復(fù)合材料

用無菌超純水將抗菌肽溶解成1000 μmol/L的母液；將PADM 用純水清洗3 次，每次1 h，用打孔器切成直徑6 mm 厚度約1 mm的小圓片，在超凈工作臺中晾干，分別加入20、5、1 μL 抗菌肽溶液，在超凈工作臺上完全晾干，制備PADM/RV-23復(fù)合材料。

1.3 菌落計(jì)數(shù)

挑取大腸桿菌DH5α于10 mL LB 液體培養(yǎng)基中，200 r/min、37℃振蕩過夜，待D600nm為0.5（2×108CFU/mL）時(shí)，用 PBS 稀釋至 1/1000，吸取 100 μL 于 1.5 mL的 EP 管中，向 EP 管中加入 PADM/RV-23 復(fù)合材料，37℃孵育 2 h，用 PBS 稀釋至 1/100，取 100 μL 涂固體 LB 平板，37℃倒置過夜培養(yǎng)，拍照計(jì)數(shù)。

1.4 溶血實(shí)驗(yàn)

人新鮮紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌3 次，每次加入10 mL 生理鹽水，混勻，2000 r/min 離心5 min。洗滌后，用PBS 稀釋為1%壓積的紅細(xì)胞，向1.5 mL的 EP 管中加入 500 μL，再加入 PADM/RV-23 復(fù)合材料，用1%的TritonX-100 作為陽性對照，不加復(fù)合材料而只加PBS 作為陰性對照，37℃孵育 30 min，500 r/min 離心5 min，拍照，取上清液 100 μL 至 96 孔板中，檢測D450nm值。

1.5 CCK-8真核細(xì)胞毒性檢測

將HaCaT 或NIH-3T3 細(xì)胞消化、離心、計(jì)數(shù)，以5×103/孔的密度接種到96 孔板，37℃恒溫培養(yǎng)至細(xì)胞匯合率為70%～80%，向EP 管中加入200 μL 無血清的DMEM（HaCaT細(xì)胞用MEM培養(yǎng)基）,加入PADM/RV-23 復(fù)合材料，37℃孵育2 h，加入含20%胎牛血清的DMEM，混勻后換到96 孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入增強(qiáng)型CCK-8 溶液，37℃孵育1.5 h，測D450nm值。

1.6 考馬斯亮藍(lán)染色

取10 mg PADM/RV-23 復(fù)合材料凍干粉末于EP 管中，加入 100 μL 去離子水，再加入 2×還原性Tricine 專用上樣緩沖液100 μL，100℃煮沸8 min。配制16.5%的分離膠和夾層膠、濃縮膠，30 V 電壓預(yù)電泳 10 min，再加入 20 μL 樣品，30 V電壓電泳60 min，然后100 V 電壓電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)底部。電泳結(jié)束后，將Tricine-SDS-PAGE 膠放入燒杯中，加入考馬斯亮藍(lán)染色液，覆蓋膠面，放置在水平搖床上染色過夜，倒出染色液，加入脫色液脫色4～6 h，加入去離子水浸泡，拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19 統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PADM/RV-23復(fù)合材料具有較高的抗菌活性

由圖1可以看出，PADM 和 PADM/RV-23 復(fù)合材料對細(xì)菌都有不同程度的抑制作用。隨著RV-23 濃度的升高，PADM/RV-23 復(fù)合物實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌存活越來越低，當(dāng)RV-23 濃度為20 μmol/L時(shí)，細(xì)菌存活僅為（0.59±1.15）%，提示RV-23 復(fù)合PADM 后仍然具有較好的抗菌效果。

2.2 PADM/RV-23復(fù)合材料具備較低的溶血能力

據(jù)報(bào)道，抗菌肽在細(xì)菌細(xì)胞膜上打孔致使細(xì)胞破裂、死亡[15]，因此我們檢測了PADM/RV-23 復(fù)合材料對紅細(xì)胞的溶血能力，發(fā)現(xiàn)PADM 可以降低RV-23的溶血活性。無論復(fù)合材料還是RV-23 組，隨著抗菌肽RV-23 濃度的升高，溶血活性都會提高，但同濃度相比，復(fù)合材料組的溶血活性低于RV-23 組（圖2）。

以上結(jié)果提示，PADM 對RV-23的溶血性能具有很好的屏蔽作用，很大程度地減弱了抗菌肽RV-23 對真核紅細(xì)胞膜的溶破作用。

2.3 PADM/RV-23復(fù)合材料對上皮細(xì)胞無副作用

圖1 PADM/RV-23復(fù)合材料顯著抑制細(xì)菌生長

由于PADM 敷料基本應(yīng)用于傷口創(chuàng)面，我們檢測了PADM/RV-23 復(fù)合材料對人表皮角化細(xì)胞HaCaT 和鼠成纖維細(xì)胞NIH-3T3的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RV-23 對2 種細(xì)胞的毒性隨著濃度的升高而增加，PADM/RV-23 復(fù)合材料基本不影響HaCaT 和NIH-3T3的增殖（圖3）。例如，對于HaCaT 細(xì)胞，RV-23 濃度為 20 μmol/L 時(shí) PR20 組細(xì)胞活性為（103.97 ± 2.33）% ，單獨(dú)RV-23組為（37.46 ±4.27）%。對于NIH-3T3 細(xì)胞，也取得類似結(jié)果。

2.4 PADM/RV-23復(fù)合材料性質(zhì)穩(wěn)定

將制備的復(fù)合材料室溫保存1 個(gè)月，然后進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE，檢測RV-23 是否降解。結(jié)果見圖4，當(dāng)PADM/RV-23 復(fù)合材料所含RV-23抗菌肽濃度分別為1、5 和20 μmol/L 時(shí)都有明顯條帶，說明該復(fù)合材料室溫放置1 個(gè)月后RV-23仍然沒有降解，提示該復(fù)合材料較穩(wěn)定。

圖2 PADM/RV-23復(fù)合材料對紅細(xì)胞的溶血作用

圖3 PADM/RV-23復(fù)合材料對上皮細(xì)胞的毒性

圖4 抗菌肽RV-23的Tricine-SDS-PAGE

3 討論

豬皮結(jié)構(gòu)與人皮膚結(jié)構(gòu)相似，具有保持傷口濕潤環(huán)境、減少疼痛、促進(jìn)痊愈、減少瘢痕形成等作用，可用于深度燒傷的治療，但其臨床應(yīng)用的最大障礙是異種免疫排斥反應(yīng)。脫細(xì)胞制備PADM 過程中，去除了大部分異種抗原，大大降低了免疫排斥反應(yīng)。同時(shí)，PADM 保留了完整的膠原三維結(jié)構(gòu)，不僅為再生修復(fù)提供支架，還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移、增殖、分化，加快傷口愈合[16-17]，因此廣泛用于創(chuàng)傷、燒傷治療以及整形美容等領(lǐng)域[18]。目前市場上的PADM 有α-Gal 抗原，免疫原性高。為此，我們實(shí)驗(yàn)室用α-半乳糖苷酶清除PADM 上的α-Gal 抗原，制備了免疫原性更低、生物相容性更好的PADM。

感染是影響創(chuàng)面愈合的重要因素，而耐藥菌感染不僅延誤創(chuàng)傷治療，而且有可能危及患者生命。在本研究中，我們將抗菌肽RV-23 和低免疫原PADM 結(jié)合，制備了PADM/RV-23 復(fù)合材料，評價(jià)其抗菌性、溶血性以及對HaCaT 和NIH-3T3 細(xì)胞的毒性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該復(fù)合物在保留了較強(qiáng)抑菌作用的同時(shí)，還具備紅細(xì)胞的溶血作用較低，對上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞無毒性等優(yōu)點(diǎn)，性質(zhì)穩(wěn)定，作為新型抗菌敷料具有良好的使用價(jià)值和開發(fā)前景。