β-半乳糖苷酶的微生物細(xì)胞表面展示及其應(yīng)用

蔣曉敏，王賀，王允祥,，錢永常，尹良鴻，范麗

1(浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州，311300) 2(浙江農(nóng)林大學(xué) 暨陽學(xué)院，浙江 紹興，311800) 3(浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州，311300)

β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23 β-galactosidase)不僅能水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖，也會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)產(chǎn)生非消化性的低聚半乳糖(galactooligosaccharides，GOS)，具水解和轉(zhuǎn)糖苷雙重活力。因此，該酶廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)學(xué)和生化分析等領(lǐng)域。目前，商用β-半乳糖苷酶的主要生產(chǎn)方式是微生物發(fā)酵[1]，且多呈游離態(tài)。但游離的β-半乳糖苷酶存在提純過程繁瑣、傳質(zhì)阻力大等缺陷。雖然固定化酶技術(shù)在一定程度上有所改進(jìn)，但固定化仍要提供純化的酶源，還有固定化過程會(huì)造成大量的酶損失和活性降低等問題，因而限制了β-半乳糖苷酶在工業(yè)上的進(jìn)一步應(yīng)用。

近年來，微生物細(xì)胞表面展示技術(shù)的迅速發(fā)展為β-半乳糖苷酶的研究提供了新的視角。微生物細(xì)胞表面展示技術(shù)的基本原理是通過DNA重組技術(shù)把外源蛋白或多肽基因與宿主特定的錨定蛋白基因融合導(dǎo)入宿主中，利用該錨定蛋白的定位作用從而將外源蛋白或多肽固定化表達(dá)在細(xì)胞表面[2]。利用微生物細(xì)胞表面展示技術(shù)將β-半乳糖苷酶定位展示在細(xì)胞表面，不但省去了復(fù)雜的分離純化和固定化操作，而且展示在細(xì)胞表面的β-半乳糖苷酶顯示出優(yōu)良的穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑耐受性[3]。

由于β-半乳糖苷酶是由4個(gè)亞基組成的四聚體蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量較大。鑒于此，該展示系統(tǒng)宿主的研究主要集中于乳酸菌、酵母、芽孢這3類。本文將綜述不同宿主中β-半乳糖苷酶表面展示系統(tǒng)及其應(yīng)用的進(jìn)展。

1 不同的β-半乳糖苷酶微生物細(xì)胞表面展示系統(tǒng)

根據(jù)宿主的不同，β-半乳糖苷酶微生物細(xì)胞表面展示系統(tǒng)可分為乳酸菌細(xì)胞表面展示、酵母細(xì)胞表面展示和芽孢表面展示(表1)。

1.1 β-半乳糖苷酶的乳酸菌細(xì)胞表面展示系統(tǒng)

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是將活性分子傳遞到黏膜組織的理想載體，有些菌株具有益生菌的特性，被世界衛(wèi)生組織公認(rèn)為是安全的。構(gòu)建乳酸菌表面展示系統(tǒng)需要有信號(hào)肽和錨定結(jié)構(gòu)域基本元件。目標(biāo)蛋白可以與跨膜蛋白或脂蛋白重組共價(jià)錨定在細(xì)胞膜上，或者利用被分選酶識(shí)別的保守基序(Leu-Pro-X-Thr-Gly，LPxTG)以共價(jià)或通過表層蛋白(S層蛋白)、自溶素基序(Lysine motif，LysM)結(jié)構(gòu)域等非共價(jià)結(jié)合到細(xì)胞壁上[4]，見圖1所示。

表1 β-半乳糖苷酶微生物細(xì)胞表面展示系統(tǒng)

圖1 乳酸菌細(xì)胞表面展示系統(tǒng)

Fig.1 Methods for target protein display in LAB using different anchor proteins

由于β-半乳糖苷酶是大分子蛋白，圖1中跨膜蛋白、脂蛋白、LPxTG基序3種表面展示模型都需要目標(biāo)蛋白穿越細(xì)胞膜與細(xì)胞壁，這一過程極有可能導(dǎo)致蛋白無法正確折疊或者無法正常分泌。所以，目前在乳酸菌表面展示β-半乳糖苷酶的策略主要集中在S層蛋白和內(nèi)溶素的LysM重復(fù)序列這2種體外展示機(jī)制。S層蛋白是乳酸菌細(xì)胞壁上的表層蛋白，通常包含2個(gè)功能區(qū)域：細(xì)胞壁結(jié)合區(qū)和自組裝區(qū)。細(xì)胞壁結(jié)合區(qū)主要利用該部分的堿性氨基酸與帶負(fù)電荷的細(xì)胞壁次級(jí)聚合物之間的相互作用來介導(dǎo)細(xì)胞壁結(jié)合。自組裝區(qū)則能在不受融合模塊影響的同時(shí)將功能序列展示在S層蛋白最外層表面上[5]。這2個(gè)特殊功能區(qū)域使得β-半乳糖苷酶這類大分子蛋白展示在乳酸菌細(xì)胞表面成為可能。

目前，以LAB作為β-半乳糖苷酶的展示宿主主要有2種策略，一是目標(biāo)蛋白與LAB錨定蛋白融合后經(jīng)E.coli表達(dá)后，通過體外吸附方式固定在由三氯乙酸處理得到的LAB靜息細(xì)胞表面；另一種方式是利用熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)纖維小體中的黏附模塊(Cohesin)與錨定蛋白融合而固定在LAB細(xì)胞表面，目標(biāo)蛋白與對(duì)接模塊(Dockerin)進(jìn)行融合表達(dá)使目的酶基因攜帶對(duì)接模塊的分子標(biāo)簽，然后通過黏附模塊和對(duì)接模塊之間的特異性相互作用，引導(dǎo)帶有對(duì)接模塊分子標(biāo)簽的β-半乳糖苷酶定量地展示在LAB細(xì)胞表面(圖2)。HU等[6]利用卷曲乳桿菌(LactobacilluscrispatusK2-4-3)的S層蛋白(SlpB)的C端區(qū)域(LcsB)作為錨定基序，以N-端融合方式與類芽孢桿菌(Paenibacillussp. K1)β-半乳糖苷酶基因重組，在E.coliOrigami B (DE3)胞內(nèi)表達(dá)獲得含融合蛋白的細(xì)胞裂解物，在37 ℃、1 h條件下與經(jīng)過化學(xué)物質(zhì)處理的Lactococcuslactis、Lb.crispatus、Lactobacillusbrevis、Lactobacillusdelbrueckii、Lactobacillushelveticus等乳酸菌靜息細(xì)胞進(jìn)行體外吸附結(jié)合試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該酶可成功錨定在上述乳酸菌細(xì)胞表面，并檢測(cè)到一定量的酶活。有意思的是，但卻無法通過基因重組技術(shù)以體內(nèi)方式將β-半乳糖苷酶固定在乳酸菌細(xì)胞表面，推測(cè)可能與該酶在展示表達(dá)過程中無法正確折疊或分泌效率極低有關(guān)。該課題組[7]也根據(jù)LysM序列能與肽聚糖和甲殼素非共價(jià)結(jié)合這一特性[8]，將類芽孢桿菌β-半乳糖苷酶基因與發(fā)酵乳桿菌(LactobacillusfermentumK37)溫和噬菌體фPYB5內(nèi)溶素(Ly5C)基因構(gòu)建融合蛋白，以體外方式成功展示在L.lactis、Lb.brevis、Lactobacilluscasei和Lactobacillusplantarum等乳酸菌細(xì)胞表面，但表現(xiàn)出的活性顯著低于LcsB構(gòu)建的。此外，XU等[9]以植物乳桿菌細(xì)胞壁蛋白MurO為錨定蛋白成功將兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidium)β-半乳糖苷酶定位在活的Lb.plantarum細(xì)胞表面。從這些研究結(jié)果可知，對(duì)β-半乳糖苷酶進(jìn)行乳酸菌細(xì)胞表面展示更多地是采用體外吸附展示策略，但這一策略不僅要提供融合有錨定蛋白的β-半乳糖苷酶酶液，還需要在吸附結(jié)合前對(duì)乳酸菌細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)處理，且目標(biāo)酶蛋白易于脫落。

A-通過體外吸附方式展示在LAB細(xì)胞表面；B-利用“Cohesin-Dockerin”特異性相互作用原理展示在LAB細(xì)胞表面圖2 β-半乳糖苷酶乳酸菌細(xì)胞表面展示策略

Fig.2 Schematic representation of strategies for β-gala- ctosidase surface display in LAB

圍繞著如何提高β-半乳糖苷酶的展示效率，研究者們亦開發(fā)了一些新型乳酸菌表面展示系統(tǒng)。WIECZOREK等[10]利用熱纖梭菌纖維小體中的對(duì)接模塊和黏附模塊相互作用原理，把E.coliMG1655的β-半乳糖苷酶融合到1型或2型的對(duì)接模塊，再與展示在L.lactishtraNZ9000細(xì)胞表面的1型或2型黏附模塊蛋白結(jié)合，從而將β-半乳糖苷酶復(fù)合物成功展示在乳酸菌細(xì)胞表面，且1型的酶活達(dá)到1.4×10-8μmol/L PNP/min/cell，約為2型的2倍。研究表明，β-半乳糖苷酶的分子尺寸、結(jié)合順序、在支架內(nèi)的位置不同所對(duì)應(yīng)的酶活確實(shí)存在差異，這為探索β-半乳糖苷酶表面展示領(lǐng)域提供了有價(jià)值的參考。

1.2 β-半乳糖苷酶的酵母細(xì)胞表面展示系統(tǒng)

與乳酸菌非共價(jià)結(jié)合β-半乳糖苷酶的展示方式不同，酵母細(xì)胞表面展示系統(tǒng)擁有真核宿主分泌表達(dá)的優(yōu)良特性，能促進(jìn)β-半乳糖苷酶正確折疊和有效分泌，不需要額外的純化和固定化步驟[11]。β-半乳糖苷酶的酵母細(xì)胞表面展示系統(tǒng)由β-半乳糖苷酶、錨定蛋白、連接肽、酵母細(xì)胞4個(gè)基本元件組成，其中已報(bào)道的錨定蛋白有α-凝集素和Pir蛋白(圖3)。

圖3 β-半乳糖苷酶酵母細(xì)胞表面展示系統(tǒng)

Fig.3 Cell surface display of β-galactosidase in yeast

β-半乳糖苷酶與錨定蛋白彼此間通過一小段連接肽組成融合蛋白，利用錨定蛋白與細(xì)胞壁的結(jié)合結(jié)構(gòu)域成功展示在酵母細(xì)胞表面。目前，α-凝集素是釀酒酵母細(xì)胞表面展示體系中最常用的錨定蛋白[12]。LI等[13]將擴(kuò)展青霉(PenicilliumexpansumF3)β-半乳糖苷酶編碼基因(bgaF3)與α-凝集素Aga2亞基的C端融合，然后通過以二硫鍵共價(jià)結(jié)合的Aga1p而固定表達(dá)在釀酒酵母(SaccharomycescerevisiaeEBY-100)細(xì)胞表面，免疫熒光顯微鏡和酶活測(cè)定結(jié)果確證了β-半乳糖苷酶的成功展示。

此外，有學(xué)者利用解脂耶羅維亞酵母(Yarrowialipolytica)細(xì)胞壁蛋白Pir作為錨定蛋白用來展示米曲霉(Aspergillusoryzae)β-半乳糖苷酶[14]。該研究小組還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以乳糖作為碳源時(shí)可篩得具有較高赤蘚糖醇合成能力的重組子，而且引入的2個(gè)組成型啟動(dòng)子FABIN和hp4d在增強(qiáng)β-半乳糖苷酶誘導(dǎo)表達(dá)水平方面無顯著差異。

1.3 β-半乳糖苷酶的芽孢表面展示系統(tǒng)

作為一種新型的微生物表面展示系統(tǒng)，芽孢表面展示技術(shù)以其獨(dú)特的形成機(jī)制和理化特性賦予了外源蛋白特殊的展示過程和優(yōu)良的抗逆性，并在相對(duì)分子質(zhì)量高的多聚體蛋白生產(chǎn)、疫苗制備、工業(yè)用酶生產(chǎn)等方面展現(xiàn)出眾多優(yōu)勢(shì)和巨大應(yīng)用潛力，日益成為國內(nèi)外科研人員研究的熱點(diǎn)[15-17]。在芽孢桿菌屬中，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)因其清晰的遺傳背景、成熟的表達(dá)系統(tǒng)以及食用安全性等優(yōu)勢(shì)，使之成為進(jìn)行芽孢表面展示的理想平臺(tái)。推測(cè)的芽孢表面展示過程見圖4所示[17]。

藍(lán)色-錨定蛋白；紅色-目標(biāo)蛋白圖4 推測(cè)的芽孢表面展示過程示意圖

Fig.4 Schematic of a possible process for the development of spore-surface display

由圖4可知，外源目的蛋白編碼基因與含有自身啟動(dòng)子的錨定蛋白基因融合，得到融合基因表達(dá)載體，之后轉(zhuǎn)入芽孢桿菌胞內(nèi)，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，融合基因在孢子母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并通過錨定蛋白的定位而完成在芽孢表面的附著，最后母細(xì)胞裂解釋放出成熟的芽孢。近年來，圍繞如何提高枯草芽孢桿菌芽孢表面展示效率進(jìn)行了大量研究，提出了選擇合適的錨定蛋白，引入誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和適宜的linker調(diào)控表達(dá)，增加外源基因拷貝數(shù)，敲除部分高豐度、非必須型衣殼蛋白編碼基因等策略。

由于芽孢外層的衣殼蛋白的特性，使得芽孢對(duì)惡劣環(huán)境具有高度抵抗能力，并且具有長時(shí)間保持休眠的能力。這一特性使得融合蛋白的熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑耐受性等得以提高。有研究表明[18]，β-半乳糖苷酶的芽孢表面展示系統(tǒng)中芽孢的存在不但不影響酶的最適pH和溫度，而且還保護(hù)被吸附的β-半乳糖苷酶不受酸性pH條件的影響。相比于乳酸菌、酵母等展示系統(tǒng)要求目標(biāo)蛋白穿過細(xì)胞膜，芽孢結(jié)構(gòu)比較特殊無細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，克服了目標(biāo)蛋白折疊不正確和定位不準(zhǔn)確等問題[15]。這一特殊機(jī)制使得β-半乳糖苷酶這類大分子蛋白在芽孢表面高效表達(dá)成為可能。

一般地，芽孢表面展示體系分為重組型芽孢表面展示體系、非重組型芽孢表面展示體系和無錨定蛋白型芽孢表面展示體系。近年來，開展β-半乳糖苷酶重組型芽孢表面展示的研究很多，已報(bào)道的錨定蛋白有CotB、CotC、CotE、CotG、CotX、CotY、CotZ和InhA，其分布位置主要集中在芽孢的外層與crust層。早在2009年，KIM等[19]利用枯草芽孢桿菌的衣殼蛋白CotE作為分子載體展示E.coliβ-半乳糖苷酶，結(jié)果顯示其酶活遠(yuǎn)低于CotG作為分子載體得到的。HWANG等[20]以CotE和CotG為錨定蛋白展示E.coliβ-半乳糖苷酶時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用CotE時(shí)芽孢壁的完整性會(huì)受到影響，然而當(dāng)錨定蛋白是CotG時(shí)芽孢壁則完全不受影響，表明CotG是展示E.coliβ-半乳糖苷酶的較佳錨定蛋白。有國內(nèi)學(xué)者[21-23]將嗜熱脂肪芽孢桿菌(BacillusstearothermophilusIAM11001)β-半乳糖苷酶分別與CotB、CotC、CotG、CotX、CotY、CotZ融合，在B.subtilis168芽孢上成功展示β-半乳糖苷酶，測(cè)得酶活依次為0.30、0.14、0.46、0.42、0.12和0.25 U/mg芽孢(干重)。通過上述分析可知，重組芽孢表面展示的β-半乳糖苷酶活力與錨定蛋白的分布位置、分子尺寸大小有直接關(guān)系，表明錨定蛋白成為影響β-半乳糖苷酶展示效率的關(guān)鍵因素。

根據(jù)推測(cè)的芽孢表面展示過程及芽孢結(jié)構(gòu)，目標(biāo)蛋白與錨定蛋白形成的融合蛋白由于在芽孢表層的位置分布特點(diǎn)，其表達(dá)效率會(huì)在一定程度上受到某些豐富的、不完全協(xié)同的芽孢衣殼蛋白的影響。例如，TAVASSOLI等[24]利用CotC將B.subtilis168 β-半乳糖苷酶分別展示在野生型和CotC缺失型芽孢表面，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者重復(fù)使用3次后殘留酶活僅保留了50%，而后者仍達(dá)初始酶活的80%，說明CotC的缺失有助于進(jìn)一步增強(qiáng)β-半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性。表達(dá)載體的類型也是影響展示效率的因素之一。WANG等[23]以CotX為錨定蛋白研究了整合型和游離型表達(dá)方式對(duì)B.stearothermophilusIAM11001 β-半乳糖苷酶在芽孢表面展示效果的影響，兩種表達(dá)方式得到的活力分別為0.42和1.34 U/mg芽孢(干重)，表明游離型表達(dá)方式更有利于β-半乳糖苷酶在芽孢表面進(jìn)行展示。

相較于重組型芽孢表面展示體系，非重組型芽孢表面展示體系和無錨定蛋白型芽孢表面展示體系的提出與構(gòu)建為目標(biāo)蛋白的表達(dá)提供了新思路。非重組型芽孢表面展示體系主要利用在酸性介質(zhì)中外源蛋白與芽孢表面之間的吸附作用，這種展示策略類似于以芽孢為基質(zhì)的固定化。SIREC等[18]利用芽孢吸附作用原理把酸熱脂環(huán)酸桿菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)β-半乳糖苷酶展示在芽孢表面，通過對(duì)crust層蛋白缺失的突變型與野生型芽孢進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)缺失任一crust層蛋白、外層結(jié)構(gòu)完全缺失的芽孢比野生型芽孢具有更高的吸附效率。與非重組型芽孢表面展示體系相比，無錨定蛋白型芽孢表面展示體系是基于σE和σK控制的時(shí)期特異性型啟動(dòng)子Pcry1Aa調(diào)控外源蛋白在芽孢形成后期的芽孢母細(xì)胞中表達(dá)進(jìn)而分泌在芽孢表層策略，芽孢結(jié)構(gòu)的疏水性、高電荷或靜電的芽孢表層對(duì)外源蛋白的吸附也起到促進(jìn)作用[25]。通過這種方式構(gòu)建的展示體系既省去了酶制劑的提純步驟，也克服了目標(biāo)蛋白易于脫離芽孢的問題。2014年，PAN等[25]首次報(bào)道了在不使用錨定蛋白情況下利用Pcry1Aa啟動(dòng)子將E.coliβ-半乳糖苷酶展示在芽孢表面，流式細(xì)胞儀、免疫電鏡和蛋白酶耐受性分析實(shí)驗(yàn)確證了該酶的成功表達(dá)。然而目前僅有上述一篇報(bào)道文獻(xiàn)，說明其潛力仍有待進(jìn)一步探究。

枯草芽孢桿菌被認(rèn)為是芽孢表面展示體系的優(yōu)選宿主，但也有學(xué)者[26]發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)外層蛋白InhA亦可將E.coliβ-半乳糖苷酶成功表達(dá)在芽孢表面，測(cè)得的酶活為0.4 U/mg芽孢(干重)。該研究豐富了β-半乳糖苷酶芽孢表面展示系統(tǒng)，也為其他外源蛋白提供了一條新的展示途徑。

2 β-半乳糖苷酶微生物細(xì)胞表面展示系統(tǒng)的應(yīng)用

β-半乳糖苷酶微生物細(xì)胞表面展示系統(tǒng)的應(yīng)用，主要集中在酶的制造、作為報(bào)告蛋白和全細(xì)胞催化劑。

2.1 生產(chǎn)β-半乳糖苷酶

將β-半乳糖苷酶錨定在微生物細(xì)胞或芽孢表面類似于對(duì)β-半乳糖苷酶進(jìn)行固定化，但這種表面展示策略省去了冗繁的酶提純步驟及傳統(tǒng)的固定化操作，并且表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性，使得工業(yè)化生產(chǎn)β-半乳糖苷酶在不久將來變成可能。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)β-半乳糖苷酶的微生物細(xì)胞表面展示體系進(jìn)行了很多有益探究。例如，SIREC等[18]基于芽孢表層結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和目的酶蛋白特性將A.acidocaldariusβ-半乳糖苷酶吸附固定在野生型和突變型芽孢上，得到的展示酶在酸性介質(zhì)中的熱穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。TAVASSOLi等[24]發(fā)現(xiàn)由CotC直接融合得到的、表面展示有枯草芽孢桿菌β-半乳糖苷酶的重組芽孢經(jīng)-20 ℃冷凍或37 ℃干燥復(fù)蘇后，僅有小部分酶活損失，重復(fù)使用3次后仍可保持80%的活性。

2.2 作為報(bào)告蛋白

β-半乳糖苷酶作為一種相對(duì)分子質(zhì)量大的四聚體蛋白，常作為模式蛋白質(zhì)廣泛用于生化檢測(cè)、科研分析等領(lǐng)域?；讦?半乳糖苷酶而開發(fā)的各類微生物細(xì)胞表面展示系統(tǒng)已在評(píng)估錨定蛋白錨定能力[6-7,9,22]，分析細(xì)胞壁、芽孢壁結(jié)構(gòu)組成[19-20]等方面取得了良好的應(yīng)用效果。

2.3 全細(xì)胞催化劑

據(jù)報(bào)道，來自韓國的PAN課題組是最早開展β-半乳糖苷酶微生物細(xì)胞表面展示的研究團(tuán)隊(duì)，他們做了很多原創(chuàng)性的工作，其中影響力較大則是有關(guān)表面展示β-半乳糖苷酶的重組芽孢在兩相體系中轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)方面的研究[3]。該文報(bào)道了E.coliβ-半乳糖苷酶經(jīng)CotG錨定展示后，得到的重組芽孢酶活力達(dá)5×103U/g(干重)，熱穩(wěn)定性和抗有機(jī)溶劑(如正己烷、乙醚、甲苯)的能力也顯著增加，而且重組芽孢在磷酸緩沖液-乙醚雙相反應(yīng)體系中可催化100 mmol/L乳糖和100 mmol/L正辛醇產(chǎn)生27.7 mmol/L辛烷基-β-D-吡喃半乳糖苷。該研究同時(shí)指出目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量增加的原因與重組芽孢主要分散在水相-有機(jī)相的界面有直接關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，該課題組通過向上述兩相體系中加入1, 2-二甲氧基乙烷作為助溶劑的策略，在相同濃度底物條件下，使得辛烷基-β-D-吡喃半乳糖苷的產(chǎn)量提高到33.7 mmol/L[27]。新近研究[28]顯示，基于“Cohesin-Dockerin”特異性相互作用原理構(gòu)建的β-半乳糖苷酶枯草芽孢桿菌芽孢表面展示體系，通過優(yōu)化纖維小體中黏附模塊-對(duì)接模塊的組成和空間結(jié)構(gòu)，使得表面展示的酶蛋白高達(dá)1.4×103/芽孢，酶的熱穩(wěn)定性、重復(fù)利用性和貯藏穩(wěn)定性也進(jìn)一步提高，其在兩相體系中合成烷基糖苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)35%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。β-半乳糖苷酶在芽孢表面展示后不僅使其可重復(fù)利用性提升，其對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性也大大增強(qiáng)。這些優(yōu)良的特質(zhì)使得β-半乳糖苷酶的芽孢表面展示系統(tǒng)在兩相體系催化領(lǐng)域有著廣闊的發(fā)展空間。

生物酶法合成功能性低聚糖一直是研究的熱點(diǎn)。WANG等[23]以CotX介導(dǎo)的β-半乳糖苷酶芽孢表面展示體系作為全細(xì)胞生物催化劑，能催化200 g/L乳糖和100 g/L果糖合成8.8 g/L乳果糖，可重復(fù)利用測(cè)試結(jié)果顯示該重組芽孢在連續(xù)轉(zhuǎn)化8次后仍保持初始活性的30.3%。LI等[13]利用釀酒酵母展示的P.expansumβ-半乳糖苷酶催化乳糖(100 g/L)合成GOS，其轉(zhuǎn)化率達(dá)43.64%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，重復(fù)使用9次后，GOS產(chǎn)量和殘留的β-半乳糖苷酶活力均保持在較高水平。同時(shí)，該催化體系產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物葡萄糖和半乳糖還可分別用作酵母的碳源和表達(dá)β-半乳糖苷酶基因的誘導(dǎo)劑，因此實(shí)現(xiàn)了真正意義上的生物循環(huán)。在赤蘚糖醇發(fā)酵工業(yè)中，每年都有數(shù)千噸的廢酵母膏因無法處理而帶來環(huán)境問題。AN等[14]以表面展示有米曲霉β-半乳糖苷酶的Y.lipolyticaCGMCC 11369為全細(xì)胞催化劑，在500 g/L乳糖、5 mg/mL細(xì)胞(干重)、pH 5.5、60 ℃條件下，GOS產(chǎn)量達(dá)160 g/L，轉(zhuǎn)化率為51%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，且循環(huán)利用10次后重組酵母細(xì)胞仍能保留初始酶活的80%。這些研究結(jié)果表明β-半乳糖苷酶的微生物表面展示體系作為全細(xì)胞催化劑在資源循環(huán)利用方面有著巨大的潛力。

3 結(jié)語

相比于游離酶與固定化酶，β-半乳糖苷酶的微生物表面展示技術(shù)克服了諸如穩(wěn)定性差、有機(jī)溶劑不耐受、難以回收、純化過程復(fù)雜等問題。綜合上述3大微生物表面展示系統(tǒng)各自的優(yōu)缺點(diǎn)，不難發(fā)現(xiàn)，雖然乳酸菌表面展示系統(tǒng)能利用表層蛋白和一些細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域展示β-半乳糖苷酶，但是原核表達(dá)的缺陷以及較厚的細(xì)胞壁始終限制著β-半乳糖苷酶的體內(nèi)表達(dá)。酵母細(xì)胞由于是真核宿主，擁有促進(jìn)蛋白折疊和正常分泌的生物合成裝置，較之乳酸菌，酵母細(xì)胞表面展示β-半乳糖苷酶有著很大的優(yōu)勢(shì)。但是較差的遺傳穩(wěn)定性和較少的可供選擇的錨定蛋白等因素嚴(yán)重制約著該展示系統(tǒng)的進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用。與前兩者展示系統(tǒng)不同的是，憑借著芽孢自身獨(dú)特的抗逆性與特殊的無細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，β-半乳糖苷酶的芽孢表面展示系統(tǒng)克服了諸如β-半乳糖苷酶表達(dá)折疊不正確、與宿主結(jié)合不夠牢固等缺點(diǎn)，使得其在工業(yè)用酶的生產(chǎn)、作為報(bào)告蛋白和全細(xì)胞催化劑領(lǐng)域有著十分樂觀的應(yīng)用前景。不過目前成功實(shí)現(xiàn)芽孢表面展示的β-半乳糖苷酶酶活較低，影響展示效率的機(jī)制也不明確，深入研究芽孢的結(jié)構(gòu)與衣殼蛋白的組裝機(jī)理，開發(fā)新的錨定蛋白和展示策略將有利于提高β-半乳糖苷酶展示效率。構(gòu)建人工芽孢顆粒也為表面展示技術(shù)在β-半乳糖苷酶領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供了新思路?？梢灶A(yù)見，β-半乳糖苷酶的微生物表面展示系統(tǒng)尤其是芽孢表面展示系統(tǒng)將會(huì)成為未來β-半乳糖苷酶產(chǎn)業(yè)應(yīng)用和發(fā)展的主流。