德爾卑沙門氏菌血清型分子檢測靶點(diǎn)篩選及多重PCR檢測方法的建立

翟立公，楊劍婷，李永泉，王水平，王俊穎

(安徽科技學(xué)院 食品工程學(xué)院，安徽 滁州，233100)

沙門氏菌是一種重要的食源性致病菌，能引起腸胃炎、傷寒和敗血癥等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在美國被沙門氏菌感染人群達(dá)到120萬人次，造成300多人的死亡[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道，沙門氏菌有2 600多個(gè)血清型，其中具有致病性的血清型主要集中在腸炎沙門氏菌種的1 400多個(gè)血清型內(nèi)[2]。根據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌污染具有地域性和血清型的特點(diǎn)，而且由沙門氏菌引起的污染事件大多是由一種或幾種血清型引起的[3-4]。陳玲等[5]對(duì)南方的七大類400份食品中沙門氏菌的污染情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明，檢出率最高的血清型分別是德爾卑沙門氏菌(SalmonellaDerby, SD)和鼠傷寒沙門氏菌。在對(duì)合肥地區(qū)的沙門氏菌污染調(diào)查過程中共檢測出沙門氏菌22株，其中SD占到45.6%[6]。在對(duì)意大利撒丁區(qū)的豬肉產(chǎn)品及屠宰環(huán)境的檢測過程中發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌的檢出率為12.9%，其中主要的優(yōu)勢血清型包括S. Anatum(40%)、S. Derby(18.5%) 和S. Rissen(20%)[7-8]。近年來調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在歐洲地區(qū)SD血清型是生豬和豬肉制品污染的主要血清型[8-9]。經(jīng)研究表明，主要是由于該血清型對(duì)豬的空腸源IPEC-J2細(xì)胞侵染較強(qiáng)所致[10]。雖然SD沒有沙門氏菌其他血清型的感染性強(qiáng)，但對(duì)于免疫力低下的人群包括嬰幼兒或老人等SD感染的感染率較高。

SD血清型的檢測主要利用國標(biāo)GBT 4789.4—2010的傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法，該方法結(jié)果較為準(zhǔn)確，但檢測時(shí)間較長(5 d以上)、操作復(fù)雜(預(yù)增菌、選擇性培養(yǎng)、顯示培養(yǎng)、生化鑒定和血清型鑒定等步驟)、成本高，而且如果凝集反應(yīng)遲緩或特異性差，將造成判斷錯(cuò)誤[2,11]。隨著現(xiàn)代食品工業(yè)的發(fā)展，為了適應(yīng)樣品多、檢驗(yàn)時(shí)間短和檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確等要求，有研究者提出針對(duì)沙門氏菌血清型開發(fā)分子檢測技術(shù)。因此，解決沙門氏菌血清型分子檢測技術(shù)的核心問題是能否篩選到血清型特異性較好的檢測靶點(diǎn)。比較基因組學(xué)(comparative genomics)是在基因水平上尋找生物體之間的差異。隨著不同血清型沙門氏菌全基因組測序的完成，可以利用比較基因組學(xué)方法篩選到目的血清型的特異性基因片段，并以此為檢測靶點(diǎn)建立相應(yīng)的分子檢測方法[3]。DAVID等[12]通過比較基因組學(xué)的方法成功篩選到了豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的血清型特異性基因片段，并以此為模板設(shè)計(jì)引物，建立了能同時(shí)檢測以上2個(gè)血清型的多重PCR檢測體系。

本研究利用生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)方法篩選SD血清型特異性基因，并以此為檢測靶點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，與沙門氏菌屬特異性引物(139-141)建立SD檢測的多重PCR檢測體系，并對(duì)其特異性、靈敏度、抗干擾能力和重現(xiàn)性等方面進(jìn)行評(píng)估，為食品樣品中沙門氏菌血清型的快速檢測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)菌株：39株沙門氏菌(沙門氏菌31血清型)和18株非沙門氏菌；分離株：11株(沙門氏菌5血清型)，菌株具體信息見表2。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、 TaqDNA聚合酶和Marker DS2000，廣州東盛科技有限公司；食品樣品(豬肉、雞肉和牛肉)，市售。

1.2 儀器和設(shè)備

PCR儀，杭州博日科技有限公司；電泳儀，北京六一儀器有限公司；凝膠成像分析儀，上海培清科技有限公司；二級(jí)生物安全柜，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取及濃度測定

將過夜培養(yǎng)后的菌液，根據(jù)EasyPure Genomic DNA Kit說明書操作方法和熱裂解法[13]提取各菌液的基因組DNA，利用核酸濃度測定儀分析提取的基因組DNA的純度和濃度，將質(zhì)量較好的基因組DNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 SD血清型特異性基因的篩選

在NCBI(national center for biotechnology information)的GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取SD(CVM N42507)的基因組序列信息，用于后續(xù)血清型特異性靶點(diǎn)的發(fā)掘。利用BLASTn(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)系統(tǒng)對(duì)該血清型的每個(gè)編碼基因進(jìn)行比對(duì)，按照SD血清型內(nèi)同源性較高，但與其他血清型不具同源性的原則篩選SD血清型分子檢測的準(zhǔn)特異性靶點(diǎn)。

根據(jù)已獲得的準(zhǔn)特異性基因?yàn)槟０澹凑找镌O(shè)計(jì)原則利用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，并通過BLASTn分析引物的特異性，本研究所涉及的引物見表1。以實(shí)驗(yàn)室保存的微生物DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序略)，驗(yàn)證SD血清型檢測引物的特異性，確定SD血清型分子檢測靶點(diǎn)。

表1 候選引物及序列

1.3.3 SD血清型多重PCR檢測體系的建立

將SD血清型特異性引物D1、D3與沙門氏菌屬特異性引物139-141結(jié)合，優(yōu)化反應(yīng)體系。最終確定SD血清型檢測多重PCR的反應(yīng)體系為：10×Taq buffer 2.5 μL、Taq聚合酶0.2 U/μL、MgCl24 mmol/L、dNTP 0.45 mmol/L、引物D1 0.8 mol/L、引物D3 0.6 mol/L、引物139-141 0.4 mol/L、DNA模板1 μL和ddH2O 5.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性8 min；30 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物通過2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，觀察結(jié)果。

1.3.4 SD檢測體系的特異性和靈敏度評(píng)估

提取實(shí)驗(yàn)室保存的微生物基因組DNA為檢測模板，其中SD菌株的基因組為陽性模板，其他微生物基因組DNA為陰性模板，利用SD血清型多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證該檢測體系的特異性。

測定SD血清型基因組DNA濃度，用無菌水10倍梯度稀釋，并將各稀釋度取1 μL作為模板，利用SD血清型多重PCR檢測體系進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證DNA模板靈敏度。

利用平板菌落計(jì)數(shù)法獲得過夜培養(yǎng)的SD菌液的初始濃度，再通過無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，各稀釋度分別取1 mL，提取基因組DNA進(jìn)行PCR檢測體系擴(kuò)增，驗(yàn)證該體系檢測的菌落靈敏度。

1.3.5 SD檢測體系的抗干擾能力評(píng)估

超市購買的豬肉、雞肉和牛肉，經(jīng)過GB 4789.4—2010方法驗(yàn)證無沙門氏菌污染后，冰箱凍存待用。3種樣品各取25 g在緩沖蛋白胨液體培養(yǎng)基中進(jìn)行過夜培養(yǎng)，獲得豬肉背景菌群增菌液、雞肉背景菌群增菌液和牛肉背景菌群增菌液，并通過平板計(jì)數(shù)法得到以上3種增菌液的初始濃度，用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋。同時(shí)，將SD(CMCC50719)進(jìn)行過夜培養(yǎng)，并測定菌液的初始濃度，用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋。將SD菌液和以上3種樣品增菌液分別按照1∶1、1∶102、1∶104、和1∶106菌落濃度比例進(jìn)行混合，提取混合液基因組DNA，PCR擴(kuò)增，以無菌水為空白對(duì)照。

1.3.6 SD檢測體系的人工污染試驗(yàn)

將超市購買的豬肉、雞肉和牛肉樣品，進(jìn)行巴氏殺菌，每類樣品各取6份(每份25 g)，分別用1 mL不同濃度的SD菌液進(jìn)行污染，置于LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃增菌培養(yǎng)，增菌6 h后每隔2 h取1 mL增菌液，熱裂解法提取基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR檢測。

將超市購買的豬肉、雞肉和牛肉樣品，進(jìn)行巴氏殺菌，每份樣品25 g，分別用1 mL不同濃度的SD菌液進(jìn)行污染，每份樣品分別利用沙門氏菌傳統(tǒng)檢測方法(GB 4789.4—2010)和PCR體系進(jìn)行檢測，比較2種方法的檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 SD血清型特異性基因篩選

本研究利用BLASTn系統(tǒng)對(duì)SD基因組的每個(gè)基因的同源性進(jìn)行分析，獲得13個(gè)SD血清型準(zhǔn)特異性基因，并以此為模板分別設(shè)計(jì)引物，以實(shí)驗(yàn)室保存的多株SD菌基因組為陽性模板，其他非SD菌株基因組為陰性模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，其中4對(duì)引物陽性無條帶(結(jié)果未展示)，另外8對(duì)引物中的5對(duì)(D1、D2、D3、D11和D12)表現(xiàn)出良好的特異性，只在SD菌液中有擴(kuò)增條帶，在其他非SD血清型中無擴(kuò)增條帶，以上5對(duì)引物為SD血清型檢測的特異性引物，其模板為SD菌的血清型特異性檢測靶基因。剩余3對(duì)引物在非SD血清型的沙門氏菌也獲得擴(kuò)增條帶，結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)菌株及引物特異性驗(yàn)證結(jié)果

續(xù)表2

菌株來源數(shù)量PCR結(jié)果RU61_00441RU61_00445RU61_00447RU61_RS23380RU61_00448RU61_RS09205RU61_RS06985RU61_RS06990invAS. BonnCICC216771---++--++S. CholeraesuisATCC133121---++--++S. ThompsonCICC214801---++--++S. PotsdamCICC215001---++--++S. BraenderupATCC198121---++--++S. BonariensisCICC214961---++--++S. KentuckyCICC214881---++--++S. BazenheidCICC215871---++--++S. ThphiCMCC500711---++--++S. EnteritidisCICC215271---++---+S. EnteritidisCICC214821---++---+S. EnteritidisCVCC33741---++---+S. EnteritidisCMCC500411---++---+S. EnteritidisCMCC500711---++---+S. Enteritidis?2---++---+S. DublinCICC214971---++---+S. DublinCMCC507611---++---+S. BovismorbificansCICC214991---++---+S. AgonaCICC215861---++---+S. MiamiCICC215091---++---+S. EastbourneCICC215081---++---+S. AnatumCICC214981---++---+S. MleagridisCICC215111---++---+S. London?1---++---+S. SenftenbergCICC215021---++---+S. AberdeenCICC214921---++---+S. BlockleyCICC214891---++---+S. AdelaideCICC215051--------+S. WandswerthCICC215041--------+Escherichia coliATCC351501---------Escherichia coliATCC438891---------Enterococcus.faecalisATCC129531---------Enterococcus.faecalisATCC292121---------Enterococcus.aviumATCC140251---------Klebsiella pneumoniaeATCC138841---------Staphyloccocus aureus ATCC292131---------Staphyloccocus aureus ATCC259231---------Serratia marcescens CICC101871---------Bacillus pumilusCMCC632021---------Bacillus cereus?21---------Pseudomonas fluorescens?21---------Listeria grayiCICC216701---------Listeria seeligeriCICC216711---------Listeria welshimeriCICC216721---------Listeria monocytogenesCICC216621---------Listeria ivanoviiCICC216631---------Listeria innocuaCICC104171---------

注：+: 陽性結(jié)果;-: 陰性結(jié)果; *:本實(shí)驗(yàn)室保存菌株

2.2 多重PCR檢測體系特異性評(píng)價(jià)

如表2所示，當(dāng)樣品中含有SD菌時(shí)，多重PCR能同時(shí)擴(kuò)增171、284和512 bp(D1、139-141和D3引物)，當(dāng)樣品中含有非SD血清型沙門氏菌時(shí)，只能擴(kuò)增出284 bp；當(dāng)樣品中無沙門氏菌時(shí)，無擴(kuò)增條帶產(chǎn)生。此結(jié)果表明，該多重PCR反應(yīng)體系對(duì)SD血清型檢測具有較好的特異性。

2.3 多重PCR檢測體系靈敏度評(píng)價(jià)

測定SD菌基因組DNA質(zhì)量濃度為9.580 2 ng/μL，經(jīng)無菌水按一定比例梯度稀釋后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如圖1所示，當(dāng)模板質(zhì)量濃度為383.2 pg/μL時(shí)，3對(duì)引物均能獲得正確的擴(kuò)增條帶，表明該反應(yīng)體系的模板靈敏度為383.2 pg/μL。

M：DL2000； 1～7：9.580 2 ng/μL, 1.916 ng/μL,383.2 pg/μL, 76.642 pg/μL, 15.328 pg/μL, 3.066 pg/μL和613.13 fg/μL圖1 多重PCR檢測體系(DNA)靈敏度

Fig.1 Sensitivity of multiple PCR for detection of DNA

將SD菌液的菌落濃度從5.2×104CFU/mL稀釋到5.2 CFU/mL，各稀釋度菌液取1 mL轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，PCR檢測。圖2結(jié)果表明，當(dāng)菌落濃度為52 CFU/mL時(shí)，能同時(shí)獲得3條清晰的擴(kuò)增條帶，表明此時(shí)菌落濃度為該檢測特性的菌落靈敏度。

M-DL2000;1-6:ddH2O (對(duì)照)；5.2×104；5.2×103；5.2×102；52；5.2 CFU/mL圖2 多重PCR檢測體系(DNA)靈敏度

Fig.2 Sensitivity of multiple PCR for detection of Salmonella spp. and S. Derby

2.4 多重PCR檢測體系抗干擾能力評(píng)價(jià)

將SD菌液和3類樣品的背景菌群(不含沙門氏菌)，分別按照1∶1、1∶102、1∶104、和1∶106的菌落濃度進(jìn)行混勻，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。如圖3所示，當(dāng)與3種背景菌群菌落濃度比例為1∶104時(shí)，多重PCR均能獲得3條清晰的擴(kuò)增條帶，表明在104倍的自然雜菌干擾情況下，仍能獲得陽性檢測結(jié)果，說明該反應(yīng)體系對(duì)環(huán)境的自然背景菌群有較好的抗性。

A～C: SD與豬肉背景菌群、雞肉背景菌群和牛肉背景菌群混合1～5: SD與自然背景菌群混合的濃度比:ddH2O(對(duì)照),1∶1, 1∶102, 1∶104, 1∶106圖3 自然背景菌群存在對(duì)SD檢測的影響

Fig.3 Interference tests of multiplex PCR detection of Salmonella spp. and S. Derby with other food background microflora

2.5 多重PCR檢測體系人工污染評(píng)價(jià)

將不同濃度的SD菌液分別污染豬肉、雞肉和牛肉樣品，經(jīng)37℃培養(yǎng)6、8、10和12 h，多重PCR檢測。圖4結(jié)果表明，當(dāng)增菌培養(yǎng)6 h后，3種樣品的檢測限均為3.8×105CFU/25g；當(dāng)增菌培養(yǎng)8 h后，污染濃度為3.8 CFU/25g的牛肉樣品能獲得3條清晰的PCR擴(kuò)增曲線；當(dāng)增菌培養(yǎng)10 h后，各個(gè)濃度污染的3種樣品的檢出率均為100%。綜上所述，當(dāng)豬肉、雞肉和牛肉樣品增菌10 h，該多重PCR檢測體系的檢測限能達(dá)到3.8 CFU/25g。

Ⅰ-Ⅲ:人工污染豬肉、雞肉和牛肉樣品;a～d:各樣品分別增菌6,8, 10和12 h進(jìn)行mPCR檢測；M: DL2000 marker;1-6: 3.8×105；3.8×104；3.8×103；3.8×102；38；3.8 CFU/25 g圖4 SD人工污染豬肉、雞肉和牛肉樣品的檢測

Fig.4 SD detection results of different enrichment time for artificially contaminated meat samples

2.6 多重PCR檢測體系的準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)

將不同濃度的SD菌液分別污染豬肉(21份)、雞肉(15份)和牛肉(17份)，以上3類再各取3份無SD污染的樣品作為空白對(duì)照，計(jì)算該檢測方法的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度。如表3所示，只有污染6.4 CFU/25g豬肉樣品的檢測過程中出現(xiàn)了一次偏差，其他2種污染樣品的檢測結(jié)果均與傳統(tǒng)培養(yǎng)的檢測結(jié)果一致，表明該檢測方法的準(zhǔn)確度達(dá)到98.5%。

表3 多重PCR檢測方法的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度

注: SEa,靈敏度；SPb,特異性；ACc,準(zhǔn)確度。

3 結(jié)論與討論

沙門氏菌污染具有地域性特點(diǎn)，不同地區(qū)的優(yōu)勢血清型存在著一定差異，因此針對(duì)沙門氏菌血清型的檢測就變得尤為重要[15]。經(jīng)調(diào)查表明，SD血清型主要污染豬肉制品，而且我國是豬肉消費(fèi)大國，因此對(duì)于SD血清型的快速檢測技術(shù)的開發(fā)將變得尤為重要[8,10]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展， SD血清型的基因草圖已經(jīng)被繪制出來[7]。本研究利用比較基因組技術(shù)篩選了SD多個(gè)血清型準(zhǔn)特異性基因，通過PCR驗(yàn)證最終獲得5個(gè)該血清型特異性基因。通過分析，選擇RU61_00441和RU61_00447基因?yàn)樯抽T氏菌德爾卑血清型的檢測靶點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合沙門氏菌檢測靶點(diǎn)(invA)共同構(gòu)建多重PCR檢測體系。

傳統(tǒng)篩選血清型特異性基因多采用O抗原或H抗原合成基因作為檢測靶點(diǎn)，因此需要多輪多重PCR的檢測才能確定檢測結(jié)果[16]。該方法雖然相較于傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法更加快速和便捷，但由于沙門氏菌血清型種類較多，由于某些血清型的親緣關(guān)系較近，會(huì)干擾目標(biāo)血清型的鑒定，容易造成假陽性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。本研究采用比較基因組的方法進(jìn)行沙門氏菌血清型的分子檢測，同時(shí)避免以上的問題，而且通過該方法已經(jīng)篩選到腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和傷寒沙門氏菌的血清型特異性檢測靶點(diǎn)。該檢測體系中選用2個(gè)德爾卑血清型特異性基因作為檢測靶點(diǎn)是為增加檢測的準(zhǔn)確性，避免假陽性或假陰性結(jié)果的干擾。

由于本體系采用多重PCR進(jìn)行檢測造成體系的DNA檢測靈敏度高于之前的報(bào)道[17]。但經(jīng)過增菌培養(yǎng)后，活菌的檢測靈敏度達(dá)到52 CFU/mL，該結(jié)果與WOODS等的報(bào)道結(jié)果相似[12]。在自然環(huán)境下，沙門氏菌不是單獨(dú)存在，生鮮樣品中必然含有大量的背景菌群對(duì)目標(biāo)菌群的檢測具有干擾作用。該研究按照不同比例將豬肉、雞肉、牛肉的背景菌群與SD進(jìn)行混合，利用蒸煮法提取混合DNA進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，當(dāng)背景菌群的濃度高于目標(biāo)菌群104時(shí)，仍能獲得陽性檢測結(jié)果，表明該檢測體系具有良好的抗干擾能力。同時(shí)，本方法采用蒸煮法提取DNA，能有效降低檢測成本，提高檢測效率[18]。通過人工污染實(shí)驗(yàn)表明，該檢測經(jīng)過10 h的增菌培養(yǎng)，在3種食品基質(zhì)條件下檢測限均能達(dá)到3.8 CFU/25g。通過對(duì)53份樣品污染的檢測結(jié)果表明，該檢測體系表現(xiàn)出較好的靈敏性、特異性和有效性。