解脂亞羅酵母對棒曲霉素降解條件的篩選及部分機理研究

胡慧敏，宗元元，王振宇，張國軍，畢陽

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)

棒曲霉素(patulin, Pat)，也稱展青霉素，是由青霉屬、曲霉屬和絲衣霉等真菌產(chǎn)生的毒素[1]。Pat在蘋果、梨、葡萄等多種水果及其制品中普遍存在[2],可導致肺、肝、脾和腎等多種器官和免疫系統(tǒng)的損害，紊亂胃腸功能[3-4]。Pat易溶于水，熱穩(wěn)定性高，在加工中難以去除。因此，有效去除水果及其制品中的Pat是當前水果產(chǎn)業(yè)發(fā)展中亟待解決的問題。生物脫毒是利用酵母菌等微生物去除真菌毒素的有效方法，具有毒副作用小、反應條件溫和及環(huán)境友好的特點[5]。REDDY等[6]采用2株美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima) (MACH1和GS9)有效降解了Pat，其中菌株MACH1可在48 h內(nèi)實現(xiàn)完全降解。RAFFAELLO等[7]發(fā)現(xiàn)，紅冬孢酵母(Rhodosporidiumkratochvilovae) strain LS11可在3 d內(nèi)幾乎完全降解了Pat。此外，奧默畢赤酵母(Pichiaohmeri)[8]和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)[9]也表現(xiàn)出對Pat的良好降解效果。解脂亞羅酵母(Yarrowialipolytica)是廣泛存在于海洋環(huán)境中的酵母菌[10]，也是公認安全的酵母[11]。王峻峻等[12]發(fā)現(xiàn)，Y.lipolytica可在28 ℃條件下，2 d內(nèi)降解84%的赭曲霉毒素A。表明該酵母具有降解真菌毒素的能力。但該酵母是否降解Pat尚未見報道。

本研究以Y.lipolytica為材料，研究不同濃度Pat對酵母生長的影響，以及Y.lipolytica對不同初始濃度Pat的去除效果。對pH值、溫度及酵母初始濃度等脫毒條件進行篩選，并初步探討酵母的解毒機制。

1 材料與方法

1.1 材料

Y.lipolytica凍干粉，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC 1444)。Pat標準品，青島普瑞邦生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱(SPX-30085H-II型)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；超凈工作臺(SW-CJ-2FD型)，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-30KBS型)，上海申安醫(yī)療器械廠；正置萬能顯微鏡(CX21FS1C型)，OLYMPUS公司，日本；臺式高速冷凍離心機(3K 30型)，Sigma公司，德國；超聲波細胞破碎儀(SCIENTZ-IID型)，寧波新芝生物科技股份有限公司；0.22 μm無菌過濾器(SLGP033RS型)，雷布斯公司；高效液相色譜儀(Dionex UltiMate 3000型)，Thermo Scientific公司，美國；色譜柱(ODS反相柱，C18柱, 5 μm, 250 mm×4.6 mm), GL Sciences，日本。

1.3 方法

1.3.1 Pat標準曲線的制作

準確稱取50 mg Pat標準品，溶于1 mL無菌水中，使用0.22 μm微孔濾膜進行過濾,除菌后貯存于-80 ℃，得到質(zhì)量濃度為50 mg/mL的Pat貯備液。配制質(zhì)量濃度分別為10、25、50、100和200 μg/mL的Pat標準溶液，測定不同質(zhì)量濃度Pat標準溶液的色譜峰面積。根據(jù)色譜峰面積與Pat質(zhì)量濃度關(guān)系作出Pat的標準曲線。

1.3.2 酵母菌株的活化

酵母的活化參照張婕等[13]方法，將酵母接種到營養(yǎng)酵母葡萄糖固體培養(yǎng)基(NYDA)斜面上，在28 ℃下活化2～3 d。將活化好的酵母再接種到50 mL NYDB中，于28 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。吸取1 mL菌懸液到50 mL NYDB培養(yǎng)基中，繼續(xù)置于28 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min條件下培養(yǎng)48 h，備用。

1.3.3 不同質(zhì)量濃度Pat對酵母生長的影響

參照DONG等[14]方法并進行修改。在NYDB培養(yǎng)基中加入適量Pat，使得Pat最終質(zhì)量濃度分別為0、50、100和200 μg/mL。再分別接入終濃度為2×105CFU/mL的Y.lipolytica，在28 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min條件下培養(yǎng)，分別于12、24、36和48 h取樣，計數(shù)酵母細胞數(shù)。

1.3.4 Pat濃度對酵母脫毒率的影響

參照CHEN等[15]方法并進行修改。將Y.lipolytica重懸于NYDB培養(yǎng)基中，使得酵母最終濃度為1×109CFU/mL，并加入終濃度為0、50、100和200 μg/mL的Pat。在28 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min搖床中培養(yǎng)，分別于12、24、36和48 h取樣1 mL待測。

1.3.5 不同pH值及溫度對酵母脫毒率的影響

參照ZHU等[16]方法并進行修改。制備pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0的50 mmol/L MES緩沖液，并加入適量酵母細胞和Pat，使得酵母最終濃度為1×109CFU/mL，Pat質(zhì)量濃度為50 μg/mL。置于28 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min搖床中培養(yǎng)。通過上述試驗確定去除Pat的最佳pH值。如上述操作，將樣品置于15、25、28和37 ℃條件下，培養(yǎng)48 h取樣1 mL待測。

1.3.6 酵母初始濃度對酵母脫毒率的影響

將Y.lipolytica重懸于50 mmol/L MES緩沖液(pH值5.0)中，使得酵母終濃度分別為1×108、1×109和1×1010CFU/mL，并加入終濃度為50 μg/mL的Pat，于28 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min條件下培養(yǎng)，48 h取樣1 mL待測。

1.3.7 活體及滅活對酵母脫毒率的影響

參照ZHU等[16]方法并進行修改。將酵母通過熱致死(121 ℃，30 min)處理使菌失活，將滅活酵母和正常酵母細胞分別重懸于含質(zhì)量濃度50 μg/mL Pat的MES緩沖液(50 mmol/L，pH值5.0)中，使得酵母最終濃度為1×109cells/mL，用含有50 μg/mL Pat的MES緩沖液(pH 5.0)作為對照。在28 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min條件下培養(yǎng)，48 h取樣1 mL待測。從滅活酵母的樣品中吸取50 μL酵母懸浮液，涂布于NYDA平板中，在28 ℃條件下培養(yǎng)3 d，觀察是否有菌落出現(xiàn)，以確保酵母被完全滅活。

1.3.8 酵母的胞內(nèi)物質(zhì)及培養(yǎng)上清液對脫毒率的影響

參照CHEN等[15]方法并進行修改。將活化好的酵母在28 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min下于NYDB中培養(yǎng)48 h。在8 000×g下離心10 min，分離上清液。樣品Ⅰ, 2 mL培養(yǎng)上清液與0.5 mL 250 mmol/L MES緩沖液(pH 5.0)混合，通過0.22 μm濾膜過濾。樣品Ⅱ,將培養(yǎng)好的酵母細胞通過超聲波細胞破碎儀(400 W、工作時間5 s、停頓時間5 s) 30 min，用2 mL 50 mmol/L MES緩沖液(pH 5.0)懸浮，在15 000×g，4 ℃條件下離心30 min,取上清。樣品Ⅰ和樣品Ⅱ中分別加入質(zhì)量濃度50 μg/mL Pat。用含有質(zhì)量濃度50 μg/mL Pat的MES緩沖液(pH 5.0)作為對照。在28 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min搖床中培養(yǎng)48 h，取樣1 mL待測。

1.3.9 響應面試驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，以pH(A)、溫度(B)和酵母初始濃度(C)3個因素為自變量，Pat的脫毒率(Y)為響應值，運用Design-Expert 8.0.5對試驗結(jié)果進行多元回歸分析,因素水平編碼見表1。

表1 響應面試驗因素水平編碼表

1.3.10 模型的驗證

利用響應面模型優(yōu)化的最佳條件進行脫毒試驗，比較模型預測值與實驗值，驗證模型的有效性。

1.3.11 Pat含量的測定

參照ZONG等[17]的HPLC法。將所取待測樣品先用0.22 μm濾膜過濾，然后自動進樣器(Waters 2707)進樣，進樣量10 μL。色譜柱: ODS反相柱(C18柱, 5 μm, 250 mm×4.6 mm, GL Sciences, Japan);流動相：乙腈和水的體積分數(shù)分別為10%和90%，流速1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：276 nm。

1.3.12 Pat脫毒率的計算

脫毒率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：ρ為初始Pat質(zhì)量濃度，μg/mL；ρ0為48 h后樣品中Pat質(zhì)量濃度，μg/mL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

上述所有測定均重復3次。全部數(shù)據(jù)用Excel 2007計算平均值和標準誤，用SPSS 17.0進行Duncan’s多重差異顯著性分析，利用Design-Expert 8.0.5軟件對響應面試驗數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pat的標準曲線

采用HPLC測定不同質(zhì)量濃度Pat的標準曲線，由該曲線得到峰面積與Pat質(zhì)量濃度之間的關(guān)系為：y=1.897 5x-1.804 9，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，即Pat質(zhì)量濃度與HPLC檢測峰面積呈高度線性關(guān)系。

2.2 不同質(zhì)量濃度Pat對Y. lipolytica生長的影響

不同濃度Pat在不同的培養(yǎng)階段對酵母的生長具有一定的抑制，但整體抑制程度不大。培養(yǎng)12和48 h時，3種Pat質(zhì)量濃度均抑制了酵母的生長，其中以200 μg/mL的抑制效果最為明顯，分別低于同期對照13.4%和7.2%。培養(yǎng)24 h時，100 μg/mL和200 μg/mL的Pat對酵母生長表現(xiàn)抑制，培養(yǎng)36 h時，僅有200 μg/mL的Pat對酵母生長表現(xiàn)抑制(P<0.05) (圖1)。

圖1 不同質(zhì)量濃度Pat對Y. lipolytica生長的影響

Fig.1 Effects of patulin at different concentration on the growth of Y. lipolytica注：豎線表示標準誤(±SE)；不同字母代表顯著性差異(P<0.05)，下同。

2.3 Pat起始質(zhì)量濃度對酵母脫毒率的影響

Pat起始質(zhì)量濃度會顯著影響脫毒效果，初始質(zhì)量濃度越高，酵母的脫毒率就越低(圖2)。培養(yǎng)12 h時，Pat初始質(zhì)量濃度為50 μg/mL和200 μg/mL的脫毒率與對照間均無顯著性差異，初始質(zhì)量濃度為100 μg/mL的脫毒率顯著高于對照(P<0.05)；培養(yǎng)24 h時，Pat初始質(zhì)量濃度為50 μg/mL的脫毒率與對照間無顯著性差異，但當初始濃度為100 μg/mL和200 μg/mL時，脫毒率分別顯著高于對照35.2%和14.3%(P<0.05)；當初始質(zhì)量濃度為50 μg/mL和100 μg/mL時，36 h后的脫毒率分別為69.8%和51.5%，48 h后可幾乎實現(xiàn)完全脫毒(圖2-A, 2-B) (P<0.05)。但當Pat初始質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，酵母在36 h和48 h后的脫毒率僅分別為對照的34.1%和57.3% (圖2-C) (P<0.05)。

A-50μg/mL；B-100μg/mL；C-200μg/mL圖2 Pat起始濃度對酵母脫毒率的影響

Fig.2 Effect of patulin at initial concentration on yeast detoxification rate

2.4 pH值、溫度及酵母初始濃度對酵母脫毒率的影響

在pH值2～7，以pH值4.0的脫毒率最高，可達92.4%，其次為pH值5.0(P<0.05),但兩者之間無顯著性差異。偏低或偏高的pH值會顯著降低酵母的脫毒效果。當pH值為2.0和6.0時，酵母的脫毒率分別低于pH值4.0時的19.5%和21.8%(P<0.05)(圖3-A)。適宜的溫度下，酵母會表現(xiàn)出良好的脫毒效果。隨著溫度的升高，酵母的脫毒率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。28 ℃時，酵母的脫毒率最高，可達93.0%，但當溫度為15和37 ℃時，脫毒率僅相當于28 ℃的84.0%和65.1%(P<0.05)(圖3-B)。酵母初始濃度越高，脫毒效果越好。當酵母濃度為1×1010CFU/mL和1×109CFU/mL時，48 h時的脫毒率分別為100%和92.3%。但當酵母濃度降至1×108CFU/mL時，同樣時間的脫毒率僅相當于1×1010CFU/mL的1/3(P<0.05)(圖3-C)。

圖3 pH值(A)、溫度(B)及酵母初始濃度(C)對酵母脫毒率的影響

Fig.3 Effects of pH (A), temperature(B) and initial concentration of yeast(C)on detoxification rate of yeast

2.5 活體及滅活酵母細胞和培養(yǎng)上清液及胞內(nèi)物質(zhì)對酵母脫毒率的影響

酵母活性對酵母的脫毒效果影響很大，活體酵母的脫毒效果更優(yōu)。48 h時，活體及滅活酵母細胞的脫毒效果均顯著高于對照4.9倍和3.1倍，且活體酵母的脫毒率是滅活酵母的1.5倍(P<0.05)(圖4-A)。酵母胞內(nèi)物質(zhì)在酵母脫毒中發(fā)揮了重要作用，48 h時的脫毒率可達70.1%，高于對照組2.5倍(P<0.05)。但酵母培養(yǎng)上清液對酵母的脫毒效果影響不大，48 h時的脫毒率與對照相比，無顯著差異(圖4-B)。

A-活體及滅活酵母;B-酵母培養(yǎng)上清液及胞內(nèi)物質(zhì)圖4 活體及滅活酵母(A)和酵母培養(yǎng)上清液及胞內(nèi)物質(zhì)(B)對酵母脫毒率的影響

Fig.4 Effects of living and dead yeast cells(A) and yeast culture and intracellular extracts(B) on the detoxification rate of yeast

2.6 Box-Behnken響應面試驗結(jié)果

在上述單因素試驗的優(yōu)化的基礎(chǔ)上，選擇pH (A)、溫度(B)和酵母初始濃度(C) 3個因素作為響應變量，采用Design-Expert 8.0.5 軟件，進行Box-Behnken試驗設(shè)計，通過3因素3水平響應曲面分析，得出其17次實驗響應結(jié)果(表2)。

表2 響應面試驗結(jié)果

續(xù)表2

試驗號因素ABC脫毒率/%4-1-1074.83±1.4651-1076.96±1.03600090.16±2.19711068.10±2.898-10-124.62±0.42901-129.06±1.161000089.88±1.581110-132.79±2.451200087.19±1.4513-11065.06±1.6314101100.00±0150-1195.32±0.861601190.45±1.481700083.99±1.61

利用Design-Expert 8.0.5軟件對pH值、溫度和酵母初始濃度設(shè)計3因素3水平的Box-Behnken試驗，方差分析結(jié)果如表3所示，脫毒率(Y)與pH值(A)、溫度(B)和酵母初始濃度(C)的多元二次回歸方程為：

Y=87.58+1.67A-3.01B+33.70C+0.23AB-2.04AC-1.06BC-6.56A2-9.78B2-16.67C2

(1)

注：P≤0.01，差異極顯著；P≤0.05，差異顯著；P>0.05，差異不顯著。

2.7 響應面試驗結(jié)果

如圖5所示，通過方程可知，二次項系數(shù)為負值，其所代表的拋物面開口向下，表明方程具有最大值。利用Design-Expert 8.0.5分析計算，最適脫毒條件為pH值4.56、溫度27.53℃和酵母初始濃度1×109.66CFU/mL，最大脫毒率為100.0%。

2.8 回歸模型的驗證結(jié)果

在上述優(yōu)化的條件下，考慮到實際操作的局限性，脫毒條件的可操作性，將所得條件進行適當修正，設(shè)置pH值4.6、溫度27.5 ℃和酵母初始濃度1×109.7CFU/mL，進行3次脫毒試驗，以對優(yōu)化結(jié)果進行進一步的驗證。驗證實驗中脫毒率平均值為100.0%，與預測值吻合，由此表明優(yōu)化模型可靠。

3 討論

Y.lipolytica是一種非常規(guī)酵母，主要集中于富含脂類和蛋白質(zhì)的環(huán)境中[18]。具有分泌各種蛋白酶、磷脂酶和脂肪酶的能力[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，Y.lipolytica可有效降解Pat，但降解效果受酵母初始濃度、Pat初始濃度、溫度、pH值及酵母活性的顯著影響,活體酵母的脫毒效果更優(yōu)。該結(jié)果與Y.lipolytica降解赭曲霉毒素A的結(jié)果類似[20]。

a-pH和溫度；b-pH和酵母初始濃度；c-溫度和酵母初始濃度圖5 各因素交互作用的響應面與等高線圖

Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of various factors on bacteriocin production

Pat初始濃度越高，酵母的脫毒效果就越低(圖2)，表明Pat對Y.lipolytica具有一定的毒性。該結(jié)果與Candidaguilliermondi[15]和S.cerevisiae[21-22]降解Pat中觀察到的現(xiàn)象基本一致。Pat對酵母的毒性主要表現(xiàn)為破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)和膜蛋白質(zhì)的功能[23]。在細胞水平上，Pat與巰基化合物具有較高的親和性[24-25]。可與酵母質(zhì)膜外表面的游離硫醇結(jié)合，從而破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，損害其滲透性和完整性[26]。Pat一旦進入細胞，可與巰基結(jié)合，消耗胞內(nèi)谷胱甘肽，破壞胞內(nèi)氧化還原平衡[27]，從而誘導活性氧的大量積累和隨后的氧化爆發(fā)，導致應激信號的早期傳遞，并對細胞組分造成氧化損害[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，Y.lipolytica在28 ℃的條件下，對Pat的脫毒效果較好。該結(jié)果與之前報道的Y.lipolytica的生長最適溫度為28 ℃[12]的結(jié)果一致。在此條件下，酵母的個體較大，形態(tài)飽滿，生理狀態(tài)最佳。酵母活力旺盛，細胞壁吸附能力強，因此可以有效的脫除毒素。本研究中發(fā)現(xiàn),酵母濃度越高對Pat的脫毒效果越好,這與KodamaeaohmeriHYJM34[14]降解Pat的結(jié)果類似。酵母濃度越高，細胞壁表面積越大，因此可有效增加酵母細胞壁對Pat的吸附[29]。此外，酵母體內(nèi)的內(nèi)酯酶類(如β-lactamase，β-內(nèi)酰胺酶)在分解Pat的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)中也發(fā)揮了重要作用[30]。

本研究發(fā)現(xiàn)，滅活Y.lipolytica去除Pat的結(jié)果與之前報道的10株滅活酵母菌降解Pat的結(jié)果類似，主要緣自于酵母細胞壁對Pat的吸附[31]?；铙wY.lipolytica去除Pat效果更優(yōu)，說明該酵母既能通過細胞壁物理吸附，又能通過胞內(nèi)酶生物降解Pat。細胞壁物理吸附Pat受到菌體量的限制，容易達到飽和狀態(tài)，而生物降解不受限制，只要生物體有活性，便能持續(xù)發(fā)揮高效的降解作用[16]。細胞壁之所以能吸附Pat可能與細胞壁上的葡聚糖、甘露聚糖和糖蛋白復合物等成分有關(guān)[32]。Pat會與酵母細胞壁上的多糖和蛋白質(zhì)非共價結(jié)合，從而達到吸附的目的[33]。此外，酵母細胞壁上的羧基和酰胺基團也可能參與了與Pat的結(jié)合[34]。本研究所發(fā)現(xiàn)的酵母胞內(nèi)物質(zhì)對Pat具有顯著脫除作用，這與Rhodosporidiumpaludigenum降解Pat的結(jié)果類似[16]，表明酵母的胞內(nèi)物質(zhì)在Pat降解中發(fā)揮了重要作用。Pat先通過酵母細胞壁上的轉(zhuǎn)運蛋白運至酵母體內(nèi)，然后在相關(guān)內(nèi)酯酶的作用下降解為無毒的脫氧棒曲霉酸(desoxypatulinicacid)[35]。此外，磷酸甘露糖變位酶可能也參與了酵母對Pat的降解[36]。由于酵母培養(yǎng)上清液中多為碳源、氮源、生長因子和無機鹽等成分，不具備吸附或降解Pat的功能，因此無法降解Pat[37]。

4 結(jié)論

Y.lipolytica能有效地去除Pat，該酵母對Pat的脫毒效果與溫度、pH值、Pat及酵母初始濃度有關(guān)。不同質(zhì)量濃度Pat在不同的培養(yǎng)階段對酵母的生長具有一定的抑制，但整體抑制程度不大，可能與高濃度Pat破壞酵母細胞膜的結(jié)構(gòu)和膜蛋白質(zhì)的功能有關(guān)。活酵母細胞與死酵母細胞均能有效脫除Pat，且活酵母細胞對Pat的脫毒效果更優(yōu)，說明Y.lipolytica既能通過細胞壁物理吸附Pat，又能通過胞內(nèi)酶生物降解Pat，其中以胞內(nèi)酶生物降解的作用最為明顯。