山莓葉揮發(fā)油提取優(yōu)化及GC特征圖譜比較

1.湖南省懷化市產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，湖南 懷化 418000； 2.中南林業(yè)科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410000

山莓(RubusCorchorifoliusL.f)是薔薇科懸鉤子屬落葉灌木，山莓根、莖、葉、果實均可入藥[1]。根性味微苦、辛、平，具有活血化瘀、祛風(fēng)除濕、解毒斂瘡的功效，主治痢疾、遺精、濕疹、毒蛇咬傷、閉經(jīng)痛經(jīng)、風(fēng)濕腰痛、小兒疳積等癥[2]，果實性味微甘、酸、濕，可生食、制果醬及釀酒，未成熟果實常用于替代覆盆子入藥做引，具有化痰止渴、澀精益腎、助陽明目之功效，主治腎虛、遺精、醉酒、丹毒等癥[3-4]。葉性微苦，具有解毒、消腫、斂瘡、清熱利咽等作用，主治咽喉腫痛、多發(fā)性膿腫、乳腺炎等癥[5]。目前山莓葉及其揮發(fā)油的化學(xué)成分和生物活性研究雖已見報道[6-8]，由于生態(tài)環(huán)境的多樣性，意味著二次代謝產(chǎn)物的多樣性，為了更好地利用山莓資源，研究采用水蒸餾提取、同時蒸餾萃取、微波輔助萃取等方法提取山莓葉揮發(fā)油，并對微波輔助萃取條件進行優(yōu)化，對GC測定不同采收期山莓葉揮發(fā)油，試圖尋找山莓葉揮發(fā)油的特征峰，為開發(fā)和評價山莓葉提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料 山莓葉采自湖南張家界市永定區(qū)三角坪，經(jīng)吉首大學(xué)城鄉(xiāng)資源與規(guī)劃學(xué)院廖博儒研究院鑒定為薔薇科懸鉤子屬植物山莓(R.corchorifoius L)的葉，每月中旬采集，陰干，粉碎，低溫保存。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器 蒸餾萃取裝置，RE-5298旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，UV-2600紫外分光光度計，萬分之一天平，安捷倫GC7890氣相色譜儀，CW-2000超聲微波協(xié)同萃取裝置，電爐，真空干燥箱。

1.3 方法

1.3.1 提取方法的選擇 水蒸氣蒸餾：取山莓葉粉100.00 g于1000 mL燒瓶中，加入去離子水800 mL，冷凝回流5 h，收集蒸出液，用NaCl飽和，乙醚萃取，無水Na2SO4脫水，乙醚萃取液于37℃真空濃縮，即得淺黃色山莓葉揮發(fā)油。

蒸餾萃?。喝∩捷~粉100.00 g于1000 mL燒瓶中，加入去離子水800 mL，取200 mL乙醚于燒瓶中，同時蒸餾萃取5 h，收集乙醚萃取液，用無水硫酸鈉脫水，乙醚萃取液于37℃真空濃縮，即得黃色山莓葉揮發(fā)油。

微波輔助提?。喝∩捷~粉100.00 g于1000 mL蒸餾燒瓶(微波專用)，加入去離子水800 mL，裝上水蒸氣蒸餾裝置，微波功率100 w，冷凝回流3 h，收集蒸出液, 乙醚萃取，無水Na2SO4脫水，乙醚萃取液于37℃真空濃縮，得到黃色山莓葉揮發(fā)油。

1.3.2 單因素實驗 取山莓葉粉100.00 g于1000 mL燒瓶(微波專用)，去離子水800 mL，裝上蒸氣蒸餾裝置，分別依次考察固液比1∶ 6、1∶ 8、1∶ 10、1∶ 12，微波功率60、80、100、120 w，微波時間0.5、1、2、3 h。收集蒸出液，乙醚萃取，無水Na2SO4脫水，乙醚萃取液于37℃真空濃縮，即得山莓葉揮發(fā)油。以得率為指標，考察上述因素的影響。

1.3.3 正交試驗 利用L9(34)設(shè)計，考察固液比、微波功率、微波時間對得率的影響，優(yōu)化提取條件，因素水平見表1。

表1 揮發(fā)油提取影響因素及水平

1.3.4 GC色譜條件 石英毛細管柱BP×5(25 m×0.22 mm×0.25 μm)；高純氮氣，進樣量0.5 μL。程序升溫：初始溫度： 40℃，保持3 min，以5.0℃/min速率升至200℃，保持10 min，不分流進樣，進樣器230℃，檢測器250℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的選擇 由表2可以看出，微波提取得率0.278%，比同時水蒸氣蒸餾和蒸餾萃取得率高。

表2 不同方法提取得率

2.2 單因素的影響 從圖1可知，隨著微波提取時間的增長，山莓揮發(fā)油得率增加。2 h 以后，提取時間增長，得率增長平緩，考慮到能耗，選擇微波時間2 h為宜。從圖2可見，液料比1∶ 6時，山莓葉揮發(fā)油得率低。隨著液料比的增大，得率平緩增大，本實驗可以選擇料液比1∶ 8。從圖3可看出，隨著微波功率逐漸增大，山莓液揮發(fā)油得率增加。這是由于微波功率越大，使分子熱運動動能增大，得率相應(yīng)增加，但微波功率增加，極易造成爆沸現(xiàn)象，本實驗將微波功率控制在120 w以下。

2.3 正交試驗 由表3可知，影響山莓葉揮發(fā)油提取的因素順序為：微波時間﹥微波功率﹥固液比，最佳提取條件為A2B3C3，這與上述實驗不一致，為此，以A2B3C3進行驗證實驗，得率為0.2705%，與極差分析一致。表4方差分析可知，微波時間、微波功率、固液比對提取影響顯著。其中，微波時間對得率影響最顯著，微波功率次之。結(jié)果表明微波輔助最優(yōu)條件為料液比1∶ 10、微波功率120 w、微波時間2 h。

表3 山莓葉揮發(fā)油提取正交實驗數(shù)據(jù)L9(34)

表4 揮發(fā)油提取方差分析

2.4 不同采收期山莓葉微波輔助蒸餾提取 按2.3正交實驗優(yōu)化微波輔助條件，取100.00 g不同采收期山莓葉粉于1000 mL燒瓶(微波專用)，去離子水800 mL，裝上水蒸氣蒸餾裝置，微波功率120 w，冷凝回流2 h，收集蒸餾液，乙醚萃取，無水Na2SO4脫水，乙醚萃取液于37℃真空濃縮，即分別得到不同采收期山莓葉揮發(fā)油。由表5可知，不同采收期的山莓葉，其揮發(fā)油得率隨采收時間變化，其中6～7月?lián)]發(fā)油得率在0.45%以上，3～4月?lián)]發(fā)油得率低于0.26%

表5 微波輔助提取不同采收期山莓揮發(fā)油得率

2.5 不同采收期山莓葉揮發(fā)油GC特征圖譜 按1.3.4項下GC色譜條件，檢測從3月到10月不同采收期山莓葉的揮發(fā)油，記錄25 min色譜圖，見圖4。不同采收期山莓葉揮發(fā)油GC圖譜進行比較，確定八個共有峰，均在22 min內(nèi)出現(xiàn), 各個共有峰的相對保留時間一致，各個共有峰的相對峰面積變化趨勢基本一致，共有峰百分比均大于81%。不同采收期山莓葉揮發(fā)油化學(xué)成分種類和數(shù)量有明顯相似度，這與采集地、提取方法相同有關(guān)，提示了同一生長地域共有峰相對穩(wěn)定。結(jié)果見表6-8。

表6 山莓葉揮發(fā)油GC特征圖譜共有峰保留時間 (t)

表7 山莓葉揮發(fā)油GC特征圖譜共有峰相對峰面積

表8 揮發(fā)油GC特征圖譜共有峰及非共有峰的百分比

3 討論

山莓葉揮發(fā)油具有消炎殺菌作用[8]，本研究主要考察揮發(fā)油得率，其中微波輔助提取得率為0.278%。優(yōu)化提取條件：微波功率120w、料液比1：10、微波時間2h，山莓葉揮發(fā)油得率隨著采收期不同變化，氣溫高時揮發(fā)油得率高， 6月、7月?lián)]發(fā)油得率達到0.45%。

植物揮發(fā)油的化學(xué)成分復(fù)雜，同時受到氣候環(huán)境、地理環(huán)境、不同采收期等等多種因素的影響，本實驗說明同一生長地山莓葉揮發(fā)油的化學(xué)成分相對穩(wěn)定穩(wěn)定。該法操作簡便，根據(jù)GC出峰的次序及出峰特征，獲得不同采收期山莓葉揮發(fā)油的特征圖譜，以期為綜合評價山莓葉揮發(fā)油提供依據(jù)。