紫草素對荷肝癌裸小鼠移植瘤生長的抑制作用及機制

武向麗

作者單位：邯鄲市中心醫(yī)院藥學(xué)部，河北 邯鄲 056001

肝癌是全球及我國發(fā)病率和致死率均較高的惡性腫瘤之一，于我國致死率居惡性腫瘤第二位。紫草素是我國傳統(tǒng)中藥品種紫草的活性成分之一，具有增強免疫力、抑制炎癥反應(yīng)等多方面藥理學(xué)作用［1-2］，已見文獻報道紫草素對乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、白血病、宮頸癌、喉癌等部位腫瘤生長都具有一定的抑制作用［3-7］，但紫草素是否對肝癌生長具有抑制作用的文獻報道尚不多見，本研究將對這一問題進行研究分析。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和實驗細胞本研究時間為2016年4—8月，選取4～6周齡Balb/C品系裸小鼠，雄性、體質(zhì)量范圍為18～22 g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司［SCXK（滬）2017-0005］提供；所有實驗操作均符合一般動物倫理學(xué)要求。人肝癌HepG2細胞株由河北醫(yī)科大學(xué)細胞生物研究室惠贈。

1.2 藥物與試劑紫草素（中國藥品生物制品檢定所，批號110769-201603，純度≥98%）；注射用順鉑［齊魯制藥（海南）有限公司，10 mg/支，批號1602016］；HE、TUNEL試劑盒購自南京建成生物研究所（批號分別為20141123、20140918）；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）、bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì)（Bax、bcl-2）抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號201501006、201410013、201405009）。

1.3 荷肝癌裸小鼠模型的制備、分組與給藥參照謝丹等［8］報道的方法制備荷肝癌裸小鼠模型人肝癌HepG2細胞株經(jīng)解凍復(fù)蘇后植入DMEM高糖培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞并調(diào)整其濃度為2×107個/mL，于右后腿外側(cè)皮下注射0.5 mL濃度為2×107個/mL的細胞溶液，以一周后右后腿外側(cè)皮下出現(xiàn)＞0.3 cm2移植瘤為模型復(fù)制成功。取模型裸小鼠設(shè)模型組，紫草素低、中、高劑量組和順鉑組，每組12只，分別隔天一次給予0.9%氯化鈉溶液，紫草素0.5 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg和順鉑2 mg/kg，共給藥6次。

1.4 觀察動物生存狀態(tài)和抑制率組織生長狀態(tài)觀察各組裸小鼠食欲、精神狀態(tài)等；觀察各組裸小鼠抑制率瘤體大小、活動度、硬度等指標(biāo)。

1.5 瘤量和抑瘤率頸椎脫臼處死動物后剝?nèi)∧[瘤組織并稱重，抑瘤率（%）＝（模型組瘤重－治療組瘤重）/模型組瘤重×100%。

1.6 腫瘤組織形態(tài)檢查和細胞凋亡狀況觀察稱重后瘤體經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定72 h后進行石蠟包埋、切片、展片、水化等處理后，①行HE染色后封片，倒置光學(xué)顯微鏡觀察腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)；②依照TUNEL試劑盒操作步驟進行處理，倒置光學(xué)顯微鏡觀察細胞凋亡狀況（細胞核黃染為細胞凋亡指征），凋亡指數(shù)（Apoptosis Index，AI）（%）＝（凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)）×100%。

1.7 凋亡相關(guān)蛋白表達取1.6步驟水化處理后切片，采用IHC法檢測凋亡相關(guān)蛋白［半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）、bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì)（Bax、bcl-2）］表達；蛋白表達量通過半定量分析計算：每張切片隨機選取互不重疊的5個視野，通過圖像分析軟件計算每個視野光密度值（OD），以O(shè)D值代表蛋白表達密度，并進一步計算Bax/bcl-2表達比值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法運用SPSS 13.0進行數(shù)理統(tǒng)計分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組裸小鼠生存狀態(tài)及腫瘤特征觀察結(jié)果模型組裸小鼠精神萎靡、食欲不振，移植瘤呈質(zhì)硬、活動性強、與胸壁不粘連等特征。紫草素低、中、高劑量組和順鉑組裸小鼠食欲和精神狀態(tài)較模型組均明顯改善，瘤體積小、活動度低、硬度低，紫草素干預(yù)作用具有一定劑量依賴性。

2.2 各組裸小鼠移植瘤瘤體質(zhì)量和抑瘤率與模型組比較發(fā)現(xiàn)經(jīng)紫草素中、高劑量組和順鉑治療能夠顯著降低荷肝癌裸小鼠移植瘤質(zhì)量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），經(jīng)紫草素低、中、高劑量組或順鉑治療能夠顯著提高抑瘤率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；紫草素高劑量組和順鉑組比較瘤重、抑瘤率，均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 紫草素對荷肝癌裸小鼠移植瘤瘤體質(zhì)量和抑瘤率的影響/±s

表1 紫草素對荷肝癌裸小鼠移植瘤瘤體質(zhì)量和抑瘤率的影響/±s

注：與模型組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

組別模型組紫草素低劑量組紫草素中劑量組紫草素高劑量組順鉑組F值P值鼠數(shù)12 12 12 12 12瘤體質(zhì)量/g 1.69±0.14 1.32±0.21 1.18±0.17a 0.83±0.12b 0.76±0.11b 72.509 0.000抑瘤率/%0.00±0.00 21.89±3.75b 30.18±4.92b 50.89±6.43b 55.03±8.17b 194.686 0.000

2.3 各組裸小鼠腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)結(jié)果如圖1所示：與模型組比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)紫草素低、中、高劑量組或順鉑干預(yù)治療后，肝癌移植瘤組織呈現(xiàn)片狀壞死病變，移植瘤組織細胞數(shù)量減少、間隙增大，上述作用呈一定劑量依賴性。

2.4 各組裸小鼠腫瘤組織細胞凋亡狀況結(jié)果如圖2所示：與模型組比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)紫草素各劑量或順鉑干預(yù)治療后荷肝癌裸小鼠移植瘤組織凋亡細胞數(shù)量明顯增多，以紫草素高劑量組效果最為顯著。凋亡指數(shù)（AI）計算結(jié)果：與模型組比較，紫草素低、中、高劑量組和順鉑組AI均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；紫草素高劑量組和順鉑組比較，紫草素高劑量組AI顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 紫草素對荷肝癌裸小鼠腫瘤組織細胞AI的影響

2.5 各組裸小鼠移植瘤caspase-3蛋白表達較模型組，經(jīng)紫草素低、中、高劑量組或順鉑組治療后荷肝癌裸小鼠移植瘤組織中caspase-3蛋白表達顯著上調(diào)，以紫草素2 mg/kg組效果最為顯著；見圖3。半定量分析結(jié)果：較模型組，紫草素低、中、高劑量組和順鉑組移植瘤組織caspase-3蛋白表達OD值顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。紫草素高劑量組和順鉑組比較caspase-3蛋白表達OD值，紫草素高劑量組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

2.6 各組裸小鼠移植瘤組織Bax、bcl-2蛋白表達及Bax/bcl-2表達比值與模型組比較，紫草素低、中、高劑量組和順鉑組移植瘤組織Bax蛋白表達不同程度上調(diào)、bcl-2表達不同程度下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中以紫草素高劑量組上述效果最為顯著；見圖4、圖5。半定量分析結(jié)果：較模型組，紫草素低、中、高劑量組和順鉑組裸小鼠移植瘤Bax表達OD值明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），紫草素中、高劑量組和順鉑組bcl-2表達OD值顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），紫草素低、中、高劑量組和順鉑組Bax/bcl-2表達比值顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；紫草素高劑量組和順鉑組比較，紫草素高劑量組Bax/bcl-2表達比值顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），Bax、bcl-2蛋白表達OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組裸小鼠移植瘤組織中caspase-3、Bax、bcl-2表達OD值及Bax/bcl-2表達比值/±s

表3 各組裸小鼠移植瘤組織中caspase-3、Bax、bcl-2表達OD值及Bax/bcl-2表達比值/±s

注：與模型組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與順鉑組比較，cP＜0.05

組別模型組紫草素低劑量組紫草素中劑量組紫草素高劑量組順鉑組F值P值鼠數(shù)12 12 12 12 12 caspase-3（OD）0.05±0.02 0.16±0.05a 0.21±0.04b 0.27±0.06bc 0.15±0.04a 37.423 0.000 Bax（OD）0.29±0.05 0.54±0.10b 0.63±0.15b 0.81±0.21b 0.74±0.14b 23.766 0.000 bcl-2（OD）0.50±0.07 0.46±0.11 0.37±0.05a 0.30±0.05b 0.39±0.07a 11.979 0.001 Bax/bcl-2 0.59±0.20 1.17±0.25a 1.70±0.39b 2.71±0.68bc 1.89±0.43b 41.591 0.000

3 討論

肝癌是一種轉(zhuǎn)移能力和侵襲其它器官組織能力都比較強的癌種之一［9-10］，并且因為肝癌發(fā)病較為隱匿，多數(shù)病人確診時已錯過手術(shù)機會［11］，5年復(fù)發(fā)率達60%，因此延緩肝癌腫瘤生長、延長病人生存期是臨床上迫切需要解決的醫(yī)學(xué)難題。

紫草素是一種萘醌類化合物，近年來研究發(fā)現(xiàn)紫草素具有抑制多部位腫瘤生長的作用，能夠通過促進內(nèi)源性活性氧合成而抑制人宮頸癌Hela細胞增殖［5］、通過調(diào)節(jié)細胞周期時相而抑制喉癌細胞增殖［6］、促進人乳腺癌MCF-7細胞自噬［3］、促進抑制白血病HL-60細胞凋亡并抑制增殖［7］。本實驗結(jié)果顯示，紫草素能夠明顯改善荷肝癌裸小鼠食欲和精神狀態(tài)、減慢移植瘤生長、降低瘤體硬度、降低瘤體活動度，誘導(dǎo)移植瘤組織片狀壞死、促進腫瘤細胞凋亡，說明紫草素具有抑制荷肝癌裸小鼠移植瘤生長的作用。

細胞凋亡是細胞的一種自助程序性死亡模式，caspase-3、Bax、bcl-2三種蛋白在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。其中caspase-3蛋白為凋亡刺激因子，為細胞凋亡的“激活器”，Bax能夠改變線粒體膜通透性、促進細胞色素C釋放而誘導(dǎo)細胞凋亡［12］，bcl-2能夠通過抑制caspase-3活性、保護線粒體膜而抑制細胞凋亡［13-15］。此外，Bax蛋白和bcl-2蛋白能夠形成同源二聚體而相互抑制二者活性，因此Bax/bcl-2蛋白表達比值能夠反應(yīng)二者對細胞凋亡的真實調(diào)節(jié)作用［16］。本實驗結(jié)果顯示，紫草素能夠上調(diào)移植瘤組織caspase-3、Bax蛋白表達并下調(diào)bcl-2蛋白表達，提高Bax/bcl-2表達比值。

綜上所述，紫草素具有抑制肝癌裸小鼠移植瘤生長的作用，紫草素調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達而促進腫瘤細胞凋亡可能是該作用重要的分子機制。

（本文圖1～5見插圖5-1）

圖1 紫草素對荷肝癌裸小鼠腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變的影響（HE×200倍）：A-模型組；B-紫草素0.5 mg/kg組；C-紫草素1 mg/kg組；D-紫草素2 mg/kg組；E-順鉑2 mg/kg組

圖2 各組裸小鼠腫瘤組織細胞凋亡狀況（TUNEL×200倍）：A-模型組；B-紫草素0.5 mg/kg組；C-紫草素1 mg/kg組；D-紫草素2 mg/kg組；E-順鉑2 mg/kg組

圖3 各組裸小鼠移植瘤組織caspase-3蛋白表達（IHC×200倍）：A-模型組；B-紫草素0.5 mg/kg組；C-紫草素1 mg/kg組；D-紫草素2 mg/kg組；E-順鉑2 mg/kg組

圖4 各組裸小鼠移植瘤組織Bax蛋白表達（IHC×200倍）：A-模型組；B-紫草素0.5 mg/kg組；C-紫草素1 mg/kg組；D-紫草素2 mg/kg組；E-順鉑2 mg/kg組

圖5 各組裸小鼠移植瘤組織bcl-2蛋白表達（IHC×200倍）：A-模型組；B-紫草素0.5 mg/kg組；C-紫草素1 mg/kg組；D-紫草素2 mg/kg組；E-順鉑2 mg/kg組