劉 洋,李運(yùn)奎,2,3,*,韓富亮,2,3,*,王婉妮,劉 亮
(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院,陜西 楊凌 712100;2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心,陜西 楊凌 712100;3.西北農(nóng)林科技大學(xué)合陽(yáng)葡萄試驗(yàn)示范站,陜西 合陽(yáng) 715300)
氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)又稱尿烷、烏來(lái)糖、烏來(lái)坦、烏拉坦,分子式為C3H7NO2,是煙草葉及香煙的天然成分,也是發(fā)酵食品(如面包、乳酪、酸奶等)和酒精飲料(如葡萄酒、日本清酒和中國(guó)黃酒等)在發(fā)酵或貯存過(guò)程中天然的伴隨產(chǎn)物[1-2]。
EC具有口服毒性,同時(shí)具有多位點(diǎn)致癌性,可導(dǎo)致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌等疾病[3]。1993年,我國(guó)曾建立了檢測(cè)出口酒中EC的標(biāo)準(zhǔn)方法[4],但目前并未對(duì)國(guó)內(nèi)葡萄酒中EC含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)限定。對(duì)國(guó)內(nèi)外葡萄酒中EC含量的檢測(cè)結(jié)果表明,有30.6%的葡萄酒超出聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織20 μg/L的標(biāo)準(zhǔn),這給消費(fèi)者健康及葡萄酒行業(yè)的持續(xù)發(fā)展帶來(lái)了潛在的威脅。當(dāng)前對(duì)于EC的研究大都集中在中國(guó)黃酒[5-8],而針對(duì)葡萄酒的研究相對(duì)較少[9-11]。本文參考發(fā)酵飲品和食品的相關(guān)研究,分析總結(jié)EC危害、國(guó)際限量標(biāo)準(zhǔn)、葡萄酒中含量變化、形成機(jī)制、影響因素及控制方法,以期為提高我國(guó)葡萄酒安全性提供科學(xué)依據(jù)和參考。
EC具有口服毒性、多位點(diǎn)致癌性、免疫功能抑制作用和心率抑制作用[12-14]。在生物體內(nèi)EC主要有3 條代謝途徑:一是水解作用,包括N的羥基化、C的羥基化以及支鏈的氧化,EC主要被肝臟中的微粒酯酶水解形成乙醇、氨和二氧化碳[15],對(duì)于嚙齒類動(dòng)物,大約5%的EC隨尿液和糞便排泄出體外,超過(guò)90%的EC被水解;二是側(cè)鏈氧化作用,約0.5%的EC被細(xì)胞色素P450氧化為乙烯基-氨基甲酸酯,隨后形成環(huán)氧乙烯基甲酸甲酯,這種環(huán)氧化物在體內(nèi)可與DNA形成加聚物,造成DNA雙鏈結(jié)構(gòu)損傷,從而導(dǎo)致細(xì)胞癌變[16];三是比較普遍的羥基化作用,約0.1%的EC被細(xì)胞色素P450氧化為N-羥基-EC,同時(shí)生成過(guò)氧化氮,前者能夠?qū)е翪u2+調(diào)控的DNA堿基突變,造成氧化損傷[17]。其中,第二、三條代謝途徑具有致癌作用。
E C的急性口服毒性低,當(dāng)單次劑量達(dá)到1 000 mg/kgmb時(shí)可麻醉嚙齒類動(dòng)物,長(zhǎng)期攝入EC會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量和存活率下降及腫瘤的發(fā)生[18]。人們食用的EC質(zhì)量濃度超過(guò)30 μg/L后,患癌幾率增加[19]。在正常飲食習(xí)慣下(不含發(fā)酵酒精飲料),EC的日攝入量為10~20 ng/kgmb,如果葡萄酒中的EC含量超標(biāo),長(zhǎng)期超量飲用葡萄酒(500 mL/d)會(huì)使癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加5 倍[20]。目前EC的致癌性在小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、猴子中已經(jīng)被證實(shí)[21],一定劑量的EC可以增加嚙齒類動(dòng)物肺、肝、副淚腺、心臟(雌雄)、乳腺、卵巢、皮膚和前胃(雄性)的患癌幾率;其中肺部最易受到感染[14,22],雌雄小鼠每日攝入300 μg/kgmbEC,肺泡和支氣管腫瘤發(fā)病率為10%[1]。按照2.5×105μg/kgmb的EC劑量飼喂豬43 d,其微核網(wǎng)織紅細(xì)胞發(fā)生率增加3.3 倍[23]。用100 mmol/L EC處理人肝癌細(xì)胞,EC以時(shí)間依賴性的方式影響細(xì)胞代謝和轉(zhuǎn)錄,主要通過(guò)脂肪酸氧化(可能也是精胺分解途徑)和醛累積(由于解毒能力降低)而引起氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡,從而導(dǎo)致能量消耗、能量降低、膜完整性破壞、DNA和蛋白質(zhì)損傷[24]。此外,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,EC能顯著抑制抗體反應(yīng),降低胸腺質(zhì)量。因此,EC對(duì)正常小鼠免疫功能也具有一定的抑制作用[13]。
EC對(duì)蟾蜍在體心臟心率影響的研究表明,EC可能影響了心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成,進(jìn)而影響心肌細(xì)胞跨膜離子通透性,使竇房結(jié)P細(xì)胞的自動(dòng)去極化速率減慢,延長(zhǎng)到達(dá)閾值的時(shí)間,導(dǎo)致心率減緩[12]。
Barron等[25]的研究表明,葡萄酒能夠有效地抑制人肺癌細(xì)胞的增殖與存活,主要表現(xiàn)為抑制蘇氨酸蛋白激酶(protein kinase B,Akt)信號(hào)通路和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)的存活途徑,誘導(dǎo)抗腫瘤物質(zhì)p53的生成。與白葡萄酒相比,紅葡萄酒顯示出更強(qiáng)的抗腫瘤活性。另有實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)小鼠同時(shí)攝入含有相同EC含量的葡萄酒與水時(shí),攝入葡萄酒小鼠的突變率下降,這表明葡萄酒中的其他成分可以拮抗EC的影響[26]。
EC普遍存在于多種傳統(tǒng)發(fā)酵食品(如饅頭、腐乳、果酒、果醋、發(fā)酵茶等)中[27],人體攝入EC絕大部分是通過(guò)飲用酒精飲料,其中,葡萄酒是重要來(lái)源之一。2002年聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織確定EC為重點(diǎn)監(jiān)控物質(zhì),并制定了國(guó)際標(biāo)準(zhǔn),規(guī)定葡萄酒中其質(zhì)量濃度不得超過(guò)20 μg/L。2007年,世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥機(jī)構(gòu)將EC由2B類致癌物(或可能令人患癌的物質(zhì))正式歸為2A類致癌物(可能令人患癌的物質(zhì)),并限制了其使用范圍[1]。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織下的食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)規(guī)定,EC基準(zhǔn)劑量可信下限值為每天300 μg/kgmb,食物中EC的平均攝入量約為每天15×10-3μg/kgmb[15],對(duì)于酒精飲料的EC建議日均攝入量不超過(guò)8×10-2μg/kgmb[28]。目前,歐盟沒(méi)有統(tǒng)一的EC最高限量標(biāo)準(zhǔn)[1],世界上不同國(guó)家和組織對(duì)酒精飲料中EC的質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)也存在差異(表1)。
表1 不同國(guó)家和組織對(duì)酒精飲料中EC質(zhì)量濃度的限定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Maximum residue limits for ethyl carbamate in alcoholic beverages
分析我國(guó)市場(chǎng)上2 2 6 種葡萄酒樣品中E C的質(zhì)量濃度,結(jié)果表明,E C質(zhì)量濃度范圍在1.16~46.00 μg/L[34-36],其中符合20 μg/L聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織標(biāo)準(zhǔn)的葡萄酒占69.4%,符合美國(guó)EC限量15 μg/L的葡萄酒僅占28.8%[36-37],且干紅葡萄酒EC平均質(zhì)量濃度(14.03 μg/L)>干白葡萄酒(9.22 μg/L)>起泡葡萄酒(6.12 μg/L)[36]。
新釀造的葡萄酒中EC質(zhì)量濃度一般在1~10 μg/L。在‘丹魄’紅葡萄酒中使用16 種微生物進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的自然蘋果酸-乳酸發(fā)酵后,樣品中EC最低質(zhì)量濃度從0.85 μg/L升高至0.93 μg/L,最高質(zhì)量濃度從4.23 μg/L升高至4.70 μg/L,平均質(zhì)量濃度從2.03 μg/L上升至2.21 μg/L,上升了8.65%,但是方差分析結(jié)果表明差異不顯著[38]。隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng),其含量有增加趨勢(shì)。將葡萄酒樣品放置在75 ℃的恒溫烘箱48 h來(lái)加速EC形成,由此產(chǎn)生的濃度稱為EC潛在濃度。實(shí)驗(yàn)證明,此濃度與葡萄酒在30 ℃條件下貯存兩年后的EC濃度一致,且在酒精度為10%的模擬酒中,蘋果酸-乳酸發(fā)酵后酒中的瓜氨酸濃度與EC潛在濃度呈線性相關(guān)[39-40]。因此,在裝瓶或陳釀前監(jiān)測(cè)EC潛在濃度,可以估計(jì)陳釀后葡萄酒中EC的含量。
通過(guò)外加反應(yīng)底物(瓜氨酸、尿素)的方法,研究葡萄酒中EC的變化發(fā)現(xiàn),貯存期間葡萄酒中EC含量呈現(xiàn)先快速增加(約前30 d),隨后緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)[41]。在18 ℃下貯存一年,紅葡萄酒中EC質(zhì)量濃度從2 μg/L上升到4.5 μg/L,白葡萄酒中EC質(zhì)量濃度從檢測(cè)下限上升到4.2 μg/L;在23 ℃下貯存一年,紅葡萄酒中EC質(zhì)量濃度從2 μg/L上升到6.5 μg/L,白葡萄酒中EC質(zhì)量濃度從檢測(cè)下限上升到6.2 μg/L[42]。
葡萄酒釀造過(guò)程中,EC的形成有5 條途徑,即尿素、瓜氨酸、氨甲酰磷酸、氰化物、3a,6a-二甲基甘脲(3a,6a-dimethylglycoluril,DMGU)與乙醇反應(yīng)形成EC[20,43]。尿素和瓜氨酸與乙醇的反應(yīng)是EC的主要形成途徑[20,39,44]。在這兩條主要的形成途徑中,因?yàn)槟蛩貪舛瘸8哂诠习彼釢舛?,且瓜氨酸的醇解反?yīng)速率較低,EC主要來(lái)源于尿素形成途徑[10]。
在葡萄酒中,EC前體物質(zhì)的來(lái)源有多種途徑。葡萄生長(zhǎng)過(guò)程中,施用氮肥使果實(shí)中尿素含量增加;發(fā)酵過(guò)程中,酵母菌通過(guò)尿素循環(huán)途徑,代謝底物中過(guò)量的精氨酸產(chǎn)生尿素[45-46],并釋放到發(fā)酵液中,使酒中尿素含量升高[47]。瓜氨酸主要來(lái)自釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的尿素循環(huán)途徑和乳酸菌中的精氨酸脫亞氨基酶代謝途徑[48-49]。釀造過(guò)程中,酵母降解精氨酸生成尿素和鳥氨酸,鳥氨酸在鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶的作用下,生成瓜氨酸[45];蘋果酸乳酸發(fā)酵過(guò)程中,乳酸菌代謝精氨酸也會(huì)分泌瓜氨酸[47]。酵母和乳酸菌代謝精氨酸代謝產(chǎn)生的瓜氨酸部分與乙醇直接反應(yīng)生成EC,部分在鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶的作用下生成氨甲酰磷酸和鳥氨酸,氨甲酰磷酸與乙醇進(jìn)一步生成EC(圖1)[45]。葡萄酒中EC前體物質(zhì)氰化物有兩種來(lái)源,一是葡萄籽中的氰苷水解形成氰化物,由銅離子催化,氧化形成氰酸鹽,氰酸鹽與乙醇反應(yīng)生成EC(圖1)[20,50];二是在白蘭地的蒸餾過(guò)程中,高溫使部分尿素分解成氰酸,氰酸與乙醇反應(yīng)生成EC(圖1)。雙乙酰和尿素反應(yīng)生成DMGU,DMGU與乙醇反應(yīng)生成EC(圖1)[45]。
圖1 EC前體物質(zhì)與乙醇的反應(yīng)Fig. 1 Reaction routes of EC precursors with ethanol
影響葡萄酒中EC含量的因素是原料狀況和工藝,原料狀況的影響包括:生態(tài)條件(溫度、降水、極端氣候)[51]、葡萄品種[10,37,52]、葡萄成熟度[9]及產(chǎn)區(qū)[10];工藝的影響包括發(fā)酵條件和陳釀條件,其中發(fā)酵條件包括:酒種[36,38]、pH值[14,53-57]、EC前體物質(zhì)濃度[46,58]和乙醇體積分?jǐn)?shù)[53-54]等。
實(shí)驗(yàn)表明,采用技術(shù)成熟前(19 °Brix)、理想成熟度(21 °Brix)及過(guò)熟(23 °Brix)的葡萄分別浸漬10 d,葡萄酒中EC質(zhì)量濃度分別為23.6、66、96 μg/L[9],由此可見(jiàn),葡萄成熟度與葡萄酒中EC質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。
發(fā)酵過(guò)程中,發(fā)酵溫度、浸漬時(shí)間、葡萄汁營(yíng)養(yǎng)劑添加、酵母種類、乳酸菌種類及EC前體物質(zhì)濃度是影響葡萄酒中EC含量的重要因素。發(fā)酵溫度可以影響EC的形成速度,發(fā)酵后期升溫會(huì)加快EC的形成[43]。實(shí)驗(yàn)表明,浸漬時(shí)間通過(guò)影響EC前體物質(zhì)的濃度影響EC含量,使用理想成熟度(21 °Brix)的葡萄浸漬10 d EC質(zhì)量濃度為66 μg/L,繼續(xù)浸漬至20 d以上時(shí)EC質(zhì)量濃度為76.3 μg/L,浸漬30 d EC質(zhì)量濃度可達(dá)89 μg/L[9]。
尿素、瓜氨酸、精氨酸作為EC重要的前體物質(zhì),在葡萄汁中的含量影響著發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒中EC的含量[19]。研究表明,葡萄汁中尿素、瓜氨酸、精氨酸含量與EC生成量均呈線性關(guān)系[59-60]。在葡萄汁發(fā)酵前分別添加尿素、瓜氨酸,二者含量在發(fā)酵過(guò)程中均呈下降趨勢(shì),但EC含量不斷增加,尿素的減少主要發(fā)生在酒精發(fā)酵過(guò)程中,且尿素代謝調(diào)控方式與參與的調(diào)節(jié)劑有關(guān)[58],而瓜氨酸的減少主要發(fā)生在蘋果酸-乳酸發(fā)酵過(guò)程中。葡萄酒生產(chǎn)過(guò)程中,精氨酸含量先上升后下降,EC含量呈明顯上升趨勢(shì)。精氨酸含量上升可能是由于酵母自溶,含量下降可能是由于乳酸菌代謝精氨酸產(chǎn)生瓜氨酸,使EC含量上升。
因酵母生長(zhǎng)繁殖的需要,發(fā)酵時(shí)加入氮源(如磷酸氫二銨)能明顯加快發(fā)酵速率,防止發(fā)酵“阻滯”[59,61]。但添加過(guò)量的磷酸氫二銨會(huì)導(dǎo)致尿素的形成,尿素是EC重要的前體物質(zhì),并且部分酵母菌株對(duì)磷酸氫二銨的加入時(shí)間敏感,這也會(huì)影響EC的生成量[10,45]。釀酒酵母代謝精氨酸以及分泌尿素具有菌株特異性,car1基因通過(guò)編碼精氨酸酶影響發(fā)酵液中精氨酸的含量[10,62],調(diào)控精氨酸脫亞胺途徑arc基因的表達(dá)量也可以影響精氨酸的代謝率[54,63]。葡萄汁中的精氨酸可在酵母菌內(nèi)代謝產(chǎn)生過(guò)量的尿素,從而導(dǎo)致葡萄酒中尿素含量升高[47]。蘋果酸-乳酸發(fā)酵階段,乳酸菌通過(guò)精氨酸脫亞氨途徑代謝產(chǎn)生瓜氨酸,瓜氨酸是EC另一重要前體物質(zhì),不同種類的乳酸菌代謝精氨酸能力不同,生成EC前體物質(zhì)的濃度不同,導(dǎo)致EC的產(chǎn)量有較明顯差異,實(shí)驗(yàn)表明短乳桿菌較戊糖片球菌能夠積累更多氨基酸,產(chǎn)生更多EC[41,54,64]。
研究發(fā)現(xiàn),剛釀造的新酒中,僅僅滿足高尿素含量時(shí),EC并不能大量產(chǎn)生[53,65]。貯存條件會(huì)影響葡萄酒中EC的最終濃度,如貯藏溫度、通氧量及是否帶酒腳陳釀[66-67]。貯存期間,隨著溫度的升高,葡萄酒中EC含量增加[15],貯存30 d后,30 ℃下的葡萄酒樣品中EC含量約為15 ℃時(shí)的1.5~2.0 倍[11]。如果葡萄酒在陳釀期間處于通風(fēng)狀態(tài),尿素則大部分被降解,積累減少,導(dǎo)致EC含量較少。帶酒腳陳釀過(guò)程中,由于酵母自溶,EC的前體物質(zhì)含氮化合物、氨基酸會(huì)逐漸釋放到酒中,EC含量也因此有所增加[10,55,68]。但有報(bào)道稱,氨基酸含量低的葡萄所釀造葡萄酒即使延長(zhǎng)與酒腳接觸時(shí)間,也沒(méi)有其他EC前體物釋放[59]。
目前,EC的抑制途徑大致分為4 類:選用優(yōu)良菌株、改良發(fā)酵原料、優(yōu)化發(fā)酵和陳釀條件以及外源添加酸性脲酶。酸性脲酶可以催化尿素分解形成氨和二氧化碳,尿素是EC重要的前體物質(zhì),因此一定條件下,向發(fā)酵完全的酒中添加酸性脲酶,尿素的分解能降低葡萄酒中的總酚和EC其他前體物質(zhì)的濃度,從而達(dá)到控制EC含量的目的[39]。該方法不改變釀酒的酵母菌株及工藝條件,能夠在保證原酒風(fēng)味特征的前提下,有效降低葡萄酒中的EC含量,同時(shí)操作簡(jiǎn)便有效,具有良好的應(yīng)用前景。自1999年起,歐洲已獲準(zhǔn)從發(fā)酵乳酸菌中提取的酸性脲酶在葡萄酒中應(yīng)用[39]。但目前,我國(guó)的脲酶生產(chǎn)尚未產(chǎn)業(yè)化,主要依靠進(jìn)口,這增加了生產(chǎn)成本及工藝復(fù)雜性[69]。而且由于脲酶是一類以鎳作為輔基的金屬酶,鎳殘留會(huì)嚴(yán)重影響葡萄酒安全性[70]。除此之外,通過(guò)添加尿素吸附材料、EC降解酶、EC吸附劑等途徑去除酒中EC的研究越來(lái)越多,但目前此類研究都集中在黃酒[5-6,8]。
選育產(chǎn)尿素能力及精氨酸酶活力低的酵母菌株進(jìn)行發(fā)酵,可以有效降低葡萄酒中的EC含量。此方法主要通過(guò)兩條途徑實(shí)現(xiàn):一是增強(qiáng)參與尿素降解及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)酶的編碼基因;二是沉默或敲除精氨酸酶編碼基因[54,62-63]。有研究表明,工業(yè)釀酒酵母經(jīng)轉(zhuǎn)基因后可以將‘霞多麗’葡萄酒中EC的產(chǎn)量降低近90%[71]。
對(duì)發(fā)酵原料的優(yōu)化主要體現(xiàn)在調(diào)整葡萄園管理措施上。葡萄的施肥、修剪、灌溉及地面覆蓋等對(duì)葡萄汁中精氨酸濃度有很大影響[72]。因此,合理調(diào)整葡萄園管理措施,對(duì)葡萄原料進(jìn)行優(yōu)化,能夠在一定程度上控制葡萄酒中EC的含量[46],目前鮮見(jiàn)具體改良方法的研究。
葡萄酒的發(fā)酵和陳釀條件在一定程度上影響了EC的形成。發(fā)酵及貯存的溫度越高,EC的生成量就越多[59],當(dāng)EC質(zhì)量濃度不超過(guò)15 μg/L時(shí),低溫貯藏可限制EC質(zhì)量濃度的增加[11];pH值不同,EC的濃度差異不大[19],但EC的形成由酸催化,因此,低pH值下EC形成速度稍快[11];缺乏對(duì)蘋果酸-乳酸發(fā)酵過(guò)程的控制,會(huì)導(dǎo)致EC的形成[64];陳釀方式的不同,也會(huì)影響EC的生成,微氧且避免帶酒腳陳釀的方式能夠一定程度上降低其濃度。因此,合理的控制發(fā)酵、貯藏溫度、pH值、陳釀方式等能夠有效控制葡萄酒中EC的含量。由于釀造條件的改變可能會(huì)導(dǎo)致葡萄酒品質(zhì)、風(fēng)味、穩(wěn)定性等方面的變化,采用此法時(shí)需綜合考慮葡萄酒質(zhì)量,盡可能地減少葡萄酒中EC的含量[46]。
消費(fèi)者對(duì)于食品安全及健康越來(lái)越關(guān)注,EC作為一種廣泛存在于發(fā)酵食品中的潛在有害物質(zhì),在我國(guó)還沒(méi)有相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)。葡萄酒作為三大最受歡迎的酒精飲料(葡萄酒、啤酒、黃酒)之一[73],在我國(guó)市場(chǎng)上仍有部分產(chǎn)品的EC含量超出聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織標(biāo)準(zhǔn),這對(duì)消費(fèi)者的健康造成了潛在威脅。葡萄酒中EC的主要形成途徑是尿素及瓜氨酸與乙醇的反應(yīng);影響EC含量的因素有原料狀況和工藝;控制消除手段主要包括選用優(yōu)良菌株、改良發(fā)酵原料、優(yōu)化發(fā)酵和陳釀條件,以及外源添加酸性脲酶,具體優(yōu)化條件仍需進(jìn)一步研究。加強(qiáng)對(duì)葡萄酒中EC的研究,制定我國(guó)葡萄酒中EC的限量標(biāo)準(zhǔn),通過(guò)技術(shù)手段控制EC含量,為消費(fèi)者提供安全健康的葡萄酒產(chǎn)品,對(duì)規(guī)范葡萄酒行業(yè)生產(chǎn)秩序、保護(hù)我國(guó)葡萄酒消費(fèi)者的健康及促進(jìn)葡萄酒行業(yè)的持續(xù)發(fā)展意義重大。